ES2597849T3 - Proteínas y péptidos conjugados novedosos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de preparación de un compuesto de la fórmula general**Fórmula** en la que uno de entre X y X' representa un polímero, y el otro representa un átomo de hidrógeno; cada Q representa independientemente un grupo de enlace; W representa un resto aceptor de electrones o un resto que puede prepararse por reducción de un resto aceptor de electrones; o, si X' representa un polímero, X-Q-W- juntos pueden representar un grupo aceptor de electrones; y además, si X representa un polímero, X' y un grupo W aceptor de electrones junto con los átomos interyacentes pueden formar un anillo; Z representa una proteína o un péptido unido a A y B a través de residuos de histidina contenidos en un marcador de polihistidina unido a dicha proteína o péptido y que contiene de 2 a 12 residuos de histidina; A es una cadena alquileno o alquenileno C1-5; y B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4; que comprende hacer reaccionar (i) un compuesto de la fórmula general**Fórmula** en la que: X, X', Q, A y B tienen los significados proporcionados anteriormente; W' representa un grupo aceptor de electrones; o, si X' representa un polímero, X-Q-W' juntos pueden representar un grupo aceptor de electrones; y cada L representa independientemente un grupo saliente; o (ii) un compuesto de la fórmula general**Fórmula** en la que X, X', Q, W', A y L tienen los significados proporcionados para la fórmula general II y, además, si X representa un polímero, X' y un grupo W' aceptor de electrones junto con los átomos interyacentes pueden formar un anillo, y m representa un número entero de 1 a 4; con una proteína o un péptido que tiene un marcador de polihistidina unido a dicha proteína o péptido y que contiene de 2 a 12 residuos de histidina; y, si se desea, reduciendo el grupo W' aceptor de electrones.

Description

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DESCRIPCION
Protemas y peptidos conjugados novedosos
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de protemas y peptidos conjugados novedosos.
Muchas moleculas terapeuticamente activas, por ejemplo protemas, no poseen las propiedades requeridas para conseguir eficacia en el uso medico clmico. Por ejemplo, con muchas protemas nativas no se fabrican buenas medicinas debido a que despues de su administracion a los pacientes existen diversas desventajas inherentes entre las que se incluyen: (1) las protemas son digeridas por muchas endo- y exo-peptidasas presentes en sangre o tejidos; (2) muchas protemas son inmunogenas en alguna medida; y (3) las protemas pueden ser excretadas rapidamente por ultrafiltracion en los rinones y por endocitosis. Algunas moleculas que podnan ser utiles como agentes terapeuticos activos en medicinas son sistemicamente toxicas o carecen de una biodisponibilidad o una farmacocinetica optimas. Cuando las protemas se eliminan de la circulacion sangumea rapidamente, deben administrarse tfpicamente al paciente frecuentemente. La administracion frecuente aumenta adicionalmente el riesgo de toxicidad, especialmente toxicidades derivadas inmunologicamente.
Se usan ampliamente polfmeros sinteticos hidrosolubles, particularmente polialquilenglicoles, para conjugar moleculas terapeuticamente activas, tales como protemas. Estos conjugados terapeuticos han mostrado que alteran favorablemente la farmacocinetica, prolongando el tiempo en circulacion y reduciendo las velocidades de aclaramiento, reduciendo la toxicidad sistemica y, en diversos casos, mostrando una mayor eficacia clmica. El procedimiento de conjugacion covalente de polietilenglicol, PEG, a protemas se conoce comunmente como "PEGilacion".
Para una eficacia optimizada y para asegurar una coherencia entre dosis, es importante que el numero de moleculas de polfmero conjugadas por cada protema sea el mismo para cada molecula, y que cada molecula de polfmero este conjugada espedficamente de manera covalente con el mismo residuo de aminoacido en cada molecula de protema. La conjugacion no especfica en sitios a lo largo de una molecula de protema resulta en una distribucion de productos de conjugacion y, frecuentemente, protema no conjugada, para dar una mezcla compleja que es diffcil y cara de purificar.
El documento WO 2005/007197 describe una serie de reactivos de conjugacion novedosos. Estos pueden usarse para reaccionar con grupos nucleofilos en una molecula biologica, por ejemplo una protema, para producir un conjugado de protema-polfmero. Estos reactivos encuentran utilidad particular por su capacidad para conjugarse con ambos con atomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en una protema para dar conjugados tioeter novedosos.
La cromatograffa de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) es una tecnica estandar para la purificacion de protemas y peptidos. En esta tecnica, un marcador de polihistidina, denominado frecuentemente "his-tag" (una cadena corta de residuos de histidina contiguos, tfpicamente 5 o 6 residuos, no presentes en la protema nativa) es fijado mediante procedimientos de smtesis a una protema, generalmente a uno de los extremos de la cadena de aminoacidos. Se dice que la protema o el peptido resultante " esta marcada(o) con histidina". Los marcadores de polihistidina se unen fuertemente a metales tales como mquel y cobalto, a traves de al menos dos de los residuos de histidina. En IMAC, las protemas marcadas con polihistidina se pasan sobre una columna que contiene mquel o cobalto. El marcador de polihistidina se une fuertemente a la columna, permitiendo de esta manera que la protema marcada sea separada de las mezclas. Los marcadores de polihistidina se usan ampliamente, siendo fijados a una amplia gama de protemas y peptidos para permitir que estos, o productos derivados de los mismos, sean separados de las mezclas en una fecha futura.
Algunas protemas no marcadas contienen residuos de histidina en estrecha proximidad entre sf, y dichas protemas pueden unirse tambien a columnas IMAC de mquel y cobalto, aunque normalmente de manera menos fuerte que las protemas marcadas con polihistidina.
El documento WO 99/32134 divulga conjugados de polfmero de protema unida a histidina. El documento WO 2005/007197 y Balan et al., Bioconj. Chem. 18(1), 61-76, divulgan reactivos de conjugacion de polfmero utiles para la conjugacion a traves de los enlaces disulfuro de las protemas. Masri et al, J. Protein Chem, 7 (1), 49-54 divulga la reaccion de alquil vinil sulfonas con grupos histidina, cistema y lisina. El documento WO 95/34326 divulga reacciones de conjugacion de polfmero usando un resto de sulfona activo. Liberatore et al, Bioconj. Chem. 1(1), 36-50 divulga un grupo de reticulantes de protemas. Lee et al J. Cont. Release, 123 (1), 19-26 divulga micelas formadas a partir de un copolfmero de bloque de acido polilactico-PEG-polihistidina. Roberts et al, Adv. Drug Del Rev. 54(4), 459-476 es un artmulo de revision relacionado con la PEGilacion.
Los presentes inventores han encontrado ahