ES2653589T3 - Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un interferón-beta-1a o una proteína de fusión que comprende dicho interferón-beta-1a,donde el interferón-beta-1a consiste en la secuencia de aminoácidos **Fórmula** y donde dicho interferón-beta-la está acoplado a un único polímero de origen no natural en el extremo N-terminal de dicho interferón-beta-la, comprendiendo dicho polímero un dextrano, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, o alcohol polivinílico.

Description

Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos
5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El uso de polipéptidos y proteínas para el tratamiento sistémico de enfermedades específicas está bien aceptado actualmente en la práctica médica. El papel que desempeñan estas sustancias en la terapia es tan importante que muchas actividades investigadoras se están dirigiendo hacia la síntesis de grandes cantidades mediante técnicas de
10 ADN recombinante. Muchos de estos polipéptidos son moléculas endógenas que son muy potentes y específicas al desencadenar sus acciones biológicas.
Un factor importante que limita la utilidad de estas sustancias proteicas para su aplicación deseada es que, cuando se administran de forma parenteral, se eliminan del cuerpo en un corto periodo de tiempo. Esto puede ocurrir como
15 resultado del metabolismo d e pr oteasas o p or el a claramiento, q ue u sa r utas f ormales par a l a e liminación de proteínas tales como la filtración en los riñones. Las vías de administración oral de estas sustancias son incluso más problemáticas, porque, además de la proteólisis en el estómago, la elevada acidez del estómago las destruye antes de que alcancen su tejido de destino. Los problemas asociados con estas vías de administración de proteínas se conocen bien en la industria farmacéutica, y se están usando diversas estrategias en intentos para resolverlas.
20 Se han publicado muchos trabajos que se ocupan de la estabilización de proteínas. Se conocen diversas formas de conjugar proteínas con materiales poliméricos, que incluyen el uso de dextranos, polivinilpirrolidonas, glucopéptidos, polietilenglicol y pol iaminoácidos. Se ha i nformado que l os polipéptidos c onjugados resultantes m antienen sus actividades biológicas y la solubilidad en agua para aplicaciones parenterales.
25 Una familia de péptidos que ha sido el centro de mucho trabajo clínico y esfuerzos para mejorar su administración y bioasimilación son los interferones. Los interferones se han ensayado en una diversidad de patologías clínicas. El uso de interferón beta humano, un miembro de esa familia, es el mejor establecido en el tratamiento de esclerosis múltiple. Recientemente se ha autorizado la comercialización de dos formas de interferón beta recombinante en
30 Europa y Estados Unidos para el tratamiento de esta enfermedad. Una forma es interferón-beta-1a (denominado comercialmente y vendido como AVONEX®, fabricante. Biogen, Inc., Cambridge, MA) y en lo sucesivo en el presente documento, quot;interferón-beta-1aquot; o quot;IFN-beta-1aquot; o quot;IFN-β-1aquot; o quot;interferón-β-1aquot;, usados de forma intercambiable. La otra forma es interferón-beta-1b (denominado comercialmente y vendido como BETASERON®. Berlex, Richmond, CA), en lo sucesivo en el presente documento, quot; interferón-beta-1bquot;. Interferón-beta-1a se produce en las células
35 mamíferas usando la secuencia del gen humano natural y está glicosilado, mientras interferón-beta-1b se produce en bacterias E. coliusando una secuencia modificada del gen humano que contiene una sustitución de cisteína a serina introducida mediante ingeniería genética en la posición del aminoácido 17 y no está glicosilado.
Previamente, se han comparado directamente las potencias in vitrorelativas de interferón-beta-1a e interferón beta
40 1b en ensayos funcionales y se ha demostrado que la actividad específica de interferón-beta-1a es aproximadamente 10 v eces mayor que l a actividad específica de interferón-beta-1b (Runkel y col., 1998, Pharm. Res. 15: 641 -649). A p artir de es tudios d iseñados par a identificar l a base es tructural de es tas d iferencias d e actividad, s e ha i dentificado la g licosilación c omo l a ú nica de l as d iferencias e structurales c onocidas entre l os productos que afecta a la actividad específica. El efecto del hidrato de carbono se manifiesta en gran medida por
45 medio de s u pa pel estabilizante d e l a es tructura. E l ef ecto es tabilizante de l hi drato de c arbono fue evidente e n experimentos de desnaturalización térmica y análisis SEC. La falta de glicosilación también se correlacionó con un aumento en la agregación y una sensibilidad aumentada a la desnaturalización térmica. La eliminación enzimática del hidrato de carbono de interferón-beta-1a con PNGasa F provocó la precipitación considerable del producto desglicosilado.
50 Estos estudios indican que, a pesar de la conservación de secuencias entre interferón-beta-1a e interferón-beta-1b, son entidades bioquímicas distintas, y por lo tanto gran parte de lo que se sabe sobre interferón-beta-1b no se puede aplicar a interferón-beta-1a, y viceversa.
55 El documento WO 87/00056desvela conjugados entre un homopolímero de polietilenglicol o un poliol polioxietilado, y un i nterferón-beta ( véase el r esumen; página 1 3, l íneas 15-35). E n e ste documento n o s e pr evé l a c ombinación específica de un interferón-beta 1a, su acoplamiento con el polímero anteriormente mencionado en el extremo Nterminal y por medio de una unión obtenible mediante una alquilación reductora.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN:
Se han aprovechado las ventajas del interferón-beta glicosilado respecto de las formas sin glicosilar. En particular, se ha desarrollado una composición de interferón-beta-1a con actividad aumentada respecto de interferón-beta-1b, y que también t iene las pr opiedades c onvenientes d e las pr oteínas peg iladas e n general s in pérdida ef icaz de 5 actividad comparado con las formas de interferón-beta-1a que no e stán c onjugadas. Por l o tanto, s i se h acen modificaciones de tal forma que los productos (conjugados de polímero-interferón-beta 1a) mantienen todas o casi todas s us actividades b iológicas, pueden darse como resultado las siguientes propiedades: farmacocinética y farmacodinámica a lteradas q ue l levan a un a s emivida a umentada y a al teraciones en l a d istribución t isular ( por ejemplo, capacidad para permanecer en la vasculatura durante períodos de tiempo más largos), estabilidad 10 aumentada en solución, inmunogenicidad reducida, protección de la digestión proteolítica y de la supresión posterior de l a a ctividad. T al f ormulación e s un av ance s ustancial en l as t écnicas f armacéutica y m édica, y har ía un a contribución significativa al tratamiento de diversas enfermedades en las que el interferón tiene cierta utilidad, tales como esclerosis múltiple, fibrosis, y otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes, cánceres, hepatitis y otras enfermedades víricas. En particular, la capacidad para permanecer durante períodos de tiempo más largos en la
15 vasculatura permite que se use interferón-beta-1a para inhibir la angiogénesis y potencialmente atravesar la barrera hematoencefálica. Además, la estabilidad térmica adquirida creando conjugados de polímero-interferón-beta-1a es una ventaja cuando se formula interferón-beta-1a en forma de polvo para su uso en la administración posterior por medio de inhalación.
20 Se us ó e l conocimiento de l a e structura c ristalográfica d e interferón-beta-1a y s e des arrolló u n c onjugado d e interferón-beta-1a-polímero en el que el polímero está unido a el/los sitio(s) de interferón-beta-1a que permitirá(n) que el conjugado mantenga la actividad completa del interferón-beta-1a comparado con el interferón-beta-1a que no está conjugado.
25 Un caso de la divulgación es un complejo de interferón-beta-1a conjugado, donde el interferón-beta-1a está unido de forma covalente a un polímero que incorpora como parte integral suya un polialquilenglicol.
En un caso particular, la presente divulgación se refiere a una composición de interferón-beta-1a fisiológicamente activo que comprende interferón-beta-1a fisiológicamente activo acoplado a un polímero que comprende un resto de
30 polialquilenglicol, d onde el i nterferón-beta-1a y el r esto de pol ialquilenglicol e stán dispuestos de f orma q ue e l interferón-beta-1a fisiológicamente activo de la composición tiene una semivida aumentada respecto del interferónbeta-1a solo (es decir, en una forma sin conjugar desprovista del polímero acoplado al mismo).
Otro c aso de la divulgación es un a composición de i nterferón-beta-1a que c omprende interferón-beta-1a
35 fisiológicamente activo acoplado a un polímero en el que el interferón-beta-1a es una proteína de fusión, preferiblemente una fusión con inmunoglobulina. En tal complejo, la estrecha proximidad del extremo N-terminal (sitio de conjugación c on el polímero) y el ex tremo C -terminal ( sitio de f usión c on el r esto I g) s ugiere que la conjugación del polímero puede reducir la inmunogenicidad de la proteína de fusión.
40 En ot ro c aso d e l a d ivulgación s e r efiere a una composición de i nterferón-beta-1a f isiológicamente a ctivo qu e comprende i nterferón-beta-1a fisiológicamente activo acoplado a un polímero, que comprende un resto de polialquilenglicol, do nde e l i nterferón-beta-1a y el r esto de pol ialquilenglicol e stán dispuestos de f orma q ue e l interferón-beta-1a fisiológicamente activo de la composición tiene una actividad aumentada respecto del interferónbeta-1b solo (es decir, en una forma sin conjugar desprovista del polímero acoplado al mismo).
45 Otro caso de la divulgación es una proteína conjugada de interferón-beta-1a cuyo resto de interferón-beta-1a se ha mutado para proporcionar muteínas con actividad antivírica y/o antiproliferativa aumentada selectivamente respecto de las formas sin mutar de interferón-beta-1a.
50 La divulgación se refiere en un aspecto adicional a un complejo conjugado de interferón-beta-1a estable e hidrosoluble que comprende un interferón-beta-1a fisiológicamente activo acoplado de forma covalente a un resto de polietilenglicol fisiológicamente compatible. En tal complejo, el interferón-beta-1a puede estar acoplado de forma covalente al resto de polietilenglicol fisiológicamente compatible mediante un enlace covalente lábil en un grupo aminoácido libre de l i nterferón-beta-1a, donde e l enl ace c ovalente l ábil s e r ompe i n v ivo m ediante hidrólisis
55 bioquímica y/o proteólisis.
En otro caso, la presente divulgación se refiere a una forma farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un complejo de interferón-beta-1a estable e hidrosoluble que comprende interferónbeta acoplado a un polietilenglicol fisiológicamente compatible.
60 En ot ro caso, las c omposiciones de i nterferón-beta-1a a coplado de f orma c ovalente, t ales c omo l as descritas anteriormente, pueden utilizar interferón-beta-1a destinado a aplicaciones diagnósticas o in vitro, donde el interferónbeta-1a es, por ejemplo, un r eactivo de di agnóstico para un inmunoensayo u otras aplicaciones diagnósticas o in vitro. En tales aplicaciones no terapéuticas, los complejos de l a divulgación se emplean de f orma muy útil como
5 composiciones estabilizadas que se pueden formular, por ejemplo, en disolventes compatibles u otras formulaciones basadas en s oluciones para pr oporcionar formas c ompuestas e stables q ue t ienen r esistencia aumentada a la degradación.
La modificación de i nterferón-beta 1a con un p olímero at óxico pue de of recer c iertas v entajas. S i s e h acen
10 modificaciones de forma que los productos (conjugados de polímero-interferón-beta-1a) mantienen todas o casi todas s us a ctividades bi ológicas, se pue de dar c omo r esultado l as s iguientes pr opiedades: f armacocinética y farmacodinámica alteradas, que conducen a una semivida aumentada y a alteraciones en la distribución tisular (por ejemplo, capacidad para permanecer en la vasculatura durante períodos de tiempo más largos), estabilidad aumentada en solución, inmunogenicidad reducida, protección de la forma modificada de interferón-beta 1a de la
15 digestión proteolítica y de la eliminación posterior de la actividad; estabilidad térmica aumentada que conduce a una formulación más eficaz de interferón-beta-1a en polvo para su uso oral o inhalado.
El interferón-beta-1a dotado de las propiedades mejoradas descritas anteriormente puede ser eficaz como terapia después d e la administración or al, en aer osol o parenteral. O tras v ías de ad ministración, t ales como na sal y
20 transdérmica, pueden ser posibles también usando el interferón-beta-1a modificado.
Otro aspecto de la divulgación es un medicamento que comprende los conjugados reivindicados para el uso en un método para inhibir la angiogénesis y la neovascularización. Como resultado de aumentar el nivel y la duración del interferón en la vasculatura, el producto pegilado de la divulgación debería ser especialmente eficaz como inhibidor
25 de la angiogénesis.
En apl icaciones no t erapéuticas ( por ejemplo, d iagnósticas), t ambién se contempla l a c onjugación de e species diagnósticas y/o reactivas de interferón-beta. El agente conjugado resultante es resistente a factores degradativos ambientales, que incluyen procesos de degradación mediados por disolvente o por solución. Como resultado de tal
30 resistencia aumentada y estabilidad aumentada del interferón-beta-1a, la estabilidad del ingrediente activo es capaz de aumentarse significativamente, con fiabilidad concomitante de la composición que contiene interferón-beta-1a en el uso final específico para el que se emplea la misma.
Basándose en l a d ivulgación c ontenida en el pr esente doc umento, l a pr esente i nvención p roporciona un a
35 composición que comprende un interferón-beta-1a o una proteína de fusión que comprende dicho interferón-beta1a,donde el interferón-beta-1a consiste en la secuencia de aminoácidos
40 ydonde dicho interferón-beta-1a está acoplado a un único polímero de origen no natural en el extremo N-terminal de dicho interferón-beta-1a, comprendiendo dicho polímero un dextrano, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, o alcohol polivinílico.
En un aspecto r elacionado, l a pr esente i nvención pr oporciona un a c omposición que c omprende u n m utante d e
45 interferón-beta-1a o una pr oteína de f usión que comprende d icho mutante de i nterferón-beta-1a,donde di cho mutante de interferón-beta-1a consiste la una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en:
5 donde dicho mutante de interferón-beta-1a está acoplado a un ún ico polímero de origen sintético en el extremo Nterminal de di cho m utante d e interferón-beta-1a, c omprendiendo dicho pol ímero un de xtrano, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, o alcohol polivinílico.
La presente invención y las realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
10 Otros aspectos, características y modificaciones de la invención serán aparentes de forma más completa a partir de la divulgación posterior y de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
15 Figura 1.Unión de mutantes de interferón-beta-1a sustituidos con alanina a una proteína de fusión dimérica que c omprende el d ominio e xtracelular d e la c adena d el r eceptor d e i nterferón d e t ipo I , I FNAR2/Ig (ectodominio de IFNAR2 fusionado con el dominio constante de IgG1 humana).Las afinidades de unión de los mutantes de IFN (A1 -E) sustituidos con alanina por la cadena del receptor IFNAR2 se determinaron como se
20 describe en el Ejemplo 1 (subsección D). El histograma presenta sus afinidades de unión en este ensayo respecto de his-IFN-beta de tipo silvestre (% de t. s.). Los valores de % de t. s. se calcularon como (afinidad de his-IFN-beta de tipo silvestre)/afinidad de IFN-beta mutante x 100. Se muestran el % de t. s. (O) para experimentos individuales (n = 3) y un % de t. s. medio (x) para el grupo experimental. Los mutantes A2, AB1, AB2 y E no se unieron a IFNAR2/Fc a concentraciones 500 veces superiores que CE 50 de his-IFN-beta de t. s. (*).
25 Figura 2.Unión d e mutantes d e i nterferón-beta-1a su stituidos con a lanina a l os complejos d el r eceptor d e superficie celular de interferón de tipo I (quot;complejo IFNAR1/2quot;) expresados en células de linfoma de Daudi Burkitt.Las propiedades de unión a receptor de los mutantes de sustitución con alanina (A1 - E) se determinaron usando un ensayo de unión a receptor de superficie celular basado en FACS como se describe en el Ejemplo 1
30 (subsección D). El histograma presenta sus afinidades de unión a receptor en este ensayo respecto de his-IFN-beta de tipo silvestre (% de t. s.). El % de t.s. para cada mutante se calculó como (afinidad de his-IFN-beta de tipo silvestre)/afinidad d e I FN-beta m utante x 100. S e m uestran l os v alores de % de t . s. ( O) par a ex perimentos individuales y una media de los valores de % de t. s. para el grupo experimental (x).
35 Figura 3. Actividades a ntivirales d e m utantes d e i nterferón-beta-1a su stituidos co n al aninaLas ac tividades antivirales de los mutantes por sustitución con alanina (A1 -E) se determinaron en células A549 humanas expuestas a virus de EMC como se describe en el Ejemplo 1 (subsección E) El histograma presenta sus actividades en este ensayo respecto de his-IFN-beta de tipo silvestre (% de t. s.). El % de t. s. se calculó como (concentración de hisIFN-beta de t. s. [ECP del 50 %]/concentración de IFN-beta mutante [ECP del 50 %] x 100. Se muestra el % de t. s.
40 (○) para múltiples ensayos y la media del grupo de datos experimentales (x).
Figura 4.Actividades antiproliferativas de mutantes de interferón-beta-1a sustituidos con alaninaLa actividad antiproliferativa de los mutantes por sustitución con alanina (A1 -E) se determinó en células de linfoma de Daudi Burkitt como se describe en el Ejemplo 1 (subsección E). El histograma presenta sus actividades en este ensayo respecto de his-IFN-beta de tipo silvestre (% de t. s.). El % de t. s. se calculó como (concentración de his-IFNbeta de
t. s. [50 % de inhibición del crecimiento]/concentración de IFN-beta mutante [50 % de inhibición del crecimiento] x
100. Se muestra el % de t. s. (O) para múltiples ensayos y la media del grupo de datos experimentales (x).
5 Figura 5.Actividades antiviral y antiproliferativa relativas de los mutantes de interferón-beta-1a sustituidos con a lanina.Se compararon l as a ctividades r elativas d e l os m utantes de sustitución con al anina ( A1 -E) en lo s ensayos de actividad antivírica (eje x) y de actividad antiproliferativa (eje y). Se usó el porcentaje medio de his-IFNbeta de tipo silvestre (% de t. s., x) presentado en las Figuras 3 y 4 para esta comparación. Los mutantes que muestran un cambio coordinado en ambas actividades estarían en la línea diagonal. Los mutantes que muestran un
10 cambio en la actividad antivírica que es desproporcionado respecto del cambio en la actividad antiproliferativa se alejan significativamente de la línea diagonal (DE1, D, C1). Se determinó la significación estadística a p artir de la consideración de las desviaciones estándar inherentes en los valores medios de % de t. s. usados.
Figura 6.Localización d el s itio d e p egilación m ediante c artografía d e p éptidos.Se sometió a interferón-β-1a
15 pegilado y sin modificar a análisis de cartografía de péptidos. Las muestras se digirieron con lisil-endopeptidasa y se sometieron a HPLC de fase inversa en una columna C 4.La columna se desarrolló con un gradiente 0 -70 % de acetonitrilo en ácido trifluoroacético del 0, 1 %. El eluido de la columna se monitorizó a 214 nm. Panel a, interferón-β1a sin modificar. Panel b, interferón-β-1a pegilado. Las flechas marcan la posición de elución del péptido de lisilendopeptidasa N-terminal de interferón-β-1a que contiene los residuos de aminoácido 1-19.
20 Figura 7.Actividad antivírica de interferón-beta-1a conjugado y sin conjugarSe analizó la actividad de interferónbeta-1a o i nterferón-beta-1a PEGilado a las concentraciones indicadas en el eje X en e nsayos antivirales usando células de c arcinoma d e p ulmón ( A549) h umanas expuestas a v irus de encefalomiocarditis. D espués de u na incubación d e dos dí as c on virus, las células v iables s e t iñeron con M TT, l as placas se leyeron a 4 50 nm y la
25 absorbancia, que refleja la viabilidad celular, se muestra en el eje Y. Las desviaciones estándar se muestran como barras de error. La c oncentración de interferón-beta-1a o interferón-beta-1a PEGilado que ofrecieron un 50 % de destrucción viral (el quot;efecto citopático del 50 %quot;) (50 % de DO450 máxima) fue de alrededor de 11 pg/ml, y el efecto citopático del 50 % para interferón-beta-1a PEGilado fue de alrededor de 11 pg/ml.
30 Figura 8. Valoración d e l a est abilización d e l os co njugados u sando d esnaturalización t érmicaSe c alentó interferón-beta-1a PEGilado y control de interferón-beta-1a sin tratar en HEPES 29 mM de pH 7,5, NaCl 20 mM a una velocidad fija de 1 grado/minuto. Se siguió la desnaturalización monitorizando los cambios en la absorbancia a 280 nm. (a) interferón-beta-1a sin modificar (b) interferón-beta-1a PEGilado. Figura 9.Medidas de la actividad antivírica de interferón-beta en el plasma de ratones tratados con interferón
35 beta-1a o interferón-beta-1a PEGilado. Se inyectaron de forma iv a los ratones 50.000 unidades de interferón-beta-1a o 50.000 unidades de interferón-beta1a pegilado (que contenía PEG 20K). La sangre de estos ratones se obtiene por medio de extracciones retroorbitales en diversos momentos después de la inyección de interferón, como se indica en el eje X. Hay al menos 3 ratones a los que se les extrajo sangre en cada punto de tiempo, y se prepara el plasma y se congela hasta que se
40 analiza l a a ctividad de interferón-beta de ese m omento e n ens ayos an tivirales usando c élulas de carcinoma d e pulmón (A549) humanas expuestas a virus de encefalomiocarditis. Las células viables se tiñeron con una solución de MTT, las placas se leyeron a 450 nm para determinar la absorbancia que refleja la viabilidad celular y la actividad de i nterferón-beta. S e ge neraron curvas estándar par a c ada p laca u sando i nterferón-beta-1a y s e us aron para determinar la cantidad de actividad de interferón-beta en cada muestra. Se muestran los datos de los animales
45 individuales.
Figura 10.Secuencia d e A DN c ompleta d el g en d e i nterferón b eta marcado con histidina y s u p roducto proteico.Se muestran las secuencias completas de ADN (SEQ ID NO: 1) y de la proteína (SEQ ID NO: 2) de interferón-beta-1a marcado con histidina. La secuencia señal VCAM-1 escindida deja 3 residuos amino-terminales
50 (SerGlyGly) en di rección de l e xtremo N -terminal d e l a s eñal de h istidina ( His6, p osiciones 4 -9). La s ecuencia enlazadora de ent eroquinasa (AspAspAspAspLys) es tá s eparada de l a s eñal de histidina por un es paciador (posiciones 10-12, SerSerGly). La secuencia proteica de IFN-beta-1a natural abarca las posiciones (Met18-Asn183).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Como se u sa e n el presente doc umento, l a expresión quot; acoplado de f orma c ovalentequot; s ignifica que l os r estos especificados es tán unidos de f orma c ovalente di rectamente en tre s í, o si no, e stán unidos d e f orma covalente indirectamente entre sí por medio de un resto o restos intermedios, tales como un resto o r estos que actúan de
60 puente, espaciador o unión.
Interferón: Un quot;interferónquot; (también denominado quot;IFNquot;) es un polipéptido de cadena única pequeño y específico de especie, producido por células mamíferas en respuesta a la exposición a una diversidad de inductores, tales como virus, polipéptidos, y mitógenos. El interferón usado en la invención es un interferón-beta humano glicosilado que está gl icosilado en el residuo 80 ( Asn 80) y que s e ob tiene pr eferiblemente por m edio de t écnicas de A DN 5 recombinante. Este interferón-beta glicosilado preferido se llama quot;interferón-beta-1aquot; o quot;IFN-beta-1aquot; o quot;IFN-β-1aquot; o quot;interferón beta 1aquot; o quot;interferón-β-1aquot;, todos usados de forma intercambiable. El término quot;interferón-beta-1aquot; también pr etende i ncluir m utantes del mismo ( por ej emplo, E jemplo 1) , c on la c ondición de qu e t ales m utantes también estén glicosilados en el residuo 80 (Asn 80). Se conocenmétodos de ADN recombinante para producir proteínas, que incluyen interferones. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos
10 4.399.216,5.149.636,5.179.017 (Axel y col.) y4.470.461 (Kaufman).
Los polinucleótidos de interferón-beta-1a preferidos que se pueden usar en los presentes métodos de la invención se derivan de las secuencias génicas de interferón beta de tipo silvestre de diversos vertebrados, preferiblemente mamíferos, y se obtienen usando métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica, tales como los 15 métodos descritos en las siguientes patentes de Estados Unidos:Patente de Estados Unidos 5.641.656 (expedida el 24 de j unio de 1 997: ADN que c odifica pr oproteína d e i nterferón de t ipo I av iar e i nterferón de t ipo I av iar maduro),patente de Estados Unidos 5.605.688(25 de febrero de 1997 -interferones de tipo I recombinantes de perro y caballo);patente de Estados Unidos 5.231.176(27 de julio de 1993, molécula de ADN que codifica un interferón de leucocitos hu manos);patente de Estados U nidos 5 .071.761(10 de diciembre de 1 991, s ecuencia de A DN qu e 20 codifica subsecuencias de interferones linfoblastoides humanos LyIFN-alfa-2 y LyIFN-alfa-3);patente de Estados Unidos 4.970.161(13 de noviembre de 1990, secuencia de ADN que codifica interferón-gamma humano);patente de Estados Unidos 4.738.931 (19 de abril de 1988, ADN que contiene un gen de interferón beta humano);patente de Estados Unidos 4.695.543 (22 de septiembre de 1987, gen de alfa-interferón Gx-1 humano ypatente de Estados Unidos 4.456.748 (26 de junio de 1984, ADN que codifica sub-secuencias de interferones diferentes y naturales de
25 leucocitos).
Los mutantes de interferón-beta-1a se pueden usar de acuerdo con esta invención. Las mutaciones se desarrollan usando métodos convencionales de mutagénesis dirigida, conocidos para los expertos en la técnica. Además, la divulgación proporciona polinucleótidos de interferón-beta-1a funcionalmente equivalentes que codifican polipéptidos
30 de interferón-beta-1a funcionalmente equivalentes.
Un primer polinucleótido que codifica interferón-beta-1a es quot;funcionalmente equivalentequot; comparado con un segundo polinucleótido que codifica interferón-beta-1a si satisface al menos una de las siguientes condiciones:
35 (a): el quot;equivalente funcionalquot; es un primer polinucleótido que hibrida con el segundo polinucleótido en condiciones de hibridación estándar y/o es degenerado para la primera secuencia polinucleotídica. Mucho más preferiblemente, codifica un interferón mutante que tiene la actividad de un interferón-beta-1a;
(b) el quot;equivalente funcionalquot; es un primer polinucleótido que codifica la expresión de una secuencia de aminoácidos codificada por el segundo polinucleótido.
40 En r esumen, e l t érmino quot;interferónquot; incluye l os age ntes enumerados ant eriormente, as í como s us equ ivalentes funcionales. Como se usa en el presente documento, la expresión quot;equivalente funcionalquot;, por lo tanto, se refiere a una proteína de interferón-beta-1a o a un polinucleótido que codifica la proteína de interferón-beta-1a que tiene el mismo efecto beneficioso o un efecto beneficioso mejorado sobre el receptor mamífero respecto del interferón del
45 que s e juzga qu e es u n eq uivalente f uncional. C omo se apr eciará p or un ex perto e n l a t écnica, un a pr oteína funcionalmente equivalente se puede producir mediante técnicas recombinantes, por ejemplo, expresando un quot;ADN funcionalmente equivalentequot;. Por lo tanto, la presente invención incluye proteínas de interferón-beta-1a codificadas por ADN de origen natural, así como por ADN que no se dan de forma natural, que codifican la misma proteína codificada por el ADN de origen natural. Debido a la degeneración de las secuencias nucleotídicas codificantes, se
50 pueden usar otros polinucleótidos para codificar interferón-beta-1a. Estos incluyen todas las secuencias anteriores o partes de éstas, que se alteran por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio sinónimo. Tales secuencias alteradas se consideran como equivalentes de estas secuencias. Por ejemplo, Phe (F) se codifica mediante dos codones, TTC o TTT, Tyr (Y) se codifica mediante TAC o TAT e His (H) se codifica mediante CAC o CAT. Por otra parte, Trp (W) se codifica
55 mediante un único codón, TGG. Por lo tanto, se apreciará que para una secuencia de ADN dada que codifica un interferón particular existirán muchas secuencias degeneradas de ADN que lo codificarán. Estas secuencias de ADN degeneradas se consideran dentro del alcance de esta divulgación.quot;Fusiónquot;: Se refiere a una unión colineal de dos o más proteínas o sus fragmentos por medio de sus estructuras principales peptídicas individuales a través de la expresión genética de una molécula polinucleotídica que codifica esas proteínas. Se prefiere que las proteínas o sus
60 fragmentos sean de di ferentes fuentes. Por lo tanto, las proteínas de f usión preferidas incluyen una pr oteína de interferón-beta-1a o u n f ragmento c onectado de f orma covalente a un segundo r esto que no es u n i nterferón. Específicamente, una quot;fusión interferón-beta-1a/Igquot; es una proteína que comprende una molécula de interferón-beta1a de la i nvención, o un f ragmento d e l a m isma, c onectado a un ex tremo N -terminal de una c adena d e inmunoglobulina,donde unaparte delextremo N-terminalde la inmunoglobulina está sustituida con el interferón
5 beta-1a.
quot;Recombinantequot;, como se usa en el presente documento, significa que una proteína se obtiene de sistemas de expresión recombinantes mamíferos. La proteína expresada de la mayoría de los cultivos bacterianos, por ejemplo,
E. coli, carecerá de g licano, por lo tanto no se prefieren estos sistemas la expresión. La proteína expresada en 10 levadura puede tener estructuras oligosacáridas que son diferentes de las que se expresan en células mamíferas.
quot;Biológicamente activoquot;, como se usa a lo largo de la memoria descriptiva como una característica de interferón-beta 1a, significa que una molécula particular comparte una homología de secuencia de aminoácidos suficiente con las realizaciones de la presente invención desveladas en el presente documento para ser capaz de m ostrar actividad
15 antivírica como se mide en un ensayo antiviral in vitro del tipo mostrado en el Ejemplo 1 (véase más adelante).
Una quot;composición terapéuticaquot;, como se usa en el presente documento, se define por comprender las proteínas de la i nvención y otros i ngredientes f isiológicamente compatibles. La c omposición t erapéutica pu ede c ontener excipientes tales como agua, minerales y vehículos tales como proteína.
20 Una quot;cantidad eficazquot; de un agente de la invención es la cantidad que produce un resultado o ejerce una influencia en la afección particular que se está tratando.quot;Aminoácidoquot;: Una unidad monomérica de un p éptido, polipéptido o proteína. Hay veinte aminoácidos que se encuentran en péptidos, polipéptidos y proteínas naturales, todos los cuales son i sómeros L. E l t érmino t ambién i ncluye l os análogos de l os a minoácidos y l os i sómeros D de l os
25 aminoácidos proteicos y sus análogos.
Un aminoácido quot;derivadoquot; es un aminoácido natural o no natural en el que la cadena lateral o grupo terminal normal está modificado mediante reacción química. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, gamma-carboxilación, betacarboxilación, sulfatación, sulfonación, fosforilación, amidación, esterificación, N-acetilación, carbobencilación,
30 tosilación y otras modificaciones conocidas en la técnica. Un quot;polipéptido derivadoquot; es un polipéptido que contiene uno o más aminoácidos derivados.
quot;Proteínaquot;: C ualquier po límero que c onsiste es encialmente en c ualquiera de l os 20 am inoácidos. A unque quot;polipéptidoquot; s e usa a menudo r efiriéndose a polipéptidos r elativamente gr andes, y quot; péptidoquot; se us a a m enudo
35 refiriéndose a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se solapa y es variado. El término quot;proteínaquot;, como se usa en el presente documento, se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a menos que se indique de otra forma.
quot;Mutantequot;: C ualquier c ambio en e l m aterial gen ético de un or ganismo, e n pa rticular c ualquier cambio ( es decir,
40 deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia polinucleotídica de tipo silvestre o cualquier cambio en una proteína de tipo silvestre. El término quot;muteínaquot; se usa de forma intercambiable con quot;mutantequot;.quot;Tipo silvestrequot;: La secuencia polinucleotídica natural de un exón de una proteína, o de una porción de la misma, o una secuencia proteica, o una porción de la misma, respectivamente, como existe normalmente in vivo.quot;Condiciones de hibridación estándarquot;: Condiciones de sal y de temperatura sustancialmente equivalentes a 0,5 x SCC a aproximadamente 5 x
45 SSC y 65 ºC tanto para hibridación como para lavado. La expresión quot;condiciones de hibridación estándarquot;, como se usa en el presente documento, por lo tanto, es una definición operacional e incluye un intervalo de condiciones de hibridación. Las condiciones de rigurosidad superiores pueden incluir, por ejemplo, hibridar con tampón de cribado en placa (0,2 % de polivinilpirrolidona, 0,2 % de Ficoll 400; 0,2 % de albúmina sérica bovina, Tris-HCl 50 mM (pH 7, 5); NaCl 1 mM; 0, 1 % de pirofosfato sódico; 1 % de SDS); 10 % de sulfato de dextrano, y 100 μg/ml de ADN de
50 esperma de salmón desnaturalizado y sonicado a 65 ºC durante 12-20 horas, y lavar con NaCl 75 mM/citrato sódico 7,5 mM (0,5 x SCC)/1 % de SDS a 65 ºC. Las condiciones de rigurosidad inferiores pueden incluir, por ejemplo, hibridar con tampón de cribado en placa, 10 % de sulfato de dextrano y 110 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonicado a 55 º C d urante 12-20 horas, y lavar c on NaCl 300 m M/citrato s ódico 30 mM ( 2,0 x SCC)/1 % de SDS a 55 ºC. Véase también Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nueva
55 York, Secciones 6.3.1-6.3.6, (1989).
quot;Secuencia de control de expresiónquot;: Una secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de genes cuando se une de forma operable a esos genes.
60 quot;Unido d e f orma op erablequot;: Una s ecuencia po linucleotídica ( ADN, A RN) e stá un ida de f orma op erable a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia polinucleotídica. La expresión quot;unido de forma operablequot; incluye tener una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) delante de la secuencia polinucleotídica a expresar, y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia polinucleotídica bajo el control de la secuencia de control
5 de expresión y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia polinucleotídica.
quot;Vector de expresiónquot;: Un polinucleótido, tal como un plásmido de ADN o un fago (entre otros ejemplos comunes) que permite la expresión de al menos un gen cuando el vector de expresión se introduce en una célula huésped. El vector puede o no ser capaz de replicarse en una célula.
10 quot;Aisladoquot; ( usado d e f orma i ntercambiable c on quot;sustancialmente puroquot;): C uando s e ap lica a ácidos nu cleicos, es decir, secuencias polinucleotídicas, que codifican polipéptidos, significa un polinucleótido de ARN o ADN, porción de polinucleótidos genómicos, cADN o polinucleótido sintético que, debido a su origen o manipulación: (i) no está asociado con la totalidad de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza (por ejemplo, está presente
15 en una célula huésped como un vector de expresión, o una porción suya); o (ii) está unido a un ácido nucleico u otro resto químico distinto de al que está unido en la naturaleza; o (iii) no se da en la naturaleza. Por quot;aisladoquot; se quiere decir además una secuencia polinucleotídica que: (i) se amplifica in vitro mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) se sintetiza químicamente; (iii) se produce de forma recombinante mediante clonado; o
(iv) se purifica, mediante escisión y separación en gel.
20 Por lo tanto, quot;ácido nucleico sustancialmente puroquot; es un ácido nucleico que no está inmediatamente contiguo con una o ambas secuencias codificantes con las que está normalmente contiguo en el genoma natural del organismo del que procede el ácido nucleico. El ADN sustancialmente puro también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias adicionales.
25 quot;Aisladoquot; (usado de forma intercambiable con quot;sustancialmente puroquot;): Cuando se aplica a polipéptidos significa un polipéptido o una porción suya que,debido a su origen o manipulación: (i) está presente en una célula huésped como el producto de expresión de una porción de un vector de expresión; o (ii) está unido a una proteína u otro resto químico distinto de al que está unido en la naturaleza; o (iii) no se da en la naturaleza. Por quot;aisladoquot; se quiere decir
30 además una proteína que: (i) se sintetiza químicamente; o (ii) se expresa en una célula huésped y se purifica de las proteínas asociadas. El t érmino s ignifica gen eralmente un polipéptido que s e ha separado de ot ras proteínas y ácidos nu cleicos c on l os qu e s e da de f orma n atural. Preferiblemente, el po lipéptido t ambién s e s epara de sustancias tales como anticuerpos o matrices de gel (poliacrilamida) que se usan para purificarlo.quot;Promotor heterólogoquot;: Como se usa en el presente documento, es un promotor que no está asociado de forma natural con un
35 gen o con un ácido nucleico purificado.
quot;Homólogoquot;: Como se usa en el presente documento, es sinónimo del término quot;identidadquot;, y se refiere a la similitud de s ecuencia ent re dos p olipéptidos, moléculas o ent re d os ác idos nu cleicos. C uando una po sición e n l as do s secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monómera de aminoácido (por ejemplo, si
40 una posición en las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en los dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las moléculas respectivas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de coincidencias o posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de l as posiciones en do s s ecuencias s on c oincidentes o s on ho mólogas, ent onces l as do s s ecuencias s on
45 homólogas en un 60 %. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50 % de homología ( 3 d e l as 6 posiciones totales s on c oincidentes). En g eneral, se h ace una c omparación c uando do s secuencias están al ineadas p ara dar una hom ología m áxima. Tal alineación se puede proporcionar usando, por ejemplo, el método de Needleman y col., J. Mol Biol. 48: 43-453 (1970), implementado convenientemente mediante programas i nformáticos t ales c omo el pr ograma A lign ( DNAstar, I nc.). L as s ecuencias homólogas c omparten
50 residuos de aminoácidos idénticos o similares, en las que los residuos similares son sustituciones conservativas, o quot;mutaciones p untuales p ermitidasquot;, de los residuos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una quot;sustitución conservativaquot; de un residuo en una secuencia de referencia son aque llas s ustituciones que s on f ísicamente o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes, por ej emplo, que t ienen similar t amaño, forma, carga eléctrica, pr opiedades quí micas, que
55 incluyen la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno. Las sustituciones conservativas particularmente preferidas son las que cumplen los criterios definidos para una quot; mutación puntual aceptadaquot; en Dayhoff y col., 5: Atlas o f P rotein S equence and S tructure, 5: S upl. 3. capítulo 22: 35 4-352, N at. Biomed. R es. F oundation, Washington, D.C. (1978).
60 Las expresiones quot;secuencia polinucleotídicaquot; y quot;secuencia nucleotídicaquot; se usan también de forma intercambiable en
el presente documento.
quot;Angiogénesisquot; y quot; neovascularizaciónquot; significan, e n s u sentido m ás amplio, l a f ormación de v asos sanguíneos nuevos. E n p articular, l a a ngiogénesis t ambién se r efiere a l a f ormación d e v asos s anguíneos n uevos en la 5 localización de un tumor.
quot;IFNAR2quot;, quot;IFNAR1quot;, quot;IFNAR1/2quot; se refieren a las proteínas que se sabe que componen el receptor de interferón de tipo I de superficie celular. La parte extracelular (ectodominio) de la cadena IFNAR2 sola puede unir interferón alfa o beta.
10 La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología celular, cultivo c elular, bi ología m olecular, microbiología, A DN r ecombinante, quí mica d e pr oteínas e inmunología, las cuales están dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.),
15 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N. Glover, ed), 1985;Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984;patente de Estados Unidos n.º 4.683.195 (Mullis y col.,);Nucleic Acid Hybridization
(B.D. H ames y S .J. H iggins, ed s.), 1 984;Transcription and T ranslation ( B.D. H ames y S .J. H iggins, e ds.), 1984;Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987;Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986;A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984;Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155 (Wu y
20 col., eds). Academic Press, Nueva York;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos, eds.), 1987, C old S pring H arbor L aboratory;Immunochemical M ethods i n C ell a nd M olecular Biology ( Mayer y Walker, eds.). A cademic P ress, Lon dres, 19 87;Handbook of E xperiment I mmunology, V olúmenes I -IV ( D.M. Weir y C .C. Blackwell, eds.), 1986;Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
25 El INTERFERÓN-BETA
El i nterferón-beta-1a e s ú til c omo age nte par a e l t ratamiento, r emisión o a tenuación d e un a p atología, af ección fisiológica, síntomas o f actores etiológicos, o para su evaluación o d iagnóstico. La expresión también se refiere a interferón-beta-1a que e s parte d e una pr oteína d e fusión, t al como un a pr oteína de f usión i nmunoglobulina
30 interferón-beta-1a. La preparación de proteínas de fusión en general está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.
Se ha(n) descubierto sitio(s) único(s) para la unión de polímero que no destruiría(n) la función de interferón-beta-1a. Además, se han usado métodos de mutagénesis dirigida para investigar de forma independiente sitio(s) para la 35 unión de polímero (véase el Ejemplo 1). En resumen, se ha emprendido un análisis mutacional de interferón-beta-1a humano con el propósito de cartografiar los residuos necesarios para la actividad y la unión a receptor. La disponibilidad de l a e structura c ristalina t ridimensional d el i nterferón-beta-1a hum ano ( véase ant eriormente y el Ejemplo 1) permite identificar, par a sustituciones c on al anina ( o s erina), los r esiduos ex puestos a l di solvente disponibles para las interacciones con el receptor de interferón beta, y mantener los aminoácidos implicados en los
40 enlaces intramoleculares. Se diseñó un panel de quince mutaciones de barrido de alaninas que sustituyeron entre dos y ocho residuos a lo largo de distintas regiones de cada una de las hélices (A, B, C, D, E) y bucles (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) de interferón-beta-1a. Véase el Ejemplo 1.
Se incluyó una señal de histidina amino-terminal (señal quot;hisquot;) para la purificación por afinidad de los mutantes
45 expresados en células mamíferas (Figura 10 y SEQ ID NOS: 1 y 2 para el cADN y las secuencias de aminoácidos deducidas, respectivamente). Las consecuencias funcionales de estas mutaciones se analizan en ensayos antivirales y de antiproliferación. Se desarrolló un ensayo de unión sin radiactividad para analizar la unión de estos mutantes al receptor de superficie celular de interferón beta (receptor de superficie celular IFNAR1/2). Además, se usó un ensayo ba sado en E LISA qu e e mplea u na proteína de f usión de ec todominio de I FNAR2/Ig para unir
50 interferón para cartografiar las interacciones de las superficies entre interferón-beta-1a e IFNAR2 (véase el Ejemplo 1). Estos análisis mutacionales demostraron que los extremos N y C-terminales se encuentran en una porción de la molécula de interferón-beta que no es importante para la unión a receptor o la función biológica.
Los mutantes son variantes adicionales del resto de interferón beta 1a de la invención que pueden ser
55 particularmente útiles, ya que exhiben propiedades nuevas que no se hallan en el interferón-beta-1a de tipo silvestre (véase el Ejemplo 1). Se han identificado tres tipos de efectos que se causaron mediante mutagénesis dirigida. Estos efectos pueden ser ventajosos para el desarrollo de fármacos de interferón en ciertas circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a) mutantes con actividad antivírica superior que la del interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his (por ejemplo, mutante C1); (b) mutantes que exhiben actividad tanto en ensayos antivirales
60 como de antiproliferación, pero para los que la actividad de antiproliferación es desproporcionadamente baja con respecto a la actividad antivírica, comparado con el interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his (por ejemplo, mutantes C1, D y DE1); y (c) antagonistas funcionales (por ejemplo, A1, B2, CD2 y DE1), que muestran actividades antivirales y antiproliferativas que son desproporcionadamente bajas con respecto a la unión a receptor, comparadas con interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his.
EL RESTO POLIMÉRICO
En l a presente i nvención, se em plea un a ú nica m olécula de po límero q ue comprende u n d extrano, pol ivinil pirrolidona, poliacrilamida, o alcohol polivinílico para la conjugación con el extremo N-terminal de un interferón-beta 10 1a. Las composiciones de interferón-beta 1a conjugado de la invención pueden tener utilidad tanto en aplicaciones in vivoasí como no in vivo. Además, se reconocerá que el polímero de conjugación puede utilizar otros grupos, restos u otras especies conjugadas, según sea apropiado para la aplicación final. A modo de ejemplo, puede ser útil en algunas aplicaciones unir de forma covalente al polímero un resto funcional que confiera resistencia a la degradación UV, o antioxidación, u otras propiedades o características al polímero. Como ejemplo adicional, puede ser ventajoso 15 en algunas aplicaciones modificar el polímero para hacerlo de carácter reactivo o reticulable, para potenciar diversas propiedades o c aracterísticas del material c onjugado en s u c onjunto. P or l o t anto, el polímero puede contener cualquier función, grupos repetitivos, uniones u ot ras estructuras constituyentes que no impiden la eficacia de l as composiciones de interferón-beta 1a conjugado para su propósito deseado. Otros objetivos y ventajas de la presente invención serán a parentes d e f orma más c ompleta a p artir de l a s ubsiguiente di vulgación y l as r eivindicaciones
20 adjuntas.
Los polímeros ilustrativos que se pueden emplear de forma útil para alcanzar estas características deseables se describen en el presente documento más adelante en los esquemas de reacción ejemplares. En las aplicaciones de péptidos unidos de forma covalente, el polímero se puede modificar y después se puede acoplar a aminoácido(s) de
25 el/los péptido(s) para formar enlaces lábiles.
El i nterferón-beta-1a se c onjuga de f orma m ás preferible por m edio d e un grupo r eactivo terminal del po límero, aunque l as conjugaciones t ambién s e p ueden r amificar desde l os gr upos r eactivos q ue no s on t erminales. E l polímero con el/los grupo(s) reactivo(s) se designa en el presente documento como quot;polímero activadoquot;. El grupo
30 reactivo reacciona de forma selectiva con los grupos amino libres u otros reactivos en el extremo N-terminal de la proteína. El polímero activado se hace reaccionar de forma que la unión se da en el grupo amino N -terminal de interferón-beta-1a. El sitio para el acoplamiento polimérico es el extremo N del interferón-beta-1a.
En general, se emplean de aproximadamente de 1,0 a aproximadamente de 10 moles de polímero activado por mol
35 de pr oteína, de pendiendo d e l a c oncentración d e pr oteína. La cantidad f inal es u n eq uilibrio entre maximizar e l alcance de la reacción a la vez que se minimizan las modificaciones inespecíficas del producto y, al mismo tiempo, definir las propiedades químicas que mantendrán una actividad óptima, mientras al mismo tiempo se optimiza, si es posible, la semivida de la proteína. Preferiblemente, al menos se conserva al rededor del 50 % de l a actividad biológica de la proteína, y lo más preferiblemente se conserva el 100 %.
40 Las reacciones pueden tener lugar mediante cualquier método adecuado usado para hacer reaccionar materiales biológicamente activos con polímeros inertes, preferiblemente a alrededor de pH 5-7 porque los grupos reactivos están en el grupo alfa amino en el extremo N-terminal. En general, el proceso implica preparar un polímero activado (que puede tener al menos un grupo hidroxilo terminal) y posteriormente hacer reaccionar la proteína con el polímero
45 activado para producir la proteína soluble adecuada para la formulación. La reacción de modificación anteriorse puede realizar mediante varios métodos, que pueden implicar una o más etapas.
Como se mencionó anteriormente, las realizaciones de la invención utilizan el extremo N-terminal de interferónbeta1a c omo l a un ión al polímero. E stán d isponibles métodos ad ecuados p ara obtener de forma s electiva un 50 interferón-betala modificado de forma N-terminal. Un método se ilustra mediante un método de alquilación reductora que explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (los grupos épsilon amino de la lisina respecto de los grupos amino de la metionina N-terminal) disponibles para la modificación de interferón-beta1a. En las condiciones de selección apropiadas, se puede conseguir la modificación sustancialmente selectiva de interferón-beta-1a en su extremo N-terminal con un polímero que contiene un grupo carbonilo. La reacción se realiza
55 a un pH que permite aprovechar la ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos épsilon-amino de los residuos de l isina y l a del gr upo a lfa-amino del r esiduo de l N -terminal de i nterferón-beta-la. E ste t ipo de pr ocedimiento químico se conoce bien por el experto en la técnica.
Se usó un esquema la reacción en el que esta selectividad se mantiene llevando a cabo las reacciones a pH bajo 60 (en general 5-6) en condiciones en las que un polímero PEG-aldehído se hace reaccionar con interferón-beta-1a en presencia de cianoborohidruro sódico. Esto da como resultado, después de la purificación del PEG-interferón-beta1a y análisis con SDS-PAGE, espectrometría de masas MALDI y secuenciación/cartografía de péptidos, un interferónbeta-la cuyo extremo N-terminal está marcado específicamente por el resto PEG.
5 La estructura cristalina de interferón-beta-1a es tal que los extremos N y C-terminales están localizados cerca el uno del otro (véase Karpusas y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818). Por lo tanto, las modificaciones del extremo C-terminal del interferón-beta-1a también deberían tener un efecto mínimo sobre la actividad. Aunque no hay una estrategia química simple para dirigir un polímero de polialquilenglicol tal como PEG hacia el extremo Cterminal, sería sencillo modificar mediante ingeniería genética un sitio que se pudiese usar para dirigir el resto de
10 polímero. Por ejemplo, la incorporación de una C ys en un sitio que está en el extremo C -terminal o cerca de él permitiría la modificación e specífica u sando un pol ialquilenglicol ( por ejemplo, P EG) ac tivado c on maleimida, vinilsulfona o haloacetato. Estos derivados se pueden usar específicamente para la modificación de las cisteínas alteradas mediante ingeniería genética debido a la elevada selectividad de estos reactivos por Cys. Otras estrategias, tales como la incorporación de una señal de histidina que puede ser dirigida (Fancy y col., (1996) Chem.
15 & B iol. 3: 551) o un s itio de gl icosilación adi cional, r epresentan ot ras alternativas para m odificar e l ex tremo C terminal de interferón-beta-1a.
El glicano del interferón-beta-1a está también en una posición que permitiría la modificación adicional sin alterar la actividad. Los m étodos par a m arcar hidratos de c arbono c omo sitios par a l a modificación q uímica t ambién se 20 conocen bien, y por l o tanto es pr obable qu e s e pueda añadir un p olímero d e po lialquilenglicol di rectamente y específicamente a h idratos d e c arbono d el interferón-beta-1a q ue se han a ctivado p or m edio de ox idación. P or ejemplo, s e puede gen erar un polietilenglicol-hidrazida, que f orma un iones h idrazona r elativamente e stables mediante condensación con aldehídos y cetonas. Esta propiedad se ha usado para la modificación de proteínas por medio de uni ones de oligosacáridos oxidados. Véase Andrersz. H. y col., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. En
25 particular, el tratamiento con PEG-hidrazida de carboximetilo con nitrito produce PEG-azida de carboximetilo, que es un gr upo el ectrófilo r eactivo hacia gr upos amino. E sta r eacción se puede usar para preparar también proteínas modificadas con polialquilenglicol. Véanse las patentes de Estados Unidos 4.101.380y4.179.337.
Se ha descubierto previamente que el procedimiento químico con enlazador de tiol podría facilitar adicionalmente la
30 reticulación de proteínas. En particular, se generaron multímeros homotípicos de LFA-3 y CD4 usando un procedimiento tal como generar aldehídos reactivos en restos de hidratos de carbono con peryodato sódico, formar conjugadosde cistamina pormediode losaldehídose introducir reticulación por mediode losgrupos tiol de las cistaminas.VéansePepinsky,B. y col, (1991).J. Biol. Chem.,266:18244-18249yChen,L.L. y col., (1991) J. Biol. Chem. 266: 18237-18243. Por lo tanto, se prevé que este tipo de procedimiento químico también sería apropiado
35 para la modificación con polímeros de polialquilenglicol donde se incorpora un enlazador en el hidrato de carbono y el polímero de polialquilenglicol se une al enlazador. Aunque los enlazadores de aminotiol o que contienen hidrazina permitirán la adición de un único grupo polimérico, la estructura del enlazador se puede variar de forma que se pueden añadir múltiples polímeros y/o de forma que se cambia la orientación espacial del polímero con respecto al interferón-beta-1a. Sin embargo, dichos enlazadores descritos en el párrafo anterior no forman parte de la invención
40 reivindicada.
En la práctica de la presente descripción, se incorporan ventajosamente residuos de polialquilenglicol de alquil C1-C4 polialquilenglicoles, preferiblemente polietilenglicol (PEG), o residuos de poli(oxi)alquilenglicol de tales glicoles en los sistemas poliméricos de interés. Por lo tanto, un polímero parte de esta descripción, al que se une la proteína
45 puede ser un homopolímero de polietilenglicol (PEG) o es un poliol polioxietilado, con la condición de que en todos los casos el polímero sea soluble en agua a temperatura ambiente. Dichos polímeros incluyen homopolímeros de óxido de pol ialquileno, t ales c omo P EG o pol ipropilenglicoles, gl icoles pol ioxietilenados, sus copolímeros y copolímeros en bloque en los mismos, con la condición de que se mantenga la solubilidad en agua del copolímero en bl oque. L os ejemplos de po lioles po lioxietilados i ncluyen, por ej emplo, gl icerol po lioxietilado, s orbitol
50 polioxietilado, gl ucosa p olioxietilada. La e structura pr incipal de glicerol de l g licerol polioxietilado e s l a m isma estructura principal que se da de forma natural en, por ejemplo, animales y humanos en los mono-, di-, y triglicéridos. Por lo tanto, esta ramificación no se vería necesariamente como un agente extraño en el cuerpo.
Los polímeros usados en la presente invención incluyen dextrano, polivinil pirrolidonas, poliacrilamidas y alcoholes 55 polivinílicos.
El po límero no ne cesita t ener un p eso molecular par ticular, p ero se pr efiere qu e e l peso m olecular e sté ent re alrededor de 300 y alrededor de 100.000, más preferiblemente entre 10.000 y 40.000. En particular, los tamaños de
20.000 o más son los mejores para prevenir la pérdida de proteína debida a la filtración en los riñones. 60
La formación de derivados de polialquilenglicol tiene varias propiedades ventajosas en la formulación de conjugados de polímero-interferón-beta 1a en la práctica de la presente divulgación, asociadas con las siguientes propiedades de los derivados de polialquilenglicol: mejora de la solubilidad en agua, mientras al mismo tiempo no se provoca respuesta antigénica o inmunógena; grado elevado de biocompatibilidad; ausencia de biodegradación in vivo de los
5 derivados de polialquilenglicol; y facilidad de excreción por organismos vivos.
Además, en o tro a specto d e l a di vulgación, se pu ede utilizar i nterferón-beta 1 a uni do de f orma c ovalente a l componente polimérico en el que la naturaleza de la conjugación implica enlaces químicos covalentes escindibles. Esto permite el control desde el punto de vista del transcurso del tiempo a lo largo del cual el polímero se puede 10 escindir del interferón-beta la. Este enlace covalente entre el fármaco de interferón-beta-1a y el polímero se puede escindir mediante reacción química o enzimática. El producto de polímero-interferón-beta-1a mantiene una cantidad aceptable de actividad. Al mismo tiempo, hay presentes partes de polietilenglicol en el polímero de conjugación para dotar a l c onjugado de po límero-interferón-beta-la de solubilidad en a gua elevada y c apacidad d e c irculación sanguínea pr olongada. C omo r esultado d e estas características mejoradas, l a divulgación contempla l a
15 administración parenteral, nasal, y oral de tanto la especie de polímero-interferón-beta-1a activo como, después de la escisión hidrolítica, la biodisponibilidad del interferón-beta-1a per se, en aplicaciones in vivo.
La reacción del polímero con el interferón-beta la para obtener los productos conjugados N-terminales se lleva a cabo fácilmente usando una amplia diversidad de esquemas de reacción. La actividad y estabilidad de los
20 conjugados d e i nterferón-beta-1a s e pu ede v ariar de d iversas f ormas, us ando u n pol ímero de t amaño molecular diferente. Las solubilidades de los conjugados se pueden variar cambiando la proporción y tamaño del fragmento de polietilenglicol incorporado en la composición de polímero.
Utilidades
25 La propiedad única de los polímeros derivados de polialquilenglicol de valor para las aplicaciones terapéuticas de la presente invención es su biocompatibilidad general. Lospolímeros tienen diversas propiedades de solubilidad en agua y s on at óxicos. S e cree que no s on i nmunógenos ni ant igénicos, y q ue no i nterfieren con l as a ctividades biológicas d el r esto de i nterferón-beta-la c uando se c onjugan en l as c ondiciones descritas en el pr esente
30 documento. Poseen una circulación prolongada en la sangre y se excretan fácilmente de los organismos vivos.
Se ha descubierto que los productos de la presente invención son útiles para mantener la semivida del interferónbeta la terapéutico, y se pueden preparar, por ejemplo, para la administración terapéutica disolviéndolos en agua o en u n medio líquido ac eptable. La a dministración e s p or vía par enteral, en aerosol u oral. Se pued en pr eparar 35 suspensiones coloidales finas para administración parenteral para producir un efecto prolongado, o por la vía oral, mientras la formulación en aerosol puede ser de naturaleza líquida o en polvo seco. En estado seco y liofilizado o en formulaciones en solución, los conjugados de interferón-beta-1a-polímero de la presente invención deberían tener buena estabilidad de a lmacenamiento. La estabilidad t érmica del interferón-beta-la conjugado ( Ejemplo 3) e s ventajosa en los procesos de formulación en polvo que tienen una etapa de deshidratación. Véase, por ejemplo, el
40 documento WO 95/31479(quot;Methods and Compositions for Dry Powder of Interferonsquot;).
Los conjugados terapéuticos de polímero de la presente invención se pueden utilizar para la profilaxis o tratamiento de c ualquier afección o patología par a l a que e l c onstituyente de i nterferón-beta-la es ef icaz. A demás, los conjugados basados en polímero de la presente invención se pueden utilizar en el diagnóstico de c onstituyentes,
45 afecciones o patologías en sistemas o especímenes biológicos, así como para diagnóstico en sistemas no fisiológicos.
En el uso terapéutico, se trata a un sujeto animal que tiene o es susceptible de forma latente a tal(es) afección(es) o patología(s) y que ne cesita t al t ratamiento, s iguiendo u n método que c omprende a dministrar a t al an imal una 50 cantidad eficaz de un conjugado de polímero de la presente invención que es terapéuticamente eficaz para dicha afección o pat ología. Los sujetos a t ratar mediante los conjugados de polímero de l a presente invención incluyen sujetos mamíferos, y, lo más preferiblemente, sujetos humanos. Dependiendo de la afección o patología específica a combatir, se puede administrar a los sujetos animales conjugados de polímero de la invención a cualquier dosis adecuada terapéuticamente eficaz y segura, como se puede determinar fácilmente dentro de l a experiencia en l a
55 técnica, y sin experimentación excesiva. Debido a las barreras entre especies de los interferones de tipo I, puede ser necesario generar c onjugados d e i nterferón-polímero como se describe en el presente documento con los interferones de las especies apropiadas.
La actividad antiproliferativa celular de interferón-beta-a se conoce bien. En particular, ciertos conjugados de 60 polímero con interferón-beta-la descritos en el presente documento son útiles para tratar tumores y cánceres, tales
como s arcoma o steogénico, l infoma, leucemia l infocítica aguda, c arcinoma de mama, m elanoma y c arcinoma nasofaríngeo, así como afecciones autoinmunes, tales como fibrosis, lupus y esclerosis múltiple. Se espera además que la actividad antivírica exhibida por las proteínas conjugadas, en particular ciertos conjugados de las muteínas de interferón-beta-la descritos en el presente documento, se puedan usar en el tratamiento de enfermedades virales, 5 tales como infección por ECM, gripe y otras infecciones del tracto respiratorio, rabia, y hepatitis. También se espera que las actividades inmunomoduladoras de interferón-beta-1a exhibidas por las proteínas conjugadas descritas en el presente documento se puedan usar en e l tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, tales como fibrosis, esclerosis múltiple. La capacidad de los interferones para inhibir la formación de vasos sanguíneos nuevos (es decir, inhibir la angiogénesis y la neovascularización) posibilita que los conjugados de la invención se usen para
10 tratar enfermedades angiogénicas, tales como retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeosis y síndrome de Osler-Webber.
Además, la actividad antiendotelial de interferón se conoce desde hace tiempo, y un mecanismo potencial de la
15 acción del interferón puede ser interferir con la actividad de las células endoteliales inhibiendo la producción o la eficacia de los factores angiogénicos producidos por las células tumorales. Algunos tumores vasculares, tales como hemangiomas, son particularmente sensibles al tratamiento con interferón. El tratamiento con interferón-alfa es el único t ratamiento d ocumentado par a e sta enfermedad. S e es pera que el tratamiento c on l os c onjugados de interferón-beta-la de l a i nvención ofrecerá beneficios farmacéuticos sustanciales en c uanto a farmacocinética y
20 farmacodinámica, ya que se espera que el conjugado permanezca en la vasculatura durante un período de tiempo más largo que los interferones sin conjugar, lo que lleva a una terapia más eficaz y efectiva para su uso como agente anti-angiogénico. Véase el Ejemplo 8.
Los conjugados de polímero-interferón-beta-1a de la invención se pueden administrar per se también en forma de
25 sales farmacéuticamente aceptables. En tales formulaciones farmacéuticas y de medicamentos, el interferón-beta-1a se ut iliza p referiblemente j unto con uno o m ás v ehículo(s) f armacéuticamente a ceptable(s) y op cionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico. El/los vehículo(s) debe(n) ser farmacéuticamente aceptable(s) en el sentido de s er compatible(s) con l os ot ros ingredientes de l a f ormulación, y no ex cesivamente per judicial(es) para su receptor. El interferón-beta-la se proporciona en una cantidad eficaz para conseguir el efecto farmacológico
30 deseado, como se describió anteriormente, en una cantidad apropiada para conseguir la dosis diaria deseada.
Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración parenteral así como no parenteral, y las modalidades de a dministración es pecíficas i ncluyen l a a dministración or al, r ectal, buc al, t ópica, nasal, o ftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoidea,
35 bronquial, linfática, vaginal e intrauterina. Se prefieren las formulaciones adecuadas para administración oral, nasal y parenteral.
Cuando se utiliza el interferón-beta-1a en una formulación que comprende una solución líquida, la formulación se puede a dministrar v entajosamente d e f orma o ral o par enteral. C uando se emplea e l i nterferón-beta-1a e n u na
40 formulación en suspensión l íquida o como u n p olvo en una f ormulación c on u n v ehículo biocompatible, la formulación se puede administrar ventajosamente de forma oral, rectal o bronquial.
Cuando s e ut iliza e l i nterferón-beta-1a d irectamente en f orma d e u n s ólido p ulverizado, el interferón-beta-1a s e puede administrar ventajosamente de forma oral. Como alternativa, se puede administrar de forma nasal o bronquial,
45 por medio de la nebulización del polvo en un gas portador, para formar una suspensión gaseosa del polvo que es inspirada por el paciente desde un circuito de respiración que comprende un dispositivo nebulizador adecuado.
Las formulaciones que comprenden los conjugados de polímero de la presente invención se pueden presentar de forma conveniente en formas farmacéuticasunitarias, y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos
50 bien conocidos en l a t écnica f armacéutica. D ichos m étodos i ncluyen, e n gen eral, l a et apa de a sociar e l/los ingrediente(s) ac tivo(s) c on un vehículo que c onstituye uno o m ás ingredientes accesorios. Típicamente, las formulaciones s e pr eparan a sociando de f orma uni forme e íntima el/los ingrediente(s) ac tivo(s) c on un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y después,si es necesario, dando forma al producto en formas farmacéuticas de la formulación deseada.
55 Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral se pueden presentar como unidades discretas, tales como cápsulas, sellos, comprimidos o pastillas, que contienen cada una la cantidad predeterminada del ingrediente activo como polvo o gránulos; o una suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso, tal como un jarabe, un elixir, una emulsión, o un trago.
60 Se pu ede ha cer un c omprimido m ediante c ompresión o m oldeo, op cionalmente con un o o más i ngredientes accesorios. Los comprimidos mediante compresión se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada, con el compuesto activo en una forma fluida tal como un polvo o gr ánulos, que opcionalmente se mezcla con un aglutinante, desintegrante, lubricante, diluyente inerte, agente tensoactivo o agente de descarga. Los comprimidos
5 moldeados que c onstan de u na mezcla d e l os c onjugados d e p olímero en po lvo c on un v ehículo a decuado se pueden hacer moldeando en una máquina adecuada.
Se puede hacer un jarabe añadiendo el compuesto activo a una solución acuosa concentrada de un hidrato de carbono, por ejemplo sacarosa, a l a que también se le puede añadir cualquier ingrediente(s) accesorio(s). Tal(es)
10 ingrediente(s) accesorio(s) puede(n) incluir aromatizantes, conservante adecuado, agentes para retrasar la cristalización del hidrato de carbono, y agentes para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, tal como un alcohol polihidroxílico, por ejemplo glicerol o sorbitol.
Las f ormulaciones ad ecuadas par a ad ministración parenteral comprenden c onvenientemente u na pr eparación
15 acuosa e stéril d el c onjugado ac tivo, q ue pr eferiblemente es i sotónica c on l a sangre d el r eceptor ( por e jemplo, solución salina fisiológica). Tales formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes u otros sistemas microparticulados que se diseñan para dirigir al compuesto a c omponentes sanguíneos o a uno o m ás órganos. Las formulaciones se pueden presentar en forma de dosis unitaria o de dosis múltiple.
20 Las f ormulaciones d e p ulverizador na sal c omprenden soluciones a cuosas p urificadas del conjugado ac tivo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se ajustan preferiblemente a un pH y a un estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales.
Las formulaciones para administración rectal se pueden presentar como un supositorio con un vehículo adecuado, 25 tal como manteca de cacao, grasas hidrogenadas o ácido graso carboxílico hidrogenado.
Las formulaciones oftálmicas, tales como gotas oculares, se preparan mediante un método similar al pulverizador nasal, excepto que el pH y los factores isotónicos se ajustan preferiblemente para coincidir con los del ojo.
30 Las f ormulaciones t ópicas comprenden los c onjugados de l a i nvención disueltos o suspendidos en uno o más medios, tales como aceite mineral, petróleo, alcoholes polihidroxílicos, u otras bases usadas para formulaciones farmacéuticas tópicas.
Además de los ingredientes anteriormente mencionados, las formulaciones de esta invención pueden incluir además
35 uno o más i ngrediente(s) ac cesorio(s) s eleccionados de di solventes, t ampones, agen tes ar omatizantes, desintegrantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (que incluyen antioxidantes). Por lo tanto, la pr esente i nvención contempla l a provisión d e p olímeros adecuados p ara l a es tabilización i n v itro d e interferón-beta 1a en solución, como una aplicación ilustrativa preferida de aplicación no terapéutica. Los polímeros se pueden emplear, por ejemplo, para aumentar la estabilidad térmica y la resistencia a la degradación enzimática
40 del i nterferón-beta l a. E l a umento de l a es tabilidad t érmica c aracterística de l i nterferón-beta-1a por m edio d e l a conjugación en la manera de la presente invención proporciona un medio para mejorar la duración de almacenado, la estabilidad a temperatura ambiente y la solidez de los reactivos y kits de investigación.
Los s iguientes ej emplos se p roporcionan par a i lustrar l a p resente i nvención. E n par ticular, s e ent enderá que l os
45 experimentos in vivo con animales descritos en el presente documento se pueden variar de forma que sean posibles otras modificaciones y variaciones de la metodología básica. Por ejemplo, en el Ejemplo 5, un experto en la técnica podría usar otros ensayos de neopterina o podría alterar el número y el tipo de primates usados. Se debe considerar que estas modificaciones y variaciones de los Ejemplos se hallan dentro del espíritu y del alcance de la invención.
50 EJEMPLO 1: Estudios d e estructura/actividad d e i nterferón-beta-1a h umano usando m utaciones p or sustitución con alanina/serina: Análisis de los sitios de unión a receptor y de los dominios funcionales
A. Visión general
55 Se emprendió un análisis mutacional extensivo de interferón-beta-la (IFN-beta-ta) humano con objeto de cartografiar los r esiduos n ecesarios par a l a ac tividad y l a uni ón a r eceptor. La di sponibilidad de l a es tructura c ristalina tridimensional d e I FN-beta hu mano (Karpusas, M . y c ol. 1997, P roc. N atl. A cad. S ci. 94: 11813-11818) per mitió identificar para l as sustituciones c on alanina (o serina) los residuos expuestos al disolvente disponibles para las interacciones con el receptor, y mantener los aminoácidos implicados en los enlaces intramoleculares. Se diseñó un
60 panel de 15 mutaciones por sustitución con alanina que sustituían entre 2 y 8 residuos a lo largo de distintas regionesde cada una de las hélices (A, B, C, D, E) y bucles (AB, CD, DE). Se incluyó una señal de histidina aminoterminal que c omprendía s eis r esiduos d e histidina para la pur ificación por af inidad, así c omo un s itio de escisión de enteroquinasa p ara l a el iminación d e l a ex tensión amino-terminal. Lo s i nterferones r esultantes se denominan quot;interferón (IFN) -beta marcado con hisquot; o quot;His-interferón-betaquot; o quot;His6-interferón-betaquot; y similares.
5 Se construyeron diversos plásmidos mutantes de expresión de IFN-beta marcado con his usando una construcción del g en d e I FN-beta de t ipo s ilvestre como molde p ara la m utagénesis. La es trategia de mutagénesis i mplicó introducir primero sitios de escisión de enzimas de restricción únicos por todo el gen de IFN beta marcado con his de tipo silvestre, d espués s ustituir l as di stintas s ecuencias de A DN ent re los sitios de restricción con moléculas
10 bicatenariasde oligonucleótidossintéticos,quecodificabanlasmutacionesdesustitución para alanina (o serina). Finalmente, los genes de IFN mutantes se subclonaron en un plásmido que dirigió la expresión en células mamíferas en una línea celular de riñón 293 humana.
Las consecuencias funcionales de estas mutaciones se analizaron en ensayos antivirales y de antiproliferación. Se
15 desarrolló un e nsayo d e uni ón de I FN n o r adiactivo par a anal izar es tos m utantes en s u un ión a l r eceptor de superficie (quot;complejo IFNAR1/2quot;) de células de linfoma de Daudi Burkitt humanas. Además, se desarrolló un ensayo para c artografiar las s uperficies de i nteracción ent re los m utantes de his-IFN-beta e IFNAR2 q ue em pleó u na proteína de f usión IFNAR2/Ig, que constaba d el d ominio ex tracelular de l a pr oteína receptora de I FN I FNAR2 fusionado con los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana.
1. Creación de un gen de interferón beta como molde para la mutagénesis
La e strategia para gen erar mutantes sustituidos c on a lanina ( o s erina) de IFN-beta f ue crear primero u n ge n de IFNbeta modificado, que codificaba la proteína de tipo silvestre, pero que portaba sitios de es cisión únicos para
25 enzimas de restricción distribuidos a lo largo del gen. Los sitios únicos se usaron para intercambiar las secuencias de t ipo s ilvestre por m oléculas b icatenarias de ol igonucleótidos sintéticos, q ue c odificaban los c odones mutados. Para obtener un casete de expresión de IFN-beta-1a humano adecuado para la creación de genes mutantes, se amplificó el cADN de IFN-beta (número de acceso de GenBank E00029) mediante PCR. Fue necesario un clonado inicial del gen de IFN-beta en el plásmido pMJB107,un derivado de pACYC184 (véase Rose, et. al. 1988, Nucleic
30 Acids Res. 16 (1) 355) para realizar la mutagénesis dirigida del gen en un plásmido que carecía de los sitios de restricción específicos que se generarían por medio de la mutagénesis.
Los cebadores de PCR usados para subclonar las secuencias codificantes del gen de IFN-beta humano permitieron introducir también un sitio de escisión de enteroquinasa en dirección 5' y en el marco de lectura del gen de IFN-beta
35 (cebador de P CR de 5'5'TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3' (SEQ ID NO:3: quot;BET-021quot;, ycebador de PCR de 3' 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3' (SEQ ID NO: 4:quot;best-022quot;) y sitios flanqueantes para enzimas de restricción (BspEI y Xho I) útiles para la clonación en los sitios del plásmido pMJB 107. El ADN resultante se denomina fragmento A de la PCR.
40 Se introdujo una secuencia señaleficaz de la molécula de adhesión de células vasculares humanas 1 (VCAM-1) y una señal de s eis histidinas en la construcción final a partir de un segundo fragmento de ADN creado a partir de pDSW247 (fragmento B). El plásmido pDSW247 es un derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) del que se ha delecionado el gen EBNA-1, y que porta la secuencia señal VCAM-1 (VCAMss) fusionada en 5' y en el marco de
45 lectura con una señal de s eis histidinas. Los cebadores de PCR que s e usaron para generar el resto de c asete VCAMss-1/señal d e histidina f ueron K ID-369 ( cebador de P CR de 5' 5'-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3': S EQ ID N O. 5 ) y K ID-421 ( cebador de P CR de 3' 5' -CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGC C CCCGGA-3': S EQ I D N O: 6) , que i ncorporaban s itios de escisión flanqueantes para enzimas de restricción (NotI y BspEI) que permitieron la escisión del fragmento B de ADN.
50 Para crear un vector plasmídico que llevase la secuencia señal VCAM-1, la señal de his y el gen de interferón-beta se realizó una l igadura triple usando los fragmentos de ADN purificados de u n gel a p artir del vector plasmídico pMJB107 (escindido con NotI y XhoI), fragmento A de PCR (escindido con BspEI y XhoI) y fragmento B (escindido con NotI y BspEI). El plásmido ligado se usó para transformar células de E. coli JA22i o XLi-Blue, y las colonias
55 resistentes a ampicilina se escogieron y se analizó la presencia de insertos mediante análisis de cartografía de restricción. S e hizo A DN M axiprep y s e v erificó l a s ecuencia de l i nserto mediante secuenciación de A DN. La construcción resultante se llamó pCMG260.
2. Creación de mutantes de sustitución con alanina de interferón-beta humano en pCMG260
Se usó el plásmido pCMG260 como molde para múltiples rondas de mutagénesis (U.S.E. kit de mutagénesis de sitio dirigido (Boehringer-Mannheim), que introdujeron sitios de escisión de restricción únicos en posiciones a lo largo de la secuencia codificante de la proteína de IFN-beta, pero no cambiaron la secuencia resultante de la proteína. Los plásmidos mutados se usaron para transformar las cepas de E. coli JA221 o XLi-Blue, y las colonias recombinantes 5 se s eleccionaron por s u r esistencia a c loranfenicol. S e anal izó adi cionalmente en l as c olonias r esistentes a cloranfenicol la presencia del sitio único deseado para enzima de restricción mediante análisis de cartografía de restricción de A DN. E l plásmido d e I FN-beta r esultante, pC MG275.8, c ontenía el gr upo completo d e s itios d e escisión úni cos para enz ima de r estricción y s e v erificó la secuencia d e A DN del ge n. L a secuencia d e A DN completa (SEQ ID NO: 1) del gen de interferón beta modificado y marcado con his, junto con la secuencia codificante
10 de la proteína (SEQ ID NO: 2), se dan en la Figura 10.
El grupo completo de las mutaciones por sustitución con alanina se describe en la Tabla 1 (más adelante). Los nombres de l os mutantes especifican las regiones estructurales (hélices y bucles) en l os que se introdujeron las mutaciones. El panel entero de sustituciones con alanina (serina) da como resultado la mutación de 65 de los 165
15 aminoácidos de IFN-beta humano.
El panel de mutantes se creó a partir de pCMG275.8 sustituyendo segmentos de ADN entre los sitios de restricción únicos con moléculas bicatenarias de oligonucleótidos sintéticos, que portaban la información codificante genética descrita en la Tabla 2 (véase más adelante). Para crear los diversos plásmidos mutantes de sustitución con alanina 20 se ligó vector pCMG275.8 purificado en gel (escindido con la enzima de restricción apropiada, como se indica en la lista m ás ade lante p ara cada r egión estructural de IFN-beta) y moléculas bi catenarias d e o ligonucleótidos ( las secuencias de l as c adenas codificantes s e muestran en l a T abla 2) . La s m ezclas d e l igadura s e us aron par a transformar la cepa JA221 de E. coli y las colonias recombinantes se seleccionaron por su resistencia a ampicilina. Se ensayaron las colonias resistentes a ampicilina para determinar la presencia de la inserción de las mutaciones 25 cribando los sitios apropiados de las enzimas de restricción. Para dos mutantes (A2 y CD2), la estrategia de clonado supuso us ar dos m oléculas bi catenarias de ol igonucleótidos sintéticos ( mostradas en l a T abla 2), q ue p ortaban extremos salientes complementarios para permitir que ligasen entre sí y con la estructura principal del vector-IFNbeta en una ligadura triple. La siguiente lista ilustra los sitios que se usaron para clonar los oligonucleótidos mutados de la Tabla 2. El esquema de clonación (subsección B) muestra las posiciones de estos sitios únicos en el gen de
30 interferón beta.
La línea designada IFN-β muestra la secuencia de IFN-β humano de tipo silvestre. Las sustituciones de alanina o serina de los residuos de IFN-β, se muestran para cada uno de los mutantes, y los guiones, por debajo de las 5 regiones relevantes, indican secuencias de tipo silvestre. Las hélices y estructuras de bucle se indican como líneas continuas por debajo de los mutantes. El bucle DE abarca el hueco entre las hélices D y E. Se generaron dos mutantes adicionales de sustitución de alanina (H93A, H97A y H121A) y se analizaron en ensayos antivíricos para evaluar los efectos de la mutación de estas histidinas, que quelan el cinc en el dímero de la estructura cristalina. Ambos de e stos m utantes conservaron un a ac tividad completa de t ipo silvestre e n e nsayos antivíricos, l o que
10 sugiere que la formación de dímeros mediada por cinc no es importante para la actividad de IFN-β.
TABLA 2
A1
SEQ ID NO: 7
BET-053
A2
SEQ ID NO: 8
BET-039
SEQ ID NO: 9
GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
BET-041
AB1
SEQ ID NO: 10
BET-080
AB2
SEQ ID NO: 11
BET-082
AB3
SEQ ID NO: 12 AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACA
BET-084
SEQ ID NO: 13
TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA
BET-086
B1
SEQ ID NO. 14
BET-110
B2
SEQ ID NO. 15
BET-112
C1
SEQ ID NO: 16
BET-114
C2
SEQ ID NO. 17
BET-092
CD1
SEQ ID NO. 18 CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT
BET-094
CD2
SEQ ID NO: 19
BET-096
SEQ ID NO: 20
TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACACTGT
BET-106
D1
SEQ ID NO: 21
BET-108
DE1
SEQ ID NO. 22
BET-116
DE2
SEQ ID NO. 23
BET-118
E1
SEQ ID NO: 24 CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG
BET-104
B. Construcción de plásmidos de expresión de EBNA 293
Los genes de IFN-beta de tipo silvestre y mutante, fusionados con la secuencia señal VCAM-1, señal de his y sitio
5 de escisión de enteroquinasa, se purificaron en gel como fragmentos de restricción de NotI y BamHI de 761 pares de bases. Los genes purificados se subclonaron en el vector plasmídico pDSW247 escindido con NotI y BamHI, como 5 se describe en el esquema. El plásmido pDSW247 es un vector de expresión para la expresión transitoria de proteína en células r enales EBNA 293 hu manas ( Invitrogen, C arlsbad, C A). C ontiene el pr omotor de gen es tempranos de citomegalovirus y elementos reguladores de VEB que son necesariospara la expresión génica de
10 nivel elevado en ese sistema,así como marcadores seleccionablespara E. coli(resistenciaaampicilina)ycélulas EBNA 293 (resistencia a higromicina) como se observa en el esquema de la estrategia de clonado (más adelante). Los plásmidos ligados se usaron para transformar células de E. coli JA221 o XLi-Blue, y las colonias resistentes a ampicilina se recogieron y se analizó la presencia de insertos mediante análisis de cartografía de restricción. Se hizo ADN Maxiprep y se verificó la secuencia de los insertos mediante secuenciación de ADN. Los clones positivos que mostraban las secuencias mutadas deseadas se usaron para transfectar células renales EBNA 293 humanas como se describe más adelante.
La estrategia de clonación general se presenta a continuación:
10 C. Expresión y cuantificación de mutantes de sustitución de alanina de IFN-beta-la
Las c élulas E BNA 2 93 hu manas ( Invitrogen, C arlsbad, CA, C hittenden, T . ( 1989) J. V irol. 63: 301 6-3025) s e mantuvieron como cultivos subconfluentes en medios de Eagle modificados por Dulbecco complementados con un 10 % de suero bovino fetal, glutamina 2 mM y 250 μg/ml de geneticina (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Los 15 plásmidos de expresión pDSW247 se transfectaron transitoriamente en células EBNA 293 usando el protocolo de lipofectamina ( GibcoBRL, Li fe T echnologies). S e r ecolectaron l os medios condicionados 3 -4 dí as d espués d e l a
transfección, l os r estos celulares se e liminaron mediante centrifugación, y s e c uantificó l a concentración de h is-IFNbeta mediante ELISA.
El en sayo E LISA se r ealizó us ando an ticuerpos po liclonales d e conejo ( IgG purificada con pr oteína A , l os
5 anticuerpos se habían obtenido para IFN-beta-1a humano purificado) para revestir placas de ELISA de 96 pocillos y se usó un a f orma b iotinilada de l a m isma IgG p oliclonal de c onejo como r eactivo secundario p ara permitir l a detección de interferón usando peroxidasa de rábano unida a estreptavidina (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA). Se usó una serie de diluciones de interferón-beta-la para generar curvas de concentración estándar. Este medio condicionado que contenía his-IFN-beta de transfectantes de EBNA se diluyó para obtener muestras con
10 concentraciones que oscilaban entre 10 ng/ml y 0,3 ng/ml en el ensayo ELISA. Para confirmar las concentraciones de I FN-beta de l os medios d eterminadas m ediante E LISA, s e r ealizó análisis de t ransferencia de Western. Lo s sobrenadantes de l c ultivo r educidos y l os p atrones de I FN-beta-1a s e s ometieron a S DS-PAGE en gel es e n gradiente del 10-20 % (Novex, San Diego, CA) y se transfirieron a membranas PDVF. Las bandas inmunorreactivas se detectaron con antisuero anti-IFN-beta-1a policlonal de conejo (nº 447, Biogen, Inc., un segundo antisuero que se
15 había obtenido para IFN-beta-1a), s eguido de tratamiento con I gG anti-conejo de burro unida a HRP (Jackson ImmunoResearch).
D. Análisis de la unión a receptor de los mutantes de interferón-beta
20 Las propiedades de unión a receptor de los mutantes de interferón-beta descritos en C se analizaron usando dos ensayos de unión diferentes. Un ensayo midió la unión de los mutantes de interferón-beta a una proteína de fusión, EFNAR2/Ig, que comprendía el dominio extracelular de la cadena del receptor IFNAR2 humano fusionado con parte de la región constante de una IgG humana. IFNAR2-Fc se expresó en células de ovario de hámster chino (CHO) y se purificó mediante cromatografía de afinidad en Sepharose con proteína A según las instrucciones del fabricante
25 (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, catálogo n.º 20334). La unión de mutantes de interferón-beta a IFNAR2-Fc se midió en un ensayo con formato ELISA. Las placas de ELISA se prepararon revistiendo placas de 96 pocillos de fondo plano durante la noche a 4 ºC con 50 μl/pocillo de anticuerpo monoclonal IgG1 anti-humano de ratón (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) de 10 μg/ml en tampón de revestimiento (NaHCO3 50 mM, MgCl2 0,2 mM, CaCl2 0,2 mM, pH 9,6). Las placas se lavaron dos veces con PBS que contenía 0,05 % de Tween-20, y se bloquearon con 0,5 % de leche en
30 polvo desnatada en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de dos lavados más, se añadieron 50 μl de 1 μg/ml de IFNAR2-Fc en 0,5 % de leche en PBS que contenía 0,05 % de Tween-20 a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, y las placas se lavaron después dos veces más. La unión de los mutantes de interferón-beta a IFNAR2-Fc se midió añadiendo 50 μl/pocillo de interferón-beta mutante en medio condicionado, diluido en serie en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con un 10 % de suero bovino
35 fetal, e incubando durante 2 horas a 4 ºC. Las diluciones de mutante de interferón-beta oscilaron típicamente de aproximadamente 1 μM hasta 10 pM. Después de lavar, el interferón-beta unido a las placas se detectó añadiendo 50 μl/pocillo de una mezcla que consistía en una dilución 1:1000 de un anticuerpo anti-interferón policlonal de conejo (n.º 447) más IgG anti-conejo de burro marcada con peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson ImmunoResearch), e incubando durante 15 minutos a 4 ºC. Después de dos lavados, se añadió sustrato de HRP, y la placa se incubó a 4
40 ºC antes de leerse en un lector de placas de ELISA a una absorbancia de 450 nm. Los datos se trazaron como absorbancia respecto de la concentración de interferón-beta mutante, y se determinó la afinidad para la unión del interferón-beta mutante a IFNAR2-Fc ajustando los datos a una ecuación de unión hiperbólica simple. Los resultados de estos análisis se muestran en l a Figura 1, en la que la afinidad de unión para cada mutante, determinada al menos en tres experimentos independientes, se expresa como un porcentaje de la medida para interferón-beta-La
45 de tipo silvestre con His6.
Se usó un segundo ensayo de unión a receptor para medir la afinidad con la que los mutantes de interferón-beta se unieron a células Daudi que expresaban ambas cadenas del receptor, IFNAR1 y IFNAR2, que juntas comprenden el receptor p ara i nterferón-beta. E ste ensayo ba sado en F ACS us ó un a nticuerpo m onoclonal bloqueante d irigido 50 contra el do minio ex tracelular de I FNAR1, E A12 ( Biogen, I nc.), par a di stinguir e l r eceptor s in oc upar ( libre) d el receptor al que se ha unido interferón-beta. Las células Daudi (20 μl a 2,5 x 107 células/ml) se colocaron en placas de ELISA de fondo en V de 96 pocillos, y se incubaron durante 1 hora a 4 º C con diversas concentraciones de mutante de interferón-beta (20 μl en tampón de FACS; 5 % de FBS, 0,1 % de NaN3 en PBS). Las diluciones en serie deseadas de mutantes de interferón-beta oscilaron desde 0, 5 μM hasta 0,5 pM. Se añadieron a cada pocillo 100 ng 55 de anticuerpo EA12 monoclonal anti-IFNARI murino biotinilado (10 μl), y las placas se incubaron durante 2 minutos adicionales a t emperatura a mbiente antes d e l avarse d os v eces c on t ampón d e F ACS ( 4 º C). Las células se incubaron después durante 30 minutos a 4 ºC con 50 μl/pocillo de una dilución 1:200 de estreptavidina conjugada con R-ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch), se lavaron dos veces con tampón de FACS, se resuspendieron en 300 μl de tampón de FACS que contenía 0,5 % de paraformaldehído, y se transfirieron a tubos de poliestireno de 12 60 x 75 mm (Falcon 2052). Lasmuestras se analizaron después mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton
Dickinson). L os d atos s e di bujaron c omo i ntensidad de f luorescencia m edia por c anal ( IFMC) r especto d e l a concentración de m utante de i nterferón-beta; las afinidades de unión s e def inieron c omo l a c oncentración de mutante de interferón-beta que daba un 50 % de inhibición de tinción con anticuerpo. Cada mutante se ensayó múltiples v eces. La F igura 2 m uestra l as af inidades de u nión a r eceptor par a c ada m utante de i nterferón-beta,
5 determinadas mediante este método, expresadas como un porcentaje de la afinidad medida para interferón-beta-1a de tipo silvestre con His6 en cada experimento.
E. Análisis de los mutantes de interferón-beta por función
10 Se analizó también la actividad funcional de los mutantes de interferón-beta usando ensayos in vitro para determinar la ac tividad antivírica y l a c apacidad d el i nterferón-beta p ara i nhibir l a pr oliferación c elular. S e r ealizó c on c ada mutante un mínimo de tres ensayos antivirales, cada uno con puntos por triplicado. Se incluyó interferón-beta-1a de tipo silvestre con His6 como referencia en cada experimento. Los ensayos antivirales se realizaron tratando células de carcinoma de pulmón humanas A549 (ATCC CCL 185) durante la noche con diluciones dobles en serie a un
15 medio de interferón-beta mutante a concentraciones que abarcaban el intervalo entre la protección antiviral completa y un estado sin protección de muerte celular viral. Al día siguiente, las células se expusieron durante dos días a virus de encefalomiocarditis (ECMV) a una dilución que dio como resultado la muerte celular completa en ausencia de interferón. Las placas se revelaron después con la tinción metabólica MTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2Htetrazolio-5-carboxianilida) (M5655, Sigma, St. Louis, MO). Se preparó una solución madre de MTT de 5mg/ml en
20 PBS y se filtró de forma estéril, y se diluyeron 50 μl de esta solución en cultivos celulares (100 μl por pocillo). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 - 60 minutos, la solución MTT/medios se desechó, las células se lavaron con 100 μl de PBS, y finalmente la tinción metabolizada se solubilizó en 100 μl de ácido clorhídrico 1,2 N en un 90 % de isopropanol. Se cuantificaron las células viables (como evidenció la presencia de la tinción) mediante abs orbancia a 450 nm. Los dat os s e analizaron trazando l a absorbancia respecto de l a
25 concentración de mutante de i nterferón-beta, y la actividad de cada mutante se definió como la concentración a la que el 50 % de las células murieron. La Figura 3 muestra la actividad de cada mutante expresada como porcentaje de la actividad medida para el interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his en cada experimento.
Los mutantes de interferón-beta también se analizaron en cuanto a su función en un ensayo de antiproliferación. Se
30 cultivaron células de linfoma de Daudi Burkitt humanas (ATCC n.º CCL 213) a 2 x 105 células/ml en RPMI 1620 complementado c on un 10 % de s uero bov ino f etal def inido ( Hyclone, Logan U tah), y L -glutamina 2 mM. Cada pocillo también contenía una concentración dada de mutante de interferón-beta en un volumen final total de 100 μl de medio por pocillo; las concentraciones de interferón-beta usadas se eligieron para abarcar el intervalo desde la inhibición m áxima de pr oliferación de c élulas de D audi hasta la au sencia de i nhibición ( es d ecir, pr oliferación
35 completa). S e us aron puntos ex perimentales du plicados para c ada concentración de mutante de i nterferón-beta probada, y se incluyó un grupo duplicado de células sin tratar en todos los experimentos. Las células se incubaron durante dos días a 37 ºC en incubadores con un 5 % de CO2, después de lo cual se añadió a cada pocillo 1 μCi de timidina tritiada ((metil-3H) timidina. Amersham TRK758) en 50 μl de medio, y se incubó durante otras 4 h. Las células se recogieron usando un recolector de placas LKB, y se midió la incorporación de timidina tritiada usando un
40 lector d e placas b eta LK B. S e promediaron l os v alores ex perimentales d uplicados y s e d eterminaron l as desviaciones estándar. Los datos se dibujaron como cuentas medias por minuto respecto de la concentración de mutante de interferón-beta, y la actividad de cada mutante se definió como la concentración necesaria para dar un 50 % de l a inhibición máxima observada del crecimiento. Se realizaron múltiples ensayos para cada mutante. La Figura 4 muestra los resultados expresados como porcentaje de la actividad hallada para interferón-beta-la de tipo
45 silvestre marcado con his en cada experimento.
F. Propiedades de los mutantes de interferón-beta
Se descubrió que el interferón-beta-la de tipo silvestre marcado con histidina tenía actividades en los ensayos
50 antivirales y de antiproliferación que eran alrededor de tres vecesmenoresque las actividades correspondientes halladas para interferón-beta-la de tipo silvestre sin marcar. Debido a que todos los mutantes de interferón-beta AI-E contienen la secuencia señal de his en sus extremos N-terminales, los ef ectos de l as m utaciones s obre l as propiedades de la molécula se determinaron comparando las actividades de estos mutantes en ensayos antivirales, de antiproliferación y de unión para la actividad observada para el interferón-beta-la de tipo silvestre marcado con
55 his. Al hacerlo, se asume que las variaciones en las actividades de los mutantes A1-E, comparadas con el interferónbeta-1a de tipo silvestre marcado con his, son cualitativamente y cuantitativamente más o menos las mismas que los efectos que estas mismas mutaciones tendrían en ausencia de la señal de his N-terminal. La suposición equivalente para construcciones marcadas o fusionadas de otras citocinas solubles es considerada como verdadera por los practicantes de la técnica de mutagénesis de barrido de alaninas, especialmente cuando la actividad funcional in
60 vitro de la construcción marcada o fusionada es cercana a la de la citocina de tipo silvestre, como es el caso aquí.
Véase, por ejemplo, Pearce K.H. Jr, y col., J. Biol. Chem. 272:20595-20602 (1997) yJones J.T., y col., J. Biol. Chem.
273: 11667-11674 (1998)
Los datos mostrados en las Figuras 1-4 sugieren tres tipos de efectos que estuvieron causados por la mutagénesis
5 dirigida. Estos efectos pueden ser ventajosos para el desarrollo de fármacos de interferón en ciertas circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a) mutantes con actividad antivírica superior a la del interferón-beta-1a de tipo silvestre (por ejemplo, mutante C1); (b) mutantes que exhiben actividad tanto en ensayos antivirales como en ensayos de antiproliferación, pero para los cuales la actividad de antiproliferación es desproporcionadamente baja con respecto a la actividad antivírica, comparado con el interferón-beta-1a de tipo silvestre (por ejemplo, mutantes
10 C1, D y DE1); y (c) antagonistas funcionales (por ejemplo, A1, B2, CD2 y DE1), que muestran actividades antiviral y antiproliferativa que s on d esproporcionadamente b ajas con r especto a l a un ión a r eceptor, c omparado c on el interferón-beta-1a de tipo silvestre. Se puede observar que algunos mutantes están incluidos en más de una clase. Estas clases se analizan más adelante. Aunque se han caracterizado estas clases de mutantes con respecto a los ejemplos enumerados, se debería apreciar que otras mutaciones en estas regiones pueden dar como resultado
15 efectos similares, o incluso aumentados sobre la actividad:(a) El mutante C1 posee una actividad antivírica que es aproximadamente seis veces mayor que la del interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his. Se predice que este mutante y otros de este tipo son útiles para reducir la cantidad de interferón-beta que se debe administrar para alcanzar un ni vel dado de ef ecto antiviral. Se espera que reducir la cantidad de proteína administrada reduzca la inmunogenicidad de la proteína, y también puede reducir los efectos secundarios de toxicidades que no se basan en
20 el mecanismo. Se predice que las mutaciones en esta clase son ventajosas en situaciones en las que el beneficio terapéutico de la ad ministración de interferón-beta r esulta de s us ef ectos ant ivirales, y en l as q ue l os ef ectos antiproliferativos contribuyen a la toxicidad o a efectos secundarios indeseados.(b) Las actividades relativas (% de tipo silvestre) de los mutantes sustituidos con alanina en el ensayo antiviral y de antiproliferación se comparan en la Figura 5. Se observan actividades modificadas de forma coordinada (es decir, actividades antivirales y de
25 antiproliferación que difieren por el mismo factor de las actividades del interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his) en la mayoría de los mutantes (los que se encuentran en la línea diagonal). Sin embargo, varios mutantes muestran alteraciones mayores de actividad en un ensayo respecto del otro, comparado con interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his, como evidencia el desplazamiento de la diagonal. Se muestran tres mutantes tales en la T abla 3 más adelante. E l mutante C 1 m uestra un a ac tividad a ntivírica qu e es ~ -6 veces s uperior qu e l a de
30 interferón-beta-la de tipo silvestre marcado con his, pero su actividad en el ensayo de antiproliferación es similar a la del de tipo silvestre. E l m utante C 1 t iene a ctividad antivírica que e stá au mentada en u n f actor de 5, 2 sobre su actividad de antiproliferación respecto del interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his. De forma similar, el mutante D exhibe un 65 % de actividad de tipo silvestre en el ensayo antiviral, pero solamente un 20 % de actividad de tipo silvestre en el ensayo de ant iproliferación, y así tiene actividad antivírica que e stá aumentada 3,4 veces
35 sobre s u actividad de an tiproliferación c omparado c on el t ipo silvestre. E l m utante D E1 ex hibe un 26% de l a actividad de tipo silvestre en el ensayo antiviral, pero solamente un 8,5 % en el ensayo de antiproliferación, y así tiene actividad antivírica que está aumentada 3,0 veces sobre su actividad de antiproliferación comparado con el interferón-beta-1a de t ipo silvestre marcado con his. C uando s e administren a un a c oncentración s uficiente p ara alcanzar un ni vel d eseado d e ac tividad a ntivírica, estas proteínas m utantes m ostrarán ni veles s ustancialmente
40 inferiores de actividad antiproliferativa que la proteína de tipo silvestre. Se predice que las mutaciones de esta clase, como las de la clase (a), son ventajosas en situaciones en las que el beneficio terapéutico de la administración de interferón-beta resulta de sus efectos antivirales, y en las que los efectos antiproliferativos contribuyen a la toxicidad
o a efectos secundarios indeseados.
45 TABLA 3.
Mutante
Actividad ant ivírica ( AV) ( % de tipo silvestre) Actividad a ntiproliferativa ( AP) ( % d e tipo silvestre) AV/AP
C1
571 109 5,2
D
65 19 3,4
DE1
26 8,5 3,0
(c) M utantes c on a ctividades ant ivírica y an tiproliferativa que s on ba jas c on r especto a l a u nión a r eceptor, comparado con el interferón-beta-1a de tipo silvestre marcado con his (véase la Tabla 4 más adelante). El mutante A1 exhibe actividades antiviral y antiproliferativa que son2,0 veces y 1,8 vecesmayoresque la observada para 50 interferón-beta1a de t ipo silvestre marcado con h is, pero s e une al r eceptor af ín de l as c élulas D audi c on u na afinidad que es 29 veces mayor que la del de tipo silvestre. La unión de este mutante al receptor de IFN-beta se aumenta as í a proximadamente 1 5 v eces c omparado c on l as a ctividades antiviral y de a ntiproliferación d e la proteína. De forma similar, los mutantes B2, CD2 y DE1 muestran aumentos de la unión sobre la actividad antivírica de 4,6, 4,6 y 18 veces, respectivamente, y sobre la actividad de antiproliferación de 3,5, 15 y 54 veces. Se predice
55 que estas proteínas son útiles como antagonistas funcionales de la actividad de IFN-beta endógeno, y posiblemente
de otros interferones de tipo I endógenos, debido a que tienen la capacidad de unirse y ocupar el receptor, y sin embargo generan solamente una pequeña f racción de l a r espuesta f uncional e n l as células de i nterés qu e s e observaría con IFN-beta de tipo silvestre.
TABLA 4.
Mutante
Actividad antivírica (AV) (% t.s.) Actividad antiproliferativa (AP) (% t.s.) Actividad de unión a c élulas (% t.s.) Unión/AV Unión/AP
A1
200 180 2900 15 16
B2
7,1 9,2 33 4,6 3,5
CD2
150 46 690 4,6 15
DE1
26 8,5 460 18 54
G. Relación de las muteínas con la estructura tridimensional de interferón
Aunque las estructuras cristalinas publicadas para una forma sin glicosilar de interferón beta murino (T. Senda, S. 10 Saitoh y Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon-β at 2.15 Å Resolution.J. Mol. Biol.
253: 187-207 (1995)) y para interferón alfa-2b humano (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P Trotta, T .L. N agabhushan y M .R. Walter. Z inc M ediated D imer of Human Interferon-α2b R evealed by X -ray Crystallography. Structure. 4: 1453-1463 ( 1996)) han pr oporcionado m odelos para l a estructura pr incipal polipeptídica del interferón beta humano, se ha resuelto recientemente la estructura para el interferón-beta-1a en su
15 estado glicosilado ( M. K arpusas, M . N olte, C .B. B enton, W. M eier, W.N. L ipscomb, y S .E G oelz. The C rystal Structure of Human Interferon-β at 2.2Å resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818 (1997)).
Los resultados de l os análisis de m utación s e pu eden r esumir con r especto a l a es tructura t ridimensional de interferón-beta-1a (no presentada aquí). Ciertas mutaciones crearon una reducción en la actividad (2 a gt;5 veces
20 reducida). Las r egiones m utadas correspondieron a las s ustituciones dadas en las t ablas 1 y 2. Lo s r esiduos importantes par a l a ac tividad ant ivírica y de ant iproliferación s e l ocalizan en l a mitad i nferior d e l a m olécula d e IFNbeta-1a (panel a y b). Las mutaciones en la mitad superior de la molécula, en la que están situados los extremos amino-y carboxi-terminal, no tuvieron efecto sobre las actividades biológicas o sobre la unión a receptor.
25 Las mutaciones en la hélice A2, bucles AB, AB2 y hélice E son las más significativas en su efecto sobre la función, y dieron como resultado una reducción drástica tanto en la actividad como en la unión a receptor de superficie celular. Esta región (hélice A2, bucles AB y AB2 y hélice E) corresponde al sitio de unión de IFNAR2, ya que ninguno de estos mutantes unió IFNAR/Fc en el ensayo.
30 Aunque esas mutaciones que eran importantes para la unión a IFNAR2 también afectaron a la unión celular, las propiedades de unión a superficie celular también están influenciadas por residuos en otras regiones de la molécula (hélice B1, hélice C2). Se puede observar en los modelos tridimensionales (no presentados aquí) que describen los efectos de los mutantes por sustitución con alanina que las regiones N-terminal, C-terminal y hélice C glicosilada de la molécula de IFN-beta-1a no se encuentran dentro del sitio de unión a receptor. Las mutaciones en estas regiones
35 no redujeron la actividad biológica o la unión a receptor de superficie celular.
REFERENCIA
EJEMPLO 2: Preparación y caracterización de interferón-beta-1a conjugado
A. Preparación de interferón PEGilado.
B.
Se diluyó intermedio en bruto de interferón-beta-1asin formular(vendido comoAVONEX®) a 250 μg/mlen fosfato sódico 100 mM de pH 7, 2, NaCl 200 mM) con un volumen igual de MES 100 mM de pH 5,0, y el pH se ajustó a 5,0
45 con H Cl. La m uestra se cargó en un a columna S P-Sepharose® F F ( Pharmacia, P iscataway, N J) a 6 mg de interferón-beta-1a/ml de resina. La columna se lavó con fosfato sódico 5 mM de pH 5,5, NaCl 75 mM, y el producto se eluyó con fosfato sódico 30 mM de pH 6,0, NaCl 600 mM. Se analizaron l os valores de abs orbancia de l as fracciones de elución a 280 nm, y la concentración de interferón de las muestras se estimó a partir de la absorbancia usando un coeficiente de extinción de 1,51 para una solución de l mg/ml.
50 A una solución de 1 mg/ml del interferón-beta-1a del eluido de SP se le añadió fosfato sódico 0,5 M de pH 6,0 hasta 50 mM, cianoborohidruro sódico (Aldrich, Milwaukee, WI) a 5 mM, y aldehído de PEG 20K (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) a 5 mg/ml. La muestra se incubó a temperatura ambiente durante 20 horas. El interferón pegilado se
purificó de los productos de reacción mediante etapas de cromatografía secuenciales en una columna de separación por tamaño de FPLC Superose ® (Pharmacia) con fosfato sódico 5 mM de pH 5,5, NaCl 150 mM como fase móvil y SP-Sepharose® FF. La columna de separación por tamaño dio como resultado la separación inicial de interferón beta modificado y sin modificar (cromatograma no presentado aquí). La mezcla de elución que contenía PEG5 interferón beta procedente de la filtración en gel se diluyó 1:1 con agua y se cargó a 2 mg de interferón beta/ml de resina en una columna de SP-Sepharose®. La columna se lavó con fosfato sódico 5 mM de pH 5,5, NaCl 75 mM, y después el interferón beta pegilado se eluyó de la columna con fosfato sódico 5 mM de pH 5,5, NaCl 800 mM. Se analizó el contenido de proteína en las fracciones de elución mediante absorbancia a 280 nm. La concentración de interferón pegilado se informa en equivalentes de interferón, ya que el resto de PEG no contribuyó a la absorbancia
10 a 280 nm.
B. Caracterización bioquímica del interferón PEGilado.
Se analizó el grado de modificación en las muestras mediante SDS-PAGE (gel no presentado aquí). La adición de
15 un único PEG dio como resultado un desplazamiento en la masa aparente de interferón de 20 kDa a 55 kDa, que fue fácilmente aparente en el análisis. En la muestra pegilada no había indicios de interferón-beta-1a sin modificar ni de formas con masa superior resultantes de la presencia de grupos PEG adicionales. La presencia de un único PEG se verificó mediante e spectrometría de masas M ALDI. La especificidad de l a r eacción de peg ilación s e analizó mediante cartografía de péptidos. Se digirieron alícuotas de 20 μg de interferón-beta-1a p egilado y s in modificar
20 como control, en 240 μl de Tris-HCl 200 mM de pH 9,0, EDTA 1 mM con 1,5 μg de lisilendopeptidasa de Achromobacter (Wako Bioproducts, Richmond, VA) durante 3-4 horas a 27 ºC. Se añadieron 200 mg de guanidina HCl a cada muestra y los productos de escisión se fraccionaron en una columna Vydac C4 (0,46 x 25 cm) usando un gradiente de 30 min desde 0 hasta 70 % d e acetonitrilo, en 0, 1 % d e TFA con un caudal de 1, 4 ml/min. Se monitorizó la absorbancia a 214 nm en el efluente de la columna.
25 Los resultados del análisis se m uestran en la F igura 6 . T odos l os péptidos pr edichos de l a di gestión c on lisilendopeptidasa de interferón-beta-1a se han identificado mediante secuenciación N-terminal y espectrometría de masas y de éstos, solamente el péptido que contiene el extremo N -terminal de interferón (AP8) se alteró por la modificación, como es evidente por su desaparición del gráfico. Los datos de cartografía indican, por lo tanto, que el
30 resto de PEG está unido específicamente a este péptido. Los datos indican además que la modificación con PEG se dirige al extremo N -terminal de la proteína, ya que solamente la modificación N -terminal daría como resultado la pérdida específica de este péptido.
Se obtuvieron indicios adicionales para esta conclusión aislando el péptido N-terminal PEGilado de la digestión con
35 lisil-endopeptidasa, digiriendo el péptido ad icionalmente c on br omuro d e cianógeno ( CNBr) y s ometiendo a esta muestra a análisis de secuencia mediante descomposición metaestable por desorción/ionización con láser asistida por matriz (MALDI PSD). La digestión con CNBr del péptido N-terminal escindirá adicionalmente este péptido en dos fragmentos, la metionina terminal (M1) que contiene el resto de PEG y SYNLLGFLQR (residuos 2-11 de l a secuencia de interferón beta maduro). El análisis de la secuencia identificó el péptido sin modificar SYNLLGFLQR,
40 que era el resultado predicho de este tratamiento.
La actividad antivírica de l as m uestras de i nterferón-beta-1a se an alizó c on células de c arcinoma de pul món humanas (células A549) que se habían expuesto a virus de encefalomiocarditis (EMC) usando los procedimientos que implican la tinción con MTT resumidos anteriormente. En resumen, las células A549 se pretrataron durante 24
45 horas con interferón-beta-1a o interferón-beta-1a modificado con PEG (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 pg/ml) antes de la exposición al virus. El ensayo se realizó usando puntos duplicados para cada concentración de interferón-beta-1a. Las desviaciones estándar se muestran como barras de error en la Figura 7. La concentración de interferón-beta-1a (formulada o en bruto) que ofreció el 50 % de destrucción viral (el quot; efecto citopático del 50 % quot;) (50 % de la DO450 máxima) fue de alrededor de 11 pg/ml, y el
50 efecto citopático del50 % para interferón-beta-1a modificado con PEG fue alrededorde 11 pg/ml. Por lo tanto, la conjugación de PEG no alteró la actividad antivírica de interferón-beta-1a. En este ensayo, se descubre de forma rutinaria que la actividad específica de interferón-beta-1a es alrededor de 10 veces mayor que la actividad específica de i nterferón-beta-1b, y por l o t anto i nterferón-beta-1a P EGilado e s s ignificativamente más a ctivo qu e c ualquier producto de interferón-beta1b.
55 Se PEGiló también interferón-beta-1a con un resto de PEG 5K-aldehído que se adquirió de Fluka, Inc. (cat. n.º 75936, Ronkonkoma, NY) siguiendo el mismo protocolo descrito para la modificación con aldehídos de P EG 20K, excepto que la reacción contenía 2 mg/ml de PEG 5K. La modificación con el PEG5K fue también sumamente específica para el extremo N-terminal y no alteró la actividad antivírica de interferón-beta-1a. Como el aducto 20K, el
60 interferón-beta-1a m odificado c on P EG 5K f ue i ndistinguible del interferón-beta-1a s in m odificar e n el en sayo antiviral.
EJEMPLO DE REFERENCIA 3: La PEGilación protege al interferón-beta-1a de la agregación inducida por agresión
5 La agregación de interferón beta es un efecto perjudicial para la actividad. Previamente se ha demostrado que la glicosilación tiene un efecto drástico sobre la estabilidad de interferón-beta-1a respecto de las formas sin glicosilar de interferón beta, y se ha deducido que la glicosilación contribuye a la actividad específica superior de interferónbeta-1a (Runkel L. y c ol. Pharm. R es. 15: 64 1-649). P ara investigar s i l a c onjugación c on p olímero de
10 polialquilenglicol podría estabilizar adi cionalmente i nterferón beta, s e sometió al i nterferón-beta-1a PEGilado a agresión térmica usando el siguiente protocolo:
Se llevó a cabo la desnaturalización térmica usando un espectrofotómetro de UV-visible CARY 3 con un soporte de cubetas controlado por or denador y c alentado de f orma termoeléctrica. L as soluciones de i nterferón-beta-1a e n 15 HEPES 20 mM de pH 7,5, NaCl 20 mM se equilibraron a 25 ºC en una cubeta de 1 ml. La temperatura del soporte de cubetas se elevó de 25 ºC a 80 ºC a una velocidad de 2 ºC/min, y la desnaturalización de la proteína se siguió mediante m onitorización c ontinua de l a a bsorbancia a 280 nm. S e obt uvo e l p unto medio del suceso de desplegamiento cooperativo, Tm, a partir de las curvas de desnaturalización, determinando la temperatura a la que la absorbancia medida estuvo a medio camino entre los valores definidos por las líneas extrapoladas de las regiones
20 lineales de cada lado de las transiciones de desplegamiento cooperativo.
Los r esultados de e ste a nálisis s e m uestran en l a F igura 8. M ientras el interferón-beta-1a s in P EGilar s e desnaturalizó y agregó con un punto de transición del 50 % a 60 ºC, no hubo indicios de agregación para el interferón PEGilado incluso a 80°C. En un análisis independiente, se amplió el tratamiento de agresión térmica a 95
25 ºC, e incluso a esta temperatura más elevada no se observaron indicios de agregación. Por lo tanto, la conjugación con este polímero de polietilenglicol tiene un efecto profundo y beneficioso para la estabilidad de la proteína. Se observó una estabilización similar con interferón-beta-1a modificado que contenía los PEG de 20K y 5K.
EJEMPLO DE REFERENCIA 4. Medida de la actividad antivírica de interferón-beta-1a en el plasma de ratones 30 tratados con interferón-beta-1a e interferón-beta-1a PEGilado
Se inyectaron i.v. a r atones (C57B1/6) por medio de la vena de l a cola 50.000 unidades de i nterferón-beta-1a o
50.000 unidades de interferón-beta-1a PEGilado que contenía PEG 20K o un volumen igual de tampón fosfato dado como control. La sangre de estos ratones se obtiene por medio de extracciones retroorbitales en diferentes tiempos
35 después de la inyección (inmediatamente, 0,25, 1,4, 24 y 48 horas). Se extrae sangre al menos a 3 ratones para cada t iempo. L a sangre completa s e r ecoge e n t ubos q ue c ontienen an ticoagulante, las células se eliminan y el plasma resultante se congela hasta el momento del ensayo. Estas muestras de plasma se analizan después en ensayos antivirales.
40 Las muestras de plasma se diluyen 1:10 en medios sin suero y se pasan a través de un filtro de jeringa de 0,2 um. Las muestras diluidas se analizan en ensayos antivirales. Las muestras se titulan en pocillos designados de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contiene células A549. Se ensayaron en cada placa diluciones de un interferón-beta-1a patrón (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 y 0,6 U/ml) y de cuatro muestras de plasma. Las células A549 se pretratan con muestras de plasma diluido durante 24 horas antes de la exposición a virus EMC. Después de una
45 incubación de dos días con virus, las células viables se tiñen con una solución de MTT (a 5 mg/ml en tampón fosfato) durante 1 hora, se lavan con tampón fosfato y se solubilizan con HCl 1,2 N en isopropanol. Los pocillos se leyeron a 450 nm. Se generan curvas patrón para cada placa y se usan para determinar la cantidad de actividad de interferón-beta-1a en cada muestra de prueba. La actividad en las muestras de los diferentes ratones se representa gráficamente respecto de los tiempos en la Figura 9.
50 La pérdida menor de interferón-beta-1a PEGilado de la circulación como función del tiempo indica que la semivida de la muestra PEGilada es mucho más larga que la del control de interferón-beta-1a sin tratar. Mientras el control se aclaró en gran medida después de 4 h, se detectó una fracción significativa del producto PEGilado después de 48 h. Basándose en los niveles iniciales de actividad en suero y los que permanecen después de 48 h, se deduce que la
55 semivida del interferón PEGilado se alarga cuando se compara con la semivida del interferón-beta-1a sin modificar. Un segundo hallazgo sumamente significativo del estudio fue que se perdió muy poca cantidad de la forma PEGilada durante la fase de distribución, como se demuestra por los niveles elevados similares de actividad a tiempo 0 y después de 60 min. Los datos indican que, a diferencia del interferón-beta-1a de control, la distribución del producto PEGilado se limita en gran medida a la vasculatura.
EJEMPLO DE REFERENCIA 5: Farmacocinética y farmacodinámica comparativas en primates (protocolos generales)
Se llevan a cabo estudios comparativos con conjugados de polímero-interferón-beta 1a e interferón-beta 1a nativo
5 (como i nterferón-beta-1a i ntermedio e n br uto sin f ormular en f osfato sódico y N aCl, pH 7, 2) para det erminar su estabilidad y actividad relativas en primates. En estos estudios, se compara la farmacocinética y la farmacodinámica del conjugado de polímero-interferón-beta 1a en primatescon la del interferón-beta 1a nativo, y las deducciones razonables se pueden ampliar a los seres humanos.
10 Animales y métodos Diseño del estudio
Este es un estudio de grupo paralelo, y de dosis repetida para evaluar la farmacocinética y la farmacodinámica 15 comparativas de interferón-beta-1a conjugado y sin conjugar.
Se usaron primates sanos (preferiblemente monos rhesus) para este estudio. Antes de la dosis, se valorarán signos de enfermedad en todos los animales por un veterinario de animales de laboratorio en dos ocasiones dentro de los 14 dí as a nteriores a l a ad ministración d el ar tículo de e nsayo; una evaluación de be ser dent ro de las 24 horas
20 anteriores a la primera administración del artículo de ensayo. Solamente los animales sanos recibirán este artículo de ensayo. Las evaluaciones incluirán un examen físico general y extracciones de sangre anteriores a la dosis para determinar la patología clínica inicial y la concentración de anticuerpos inicial para interferón-beta-1a. Todos l os animales s e pe sarán y s e registrarán l as t emperaturas c orporales d entro de l as 24 hor as an teriores a l as administraciones del artículo de ensayo.
25 Se ut ilizan y s e a signan do ce s ujetos a gr upos par a r ecibir 1 M U/kg de i nterferón-beta-1a c omo c onjugado de PEGinterferón-beta-1a o sin conjugar, pero por lo demás interferón-beta-1a idéntico. La administración es por vía subcutánea (SC) o intravenosa (IV). Todos los animales deben no haber sido sometidos a t ratamiento previo con interferón-beta. A cada animal se le administrará la dosis en dos ocasiones; las dosis irán separadas por cuatro
30 semanas. El volumen de dosis será de 1,0 ml/kg.
Se extrae sangre para las pruebas farmacocinéticas en diversos intervalos de tiempo después de cada inyección. También s e ex traen muestras de s angre para l as m edidas del m arcador de respuesta biológica inducida po r interferón, neopterina sérica, después de la administración del fármaco en estudio.
35 Las ev aluaciones durante el periodo de estudio i ncluyen observaciones clínicas r ealizadas 30 m inutos y 1 h ora postdosis en bu sca de s ignos d e t oxicidad. S e r ealizarán ob servaciones diarias en l as j aulas y se r egistrará la apariencia ge neral, s ignos d e t oxicidad, molestias y c ambios en el c omportamiento. Los pe sos corporales y l as temperaturas corporales se registrarán a intervalos regulares durante 21 días postdosis.
Métodos de ensayo
Las concentraciones de interferón beta en suero se cuantifican usando un bioensayo de efecto citopático (ECP). El ensayo de ECP mide los niveles de actividad antivírica mediada por interferón. El nivel de actividad antivírica en una
45 muestra refleja el número de moléculas de interferón activo contenidas en esa muestra en el momento en el que se extrae la sangre. Esta aproximación ha sido el método estándar para analizar la farmacocinética de interferón beta. El en sayo d e E CP u sado en el e studio ac tual de tecta l a capacidad de interferón bet a par a proteger células d e carcinoma de pulmón humanas (A549, n.º CCL-185, ATCC, Rockville, MD) a partir de la citotoxicidad debida al virus de encefalomiocarditis (EMC). Las células se preincuban durante 15 a 20 horas con muestras de suero para permitir
50 la inducción y s íntesis de p roteínas i nducibles por interferón que de spués pr ovocan una respuesta ant iviral. Después, s e a ñade el v irus EMC y s e i ncuba d urante 30 ho ras a dicionales antes de ha cer e l a nálisis de l a citotoxicidad usando una tinción de violeta cristal. Se analiza un patrón de interferón beta interno, así como un patrón interno de c onjugado con PEG, de forma concurrente con las muestras en cada placa de ensayo. Este patrón se calibra con respecto a un patrón de referencia de interferón natural de fibroblastos humanos (WHO Second
55 International S tandard f or I nterferon, H uman F ibroblast, Gb-23-902-53). C ada pl aca de e nsayo t ambién incluye pocillos de control de crecimiento celular que no contienen ni interferón beta de ningún tipo ni EMC, y pocillos de control viral que contienen células y EMC pero sin interferón beta. Las placas de control que contienen el patrón y las muestras también se preparan para determinar el efecto, si procede, de las muestras sobre el crecimiento celular. Estas placas se tiñen sin la adición de virus.
60 Las muestras y los patrones se analizan por duplicado en cada una de las dos placas de ensayo duplicadas, lo que produce cuatro puntos por muestra. Se informa la concentración media geométrica de los cuatro duplicados. El límite de detección en este ensayo es 10 unidades (U)/ml.
5 Las concentraciones séricas de neopterina se determinan en la unidad de farmacología clínica usando ensayos disponibles comercialmente.
Farmacocinética y métodos estadísticos
10 Se usa el programa informático RstripTM (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) para ajustar los datos a modelos farmacocinéticos. S e t razan l as c oncentraciones m edias geométricas p or t iempo p ara c ada gr upo. Y a que l os resultados del ensayo se expresan en diluciones, las medias geométricas se consideran más apropiadas que las medias aritméticas. Las concentraciones de interferón sérico se ajustan a los valores iniciales y las concentraciones séricas indetectables se establecen en 5 U/ml, que representa un medio del límite de detección inferior.
15 Para los datos de infusión IV, se ajusta un modelo de infusión IV de dos compartimentos a las concentraciones séricas detectables para cada sujeto, y los datos SC se ajustan a un modelo de inyección de dos compartimentos.
Se calculan los siguientes parámetros farmacocinéticos: 20
(i)
concentración máxima observada, Cmáx (U/ml);
(ii)
área bajo la curva de 0 a 48 horas, AUC usando la regla trapezoidal:
(iii) semivida de eliminación:
y de los datos de infusión IV (si se emplea IV): 25 (iv) semivida de distribución (h);
(v)
depuración (ml/h);
(vi)
volumen aparente de distribución, Vd (L).
Se usa del programa informáticoWinNonlin (Scientific Consulting Inc., Apex, NC) paracalcular las semividas de 30 eliminación después de inyección SC e IV.
Para neopterina, se presentan las medias aritméticas por tiempo para cada grupo. Se calcula Emáx, la máxima carga a partir del valor inicial. Cmáx, AUC y Emax se someten a un análisis de varianza de un factor para comparar grupos de dosis. Cmáx y AUC se transforman de forma logarítmica antes del análisis; se informan las medias geométricas.
EJEMPLO DE REFERENCIA 6: Evaluación comparativa de la farmacocinética de interferón beta-1a PEGilado e interferón-beta-1a en monos rhesus
Materiales y métodos
40 Se administró interferón beta-1a o IFN beta-1a PEGilado a monos rhesus en el día 1 y otra vez en el día 29 por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC) como se describió en el protocolo general del Ejemplo 5. El día 1, seis monos recibieron IFN beta-1a (3 por vía) y otros seis monos recibieron IFN beta-1a PEGilado (3 por vía). El día 29 las dosis se repitieron. La dosis IV se administró como una inyección en embolada lenta en una vena cefálica o safena.
45 La dosis SC se administró bajo la piel de la espalda después de afeitar el sitio de inyección. Se recogió sangre por medio de la vena femoral en los tiempos especificados y se dejó coagular para obtener suero. Se analizaron las concentraciones de sustancias farmacológicas funcionales en el suero usando un método de ECP antiviral validado, y las concentraciones de neopterina y beta2-microglobulina sérica como medidas farmacodinámicas de la actividad.
50 Se c alcularon los par ámetros f armacológicos u sando e l programa i nformático WinNonlin v ersión 2. 0 ( Scientific Consulting Inc., Apex, NC).
Los datos de c oncentración s e analizaron mediante m étodos i ndependientes de m odelo e stándar ( análisis n o compartimental) para obtener los parámetros farmacocinéticos. Se calculó el área bajo la curva (AUC) usando la 55 regla trapezoidal. Los análisis estadísticos, que incluyen la media aritmética y la desviación estándar, se realizaron usando d el pr ograma i nformático M icrosoft E xcel v ersión 5. 0 ( Microsoft C orp., R edmond WA). Los v alores d e concentración informados como inferiores a los límites de cuantificación (BLQ) no se usaron en el análisis farmacocinético. Debido al hecho de que diferentes ordenadores y programas informáticos redondean o truncan los números de forma diferente, los valores en algunas tablas (por ejemplo, medias, desviaciones estándar o valores 60 individuales) pueden diferir ligeramente de los de otras tablas, a partir de los datos calculados de forma individual, o
a partir de los datos de los análisis estadísticos. Ni la integridad ni la interpretación de los datos se vio afectada por estas diferencias.
Resultados y análisis
Dentro de cada vía de administración, IFN beta-1a pegilado exhibió una biodisponibilidad superior (tal como se mide mediante el ár ea ba jo la curva de c oncentración sérica-tiempo). A demás, el IFN be ta-1a pegi lado tuvo un a biodisponibilidad absoluta superior comparado con IFN beta-1a cuando se administró por vía SC. Se resumen los parámetros farmacocinéticosen la Tabla 5. La administración de IFN beta-1a pegilado por ambas vías IV y SC da
10 como resultado un aumento de la semivida, así como el AUC de IFN beta-1a.
TABLA 5:
MU/kg de IFN b-1a o IFN b-1a pegilado con respecto a monos Rhesusa
Formulación ( vía de administración)
Cmáx Tmáx AUC U*h/ml CL (ml/kg) Vss (ml/kg) T1/2
IFN B-1a (IV)
6400 (±0) 0,083 (±0) 4453 (±799) 229 (±38) 543 (±147) 3,2 (±1,4)
IFN-b-1a pegilado (IV)
10800 (±3811) 0,083 (±0) 34373 (±3601) 29 (±3) 250 (±30) 9,5 (±2,1)
IFN B-1a (SC)
277 (±75) 5,3 (±1,2) 4753 (±3170) N/A N/A 10,0 (±2,9)
IFN B-1a pegilado (SC)
1080 (±381) 3,3 (±1,2) 42283 (±5934) N/A N/A 22,0 (±3,4)
an = 3
Después de la administración IV de la primera dosis, las concentraciones séricas máximas (Cmáx) medias (± desv.
15 est.) de IFN beta-1a e IFN beta-1a pegilado fueron 6400 (± 0) y 10800 (± 3,5) U/ml, respectivamente. Los valores de AUC medios (± Desv. Est.) fueron 4453 (± 799) y 34373 (± 3601) U*h/ml, respectivamente. Después de la primera administración SC, la Cmáx media (± desv. est.) de IFN beta-1a e IFN beta-1a pegilado fueron 277 (± 75) y 1080 (± 381) U/ml, respectivamente. Los valores de AUC medios (± Desv. Est.) fueron 4753 (± 3170) y 44952 (± 1443) U*h/ml, respectivamente.
20 Las concentraciones de neopterina sérica y beta2-microglobulina sérica fueron elevadas después del tratamiento con IFN-beta e IFN-beta pegilado, lo que indica actividad farmacológica de los productos. A las dosis elevadas de los compuestos de prueba usados, no hubo diferencia en la actividad farmacológica de IFN beta-1a e IFN beta-1a pegilado por ninguna vía de administración (datos no mostrados).
25 EJEMPLO DE REFERENCIA 7: Análisis comparativo de la farmacocinética de interferón beta-1a pegilado e interferón-beta-1a en ratas después de diversos modos de administración
El propósito de este estudio fue determinar la biodisponibilidad comparativa de interferón beta-1a e interferón beta1a 30 pegilado mediante diversas vías de administración.
Materiales y métodos:
Se us aron r atas Lew is he mbra ( 190 gr amos cada un a) par a l os aná lisis f armacocinéticos con d os r atas por
35 vía/formulación. S e aplicó un a c ánula y ugular y s e ad ministró i nterferón b eta-1a h umano o i nterferón b eta-1a humano 5K PEGilado o un interferón beta-1a humano 20K PEGilado (en un vehículo que consistía en 14 mg/ml de HSA en fosfato sódico 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2) de forma intravenosa, intraperitoneal, oral, subcutánea o intratraqueal. La sangre se procesó varias veces a lo largo de un período de 72 horas a los 0, 5 min, 15 min, 30 min, 75 min, 3 h, 24 h, 48 h y 72 h. El protocolo se presenta en la Tabla 6. El bioensayo de efecto citopático (CPE) se
40 llevó a cabo con lasmuestras de suero para detectar interferón-beta en el suero.Los resultados generados con interferón beta-1a sin modificar e interferón beta-1a pegilado con PEG 20K se presentan en la Tabla 7. En todos los casos la pegilación dio como resultado aumentos significativos en t½ y AUC.
TABLA 7
Parámetros farmacocinéticos después de administración IV, SC, IP o IT de interferón beta-1a (IFN) e IFN-beta 1a pegilado (IFN-PEG) en ratas
Formulación (vía de administración)
Cmáx (U/ml) Tmáx(h) AUC/Dosis ( U h)/(ml ug) T1/2(h)
IFN (dosis IV, 20 ug)
64000 0,25 3035 1,25
IFN-PEG (dosis IV, 3 ug)
23970 0,08 47728 8,44
IFN (dosis SC, 20 ug)
2400 1,00 464,4 0,96
UFN-PEG (dosis SC, 3 ug)
2400 7,00 14688 11,9
IFN (dosis IP, 20 ug)
26000 1,25 4159 1,53
IFN-PEG (dosis IP, 3 ug)
9700 1,25 52148 16,2
IFN (dosis IT, 15 ug)
240 1,5 70,7 1,29
IFN-PEG (dosis IT, 15 ug)
270 7,0 233,5 6,21
5 EJEMPLO DE R EFERENCIA 8 : Efe cto a nti-angiogénico d e i nterferón b eta-1a c onjugado c on p olímero: Análisis de la capacidad de interferón-beta-1a PEGilado para inhibir la proliferación de células endoteliales in vitro
Se mantienen en c ultivo c élulas end oteliales venosas humanas (Cell Systems, cat. n.º 2V0-P75) y c élulas endoteliales m icrovasculares dér micas hu manas ( Cell S ystems, c at. n .º 2M 1-C25) c on C S-C Medium K it ( Cell
5 Systems, c at. n .º 4 Z0-500). Veinticuatro hor as a ntes de l ex perimento l as células s e t ratan con tripsina, y se resuspenden en medio de ensayo, 90 % de M199 y 10 % de suero bovino fetal (FBS), y se ajustan a la densidad celular deseada. Después las células se colocan en pl acas de 24 o 96 po cillos revestidas con gelatina, a 12. 500 células/pocillo o a 2,000 células/pocillo, respectivamente.
10 Después de incubar durante la noche, el medio de ensayo se sustituye con medio fresco que contiene 20 ng/ml de Fibroblast Growth Factor (Becton Dickinson, cat. n.º 40060) básico recombinante humano y diversas concentraciones de pr oteínas de i nterferón-beta-1a c onjugadas y s in c onjugar o c ontrol pos itivo ( se pue de u sar endostatina como control positivo, como se podría hacer con un anticuerpo para bFGF). El volumen final se ajusta a 0,5 ml en la placa de 24 pocillos o 0,2 ml en la placa de 96 pocillos.
15 Después de setenta y dos horas, las células se tratan con tripsina para contarlas en un Coulter, se congelan para la lectura de fluorescencia con CyQuant, o se marcan con [3H] timidina. La inhibición de la proliferación de células endoteliales i n v itro m ediante i nterferón-beta 1a c onjugado y s in c onjugar f ue c omparable, l o que i ndica q ue la PEGilación no interfirió con la capacidad del interferón para funcionar en esta situación.
20 Este ensayo in vitro analiza los efectos sobre la proliferación de células endoteliales de las moléculas de interferónbeta humano de la invención, que pueden ser indicativos de efectos anti-angiogénicos in vivo. Véase O'Reilly. M.S.,
T. Boehm. Y. Sbing, N. Fukal, G. Vasios. W. Lane, E. Flynn. J. Birkhead, B. Olsen, y J. Folkman. (1997). Endostatin:
An Endogenous Inhibitor of Angiogensis and Tumour Growth. Cell 88, 277-285. 25
EJEMPLO D E R EFERENCIA 9 : M odelo i n v ivo p ara a nalizar l os e fectos a nti-angiogénicos y d e neovascularización del interferón-beta-1a conjugado
Se ha des arrollado una di versidad de modelos par a an alizar l os ef ectos ant i-angiogénicos y d e
30 antineovascularización de las moléculas descritas en el presente documento. Algunos de estos m odelos s e han descrito en las patentes de Estados Unidos 5.733.876 (31 de marzo de 1998: quot;Method of inhibiting angiogenesis) y5.135.919 (4 de agosto de 1992:quot; Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesisquot;). Otros ensayos incluyen el ensayo de la membrana corioalantoidea (MCA) sin cáscara de S. Taylor y J. Folkman; Nature, 297.307 (1982) y R.Crum. S.Szabo y J.Folkman; Science. 230.1375 (1985); el modelo de antiangiogénesis
35 del método de saco de aire dorsal en ratón de Folkman, J. y col.; J.Exp.Med.,133,275 (1971) y el ensayo de microbolsa corneal en r ata de G imbrone. M .A J r. y c ol.. J . N atl. C ancer I nst 5 2,413(1974) en e l que l a vascularización corneal s e i nduce en r atas m acho ad ultas de la r aza S prague-Dawley ( Charles R iver. J apón) implantando miniesferas de 500 ng de FGF básico (bovino, R & D Systems, Inc.) impregnado con EVA (copolímero de etileno-acetato de vinilo) en cada córnea.
40 Otros métodos para analizar los efectos anti-angiogénicos de interferón-beta murino PEGilado en un modelo animal incluyen (pero no se limitan a) los protocolos para cribar nuevos agentes antineoplásicos potenciales como se describe en the original Cancer Chemotherapy Reports. Parte 3. Vol. 3, N.º 2, septiembre de 1972y en el suplemento InVivo Cancer Models. 1976-1982, Publicación NIH N.º 84-2635, febrero de 1984.
45 Debido a las barreras entre especies de l os interferones de tipo I, para analizar la actividad anti-angiogénica de interferón-beta conjugado con polímero en modelos de roedores, se generan preparaciones de interferón-beta de roedor conjugado con polímero. Tales métodos de cribado se ejemplifican mediante un protocolo para analizar los efectos anti-angiogénicos del interferón-beta murino pegilado sobre el carcinoma pulmonar de Lewis implantado de
50 forma subcutánea.
Origen de la línea tumoral.
Apareció de forma espontánea en 1951 como un carcinoma de pulmón en un ratón C57BL/6.
55 Resumen de los procedimientos de ensayo:Se implanta un fragmento de tumor de forma subcutánea en la región axilar de un ratón B6D2F1. El agente de ensayo (es decir, un interferón PEGilado de la invención) se administra en dosis diversas, de forma subcutánea (SC) o intraperitoneal (IP) en múltiples días después de la implantación del tumor. El parámetro medido es el tiempo de supervivencia medio. Los resultados se expresan como un porcentaje
60 del tiempo de supervivencia de control.
Animales:
Propagación: Ratones C57BL/6.
5 Ensayo: Ratones B6D2F1. Peso: Los ratones deberían estardentro de un intervalo de peso de 3 gr con un peso mínimo de 18 g para los machos y 17 g para las hembras. Sexo: Se usa un sexo para todos los animales de ensayo y de control en un experimento. Fuente: Una fuente, si es factible, para todos los animales en un experimento.
Tamaño del experimento:
Diez animales por grupo de ensayo.
15 Transferencia del tumor: PROPAGACIÓN:
Fragmento: Preparar un fragmento de 2-4 mm de un tumor s.c. donante 20 Tiempo: Día 13-15 Localización: Implantar el fragmento s.c. en la región axilar con una punción en la región inguinal.
ENSAYO:
25 Fragmento: Preparar un fragmento de 2-4 mm de un tumor s.c. donante Tiempo: Día 13-15. Localización: Implantar el fragmento s.c. en la región axilar con una punción en la región inguinal.
Calendario de ensayo:
30 Día 0: Implantarel tumor. Establecer cultivos bacterianos. Ensayar el compuesto de control positivo en cada experimento impar. Preparar los materiales. Registrar las muertes diariamente. Día 1:
35 Comprobar los cultivos. Descartar el experimento si está contaminado. Aleatorizar los animales. Tratar como se indicó (en el día 1 y en los siguientes días). Día 2: Volver a comprobar los cultivos. Descartar el experimento si está contaminado. Día 5:
40 Pesar el día 2 y el día de la evaluación inicial de la toxicidad del agente de ensayo. Día 14: Controlar las muertes prematuras. Día 48: Controlar los “no cogidos”.
45 Día 60: Finalizar y evaluar el experimento. Examinar los pulmones macroscópicamente en busca de tumores.
Control de calidad:
50 Programar el calendario del compuesto de control positivo (NSC 26271 (citoxano a una dosis de 100 mg/kg/inyección)) en cada experimento impar, para el que el régimen es intraperitoneal solamente en el día 1. El límite inferior de ensayo/control para el control positivo es el 140 %. El tiempo de supervivencia medio del control sin tratar aceptable es 19-35, 6 días.
55 Evaluación:
El parámetro medido es el tiempo de supervivencia medio. Calcular los pesos corporales medios de los animales para el día 1 y el día 5, calcular la relación ensayo/control para todos los grupos de ensayo. Se calculan los pesos corporales medios de los animales para el día de inicio y el día de la evaluación final. La relación ensayo/control se 60 calcula para todos los grupos de ensayo con gt;65 % de supervivientes en el día 5. Un valor de la relación
ensayo/control lt;86% indica toxicidad. Una diferencia de cambio de peso corporal excesiva (ensayo menos control) se puede usar también al evaluar la toxicidad.
Criterios de actividad:
Una r elación i nicial e nsayo/control m ayor o i gual a l 140 % s e c onsidera necesariamente q ue de muestra una actividad moderada. Un valor de la relación ensayo/control reproducible mayor o igual de 150 % se considera actividad significativa.
10 LISTADO DE SECUENCIAS
lt;110gt; Biogen Idec MA Inc.
lt;120gt; Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos
lt;130gt; F 1455 EP/I S3 15 lt;140gt;09/832,658lt;141gt; 11/04/2001
lt;150gt;PCT/US99/24201lt;151gt; lt;150gt;60/104,572lt;151gt; 16/10/1998 lt;150gt;60/120,161lt;151gt; 16/02/1999
lt;160gt; 40 20 lt;170gt; FastSEQ para Windows Versión 4.0
lt;210gt; 1
lt;211gt; 549
lt;212gt; ADN
lt;213gt; murino 25 lt;400gt; 1
lt;210gt; 2
lt;211gt; 183 30 lt;212gt; PRT
lt;213gt; murino
lt;400gt; 2
lt;210gt; 3
lt;211gt; 60
lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; humano
lt;400gt; 3 ttctccggag acgatgatga caagatgagc tacaacttgc ttggattcct acaaagaagc 60
lt;210gt; 4 10 lt;211gt; 39
lt;212gt; ADN
lt;213gt; humano
lt;400gt; 4
gccgctcgag ttatcagttt cggaggtaac ctgtaagtc 39 15
lt;210gt; 5
lt;211gt; 35
lt;212gt; ADN
lt;213gt; humano
20 lt;400gt; 5 agcttccggg ggccatcatc atcatcatca tagct 35
lt;210gt; 6
lt;211gt; 35 25 lt;212gt; ADN
lt;213gt; humano
lt;400gt; 6 ccggagctat gatgatgatg atgatggccc ccgga 35
30 lt;210gt; 7
lt;211gt; 87
lt;212gt; ADN
lt;213gt; humano
lt;400gt; 7
lt;210gt; 8
lt;211gt; 60
lt;212gt; ADN 40 lt;213gt; humano
lt;400gt; 8 gatctagcaa tgctgcctgt gctgccctcc tggctgcctt gaatgggagg cttgaatact 60
lt;210gt; 9 45 lt;211gt; 52
lt;212gt; ADN lt;213gt; humano
lt;400gt; 9 gcctcaagga caggatgaac tttgacatcc ctgaggagat taagcagctg ca 52
5 lt;210gt; 10
lt;211gt; 76
lt;212gt; ADN
lt;213gt; humano
lt;210gt; 11
lt;211gt; 76
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lt;400gt; 11
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lt;212gt; ADN
lt;213gt; humano
lt;400gt; 12
aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac a 51 25
lt;210gt; 13
lt;211gt; 43
lt;212gt; ADN
lt;213gt; humano
30 lt;400gt; 13 tccctgagga gattgctgca gctgcagctt tcgctgcagc tga 43
lt;210gt; 14
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lt;213gt; humano
lt;400gt; 14
40 lt;210gt; 15
lt;211gt; 78
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lt;400gt; 15
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lt;400gt; 16
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lt;400gt; 17
5 lt;210gt; 18
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lt;213gt; humano
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tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t 51 25
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lt;400gt; 38
10 lt;210gt; 39
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lt;213gt; humano
lt;400gt; 39
lt;210gt; 40
lt;211gt; 166 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; humano
lt;400gt; 40

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición que comprende un interferón-beta-1a o una proteína de fusión que comprende dicho interferón-beta-1a,donde el interferón-beta-1a consiste en la secuencia de aminoácidos
    y donde dicho interferón-beta-la está acoplado a un único polímero de origen no natural en el extremo N-terminal de dicho interferón-beta-la, c omprendiendo dicho polímero un dextrano, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, o alcohol 10 polivinílico.
  2. 2. Una composición qu e comprende un m utante de i nterferón-beta-1a o un a proteína d e f usión que comprende dicho mutante de interferón-beta-1a, donde dicho mutante de interferón-beta-1a consiste en la secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en:
    10 donde dicho mutante de interferón-beta-la está acoplado a un único polímero de origen sintético en el extremo Nterminal d e di cho m utante d e i nterferón-beta-la, c omprendiendo di cho p olímero un d extrano, pol ivinilpirrolidona, poliacrilamida, o alcohol polivinílico.
  3. 3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el polímero es dextrano. 15
  4. 4.
    La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el polímero es polivinil pirrolidona.
  5. 5.
    La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el polímero es poliacrilamida.
    20 6. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el polímero es alcohol polivinílico.
  6. 7.
    Una composición farmacéutica que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
  7. 8.
    Uso de l a c omposición de u na c ualquiera de l as r eivindicaciones 1 -6 par a l a preparación de u n
    5 medicamento par a e l t ratamiento d e t umores y c ánceres, af ecciones aut oinmunes, enfermedades v íricas, o enfermedades angiogénicas.
  8. 9. La c omposición de una cualquiera de las r eivindicaciones 1 -6 par a s u uso en el tratamiento de
    tumores y cánceres, afecciones autoinmunes, enfermedades víricas, o enfermedades angiogénicas. 10
  9. 10. El uso de la reivindicación 8 o la composición de la reivindicación 9, donde dichos tumores y cánceres se seleccionan del grupo que consiste en sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfática aguda,carcinoma de mama, melanoma o carcinoma nasofaríngeo.
    15 11. El uso de la reivindicación 8 o la composición de la reivindicación 9, donde dichas afecciones autoinmunes se seleccionan del grupo que consiste en fibrosis, lupus y esclerosis múltiple.
  10. 12. El us o d e l a r eivindicación 8 o l a composición de la r eivindicación 9, donde d ichas e nfermedades
    víricas se seleccionan del grupo que consiste en infección por ECM, gripe, infecciones del tracto respiratorio, rabia, y 20 hepatitis.
  11. 13. El us o d e l a r eivindicación 8 o l a composición de la r eivindicación 9, donde d ichas e nfermedades angiogénicas se s eleccionan del gr upo que consiste en r etinopatía di abética, r etinopatía de l a pr ematuridad, degeneración m acular, r echazo de injerto corneal, g laucoma neovascular, fibroplasia r etrolenticular, r ubeosis y
    25 síndrome de Osler-Webber.
  12. 14. Un m étodo p ara pr eparar l a c omposición de l a r eivindicación 4, que comprende conjugar di cho interferón-beta 1a con dicho polímero en condiciones de alquilación reductora, donde dicho polímero comprende un resto carbonilo.
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TR (1) TR200101086T2 (es)
WO (1) WO2000023114A2 (es)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU229888B1 (en) * 1998-10-16 2014-11-28 Biogen Idec Ma Inc Cambridge Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses
EE05111B1 (et) * 1998-10-16 2008-12-15 Biogen, Incorporated Interferoon-beetaga sulandatud valgud ja nende kasutamine
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
SK2942002A3 (en) * 1999-08-27 2002-08-06 Maxygen Aps A conjugate exhibiting interferon beta, a nucleotide sequence, an expressing vector, a host cell containing such a nucleotide sequence, method for the preparation thereof, pharmaceutical composition containing the same and its use
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 1999-08-27 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
AU2002212107A1 (en) * 2000-11-02 2002-05-15 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
JP2004534523A (ja) 2001-02-27 2004-11-18 マキシゲン・エイピーエス 新規なインターフェロンβ様分子
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
EP2305312B1 (en) * 2001-10-10 2015-03-04 ratiopharm GmbH Remodelling and glycoconjugation of follicle-stimulating hormone (FSH)
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
DK1476181T3 (en) * 2002-01-18 2016-05-23 Biogen Ma Inc POLYALKYLENE POLYMER COMPOUNDS AND USE THEREOF
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
DE60332358D1 (de) * 2002-09-09 2010-06-10 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
PL377612A1 (pl) * 2002-09-27 2006-02-06 Biogen Idec Ma Inc. Terapie przewlekłej zapalnej polineuropatii demielinizacyjnej z użyciem interferonu-ß
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
RS20050502A (sr) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polimerni konjugati interferona- beta sa povećanom biološkom aktivnošću
PL396711A1 (pl) * 2002-12-26 2011-12-19 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Koniugaty polimerów z cytokinami, chemokinami, czynnikami wzrostu, hormonami polipeptydowymi i ich antagonistami, kompozycja farmaceutyczna i sposób zapobiegania, diagnozowania lub leczenia
CN102212019B (zh) 2003-03-14 2015-05-27 蔚所番有限公司 支化水溶性聚合物及其缀合物
US20050079155A1 (en) * 2003-03-20 2005-04-14 Xencor, Inc. Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages
BRPI0408946A (pt) * 2003-03-28 2006-04-04 Biopolymed Inc material biologicamente ativo conjugado com polìmero biocompatìvel com complexo 1:1, seu processo de preparação e composição farmacêutica compreendendo o mesmo
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2004091499A2 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Neose Technologies, Inc. Intracellular formation of peptide conjugates
ES2297423T3 (es) * 2003-05-21 2008-05-01 Ares Trading S.A. Metodo de analisis cromatografico de una solucion proteica.
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
EP1666496B1 (en) 2003-08-25 2014-03-12 Toray Industries, Inc. Interferon-beta composite
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US8361961B2 (en) 2004-01-08 2013-01-29 Biogenerix Ag O-linked glycosylation of peptides
US8778880B2 (en) 2004-02-02 2014-07-15 Ambrx, Inc. Human growth hormone modified at position 35
JP2007526317A (ja) * 2004-03-01 2007-09-13 エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド インターフェロン−ベータ・ポリマー結合体
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
WO2006004959A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
CA2593682C (en) 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20070092486A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
EP1951285A2 (en) * 2005-11-18 2008-08-06 Ares Trading S.A. Interferon in influenza
US8334257B2 (en) 2005-12-20 2012-12-18 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
WO2007110231A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Nautilus Biotech, S.A. MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
EP2010222A1 (en) 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
EP2059527B1 (en) 2006-09-01 2014-12-03 Novo Nordisk Health Care AG Modified glycoproteins
CA2663300C (en) * 2006-09-15 2014-10-07 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of box-a of hmgb1 and box-a variants of hmgb1
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
PT2101821E (pt) 2006-12-15 2014-10-03 Baxter Int Fator conjugado viia-ácido (poli)siálico com prolongamento do tempo de meia vida in vivo
CA2673398A1 (en) * 2006-12-19 2008-07-03 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Coadministration of alpha-fetoprotein and an immunomodulatory agent to treat multiple sclerosis
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
EP2076533B1 (en) 2007-05-02 2014-10-08 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
ES2597849T3 (es) * 2007-10-09 2017-01-23 Polytherics Limited Proteínas y péptidos conjugados novedosos
ES2387236T3 (es) 2007-12-20 2012-09-18 Merck Serono S.A. Formulaciones de interferón beta pegilado
US9938333B2 (en) 2008-02-08 2018-04-10 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
CN103497247A (zh) 2008-02-27 2014-01-08 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合的因子viii分子
EA022201B1 (ru) 2008-04-11 2015-11-30 Мерримак Фармасьютикалз, Инк. Агент, способный связываться с опухолевой клеткой, содержащий линкер на основе hsa, и его применение
AU2009240738B2 (en) 2008-04-21 2014-09-11 Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents
PL2318029T3 (pl) 2008-07-23 2018-03-30 Elanco Us Inc. Zmodyfikowane polipeptydy bydlęcego G-CSF i ich zastosowania
JP5677972B2 (ja) 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
WO2010127172A2 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) and methods of use
WO2010142017A1 (en) * 2009-06-09 2010-12-16 Defyrus, Inc . Administration of interferon for prophylaxis against or treatment of pathogenic infection
CN104530182A (zh) 2009-07-27 2015-04-22 利普森技术有限公司 非凝血蛋白的糖基多唾液酸化
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
SG178141A1 (en) 2009-07-27 2012-03-29 Baxter Int Blood coagulation protein conjugates
SG178051A1 (en) 2009-07-27 2012-03-29 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US20120283172A1 (en) 2009-12-21 2012-11-08 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
BR112012015461A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-10 Ambrx Inc polipeptídeos de somatotropina boviina modificados e seus usos
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
EP2606072A4 (en) * 2010-08-19 2016-04-20 Peg Biosciences Inc SYNERGISTIC BIOMOLECULAR POLYMER CONJUGATES
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
AU2011308906B2 (en) * 2010-10-01 2016-06-16 Biogen Ma Inc. Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies
DK2654794T3 (da) 2010-12-22 2020-06-08 Baxalta GmbH Materialer og fremgangsmåder til konjugering af et vandopløseligt fedtsyrederivat til et protein
KR101979045B1 (ko) 2011-10-01 2019-05-15 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물
US20150030564A1 (en) 2012-02-29 2015-01-29 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
US20150202287A1 (en) 2012-08-30 2015-07-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
DK2982686T3 (en) 2013-03-29 2018-10-08 Glytech Inc POLYPEPTIDE WITH SIALYLED SUGAR CHAIN CONNECTED
WO2016013911A1 (ko) 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
JP7105200B2 (ja) 2016-05-13 2022-07-22 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ 標的突然変異体インターフェロン－ベータおよびその使用
CA3052523A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
AU2019215440B2 (en) 2018-02-05 2025-12-04 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
KR20230162013A (ko) 2021-03-26 2023-11-28 이나뜨 파르마 에스.에이. Nk 세포 관여를 위해 사이토카인에 융합된 nkp46-결합 부위, 암 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 단백질
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN117616050A (zh) 2021-06-09 2024-02-27 先天制药公司 与nkp46、细胞因子受体、肿瘤抗原和cd16a结合的多特异性蛋白质
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN118027176B (zh) * 2024-03-27 2024-12-24 郑春杨 人β2-微球蛋白突变体

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2360794C2 (de) * 1973-12-06 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CH596313A5 (es) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
DE3273787D1 (en) 1981-02-04 1986-11-20 Japan Found Cancer Human interferon-beta gene
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
EP0098876A1 (en) 1982-01-19 1984-01-25 Cetus Corporation Multiclass hybrid interferons
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
ATE78262T1 (de) 1985-06-11 1992-08-15 Ciba Geigy Ag Hybrid-interferone.
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4660789A (en) 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DE69233069T2 (de) 1991-03-15 2003-11-27 Amgen Inc., Thousand Oaks Pegylation von polypeptiden
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
AU2147192A (en) 1991-06-28 1993-01-25 Genentech Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
AU3423293A (en) 1991-12-19 1993-07-19 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
AU5098193A (en) 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
HUT75533A (en) * 1993-11-10 1997-05-28 Schering Corp Improved interferon polymer conjugates
DK1090645T3 (da) 1994-02-08 2006-03-27 Amgen Inc Oral tilförsel af kemisk modificerede proteiner
US5545723A (en) 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
FI972443A7 (fi) 1994-12-07 1997-06-09 Novozymes As Polypeptidi, jonka allergeenisuus on vähentynyt
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
AU5773798A (en) 1997-01-29 1998-08-18 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
IL133974A0 (en) 1997-07-14 2001-04-30 Bolder Biotechnology Inc Derivatives of growth hormone and related proteins
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
BR9910023A (pt) * 1998-04-28 2000-12-26 Applied Research Systems Conjugados de poliol-ifn-beta
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
EE05111B1 (et) * 1998-10-16 2008-12-15 Biogen, Incorporated Interferoon-beetaga sulandatud valgud ja nende kasutamine
HU229888B1 (en) * 1998-10-16 2014-11-28 Biogen Idec Ma Inc Cambridge Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
SK2942002A3 (en) * 1999-08-27 2002-08-06 Maxygen Aps A conjugate exhibiting interferon beta, a nucleotide sequence, an expressing vector, a host cell containing such a nucleotide sequence, method for the preparation thereof, pharmaceutical composition containing the same and its use
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
MXPA02006216A (es) 1999-12-22 2004-02-26 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados estericamente impedidos de polimeros solubles en agua.
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Also Published As

Publication number Publication date
CN101062419B (zh) 2016-06-29
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
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DK1121156T3 (da) 2006-06-06
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CN1323225A (zh) 2001-11-21
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US6962978B2 (en) 2005-11-08
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US20070098688A1 (en) 2007-05-03
AU1446500A (en) 2000-05-08
HK1089393A1 (en) 2006-12-01
IS2926B (is) 2015-09-15
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
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HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
PL206536B1 (pl) 2010-08-31
EE200100220A (et) 2002-06-17
BR9915542A (pt) 2001-08-14
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
SK287918B6 (sk) 2012-03-02
SG110047A1 (en) 2005-04-28
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
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JP2014129420A (ja) 2014-07-10
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
CZ299164B6 (cs) 2008-05-07
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
IL142282A (en) 2007-03-08
LT2599503T (lt) 2017-06-26
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
EE200700058A (et) 2008-02-15
NZ510689A (en) 2003-07-25
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27

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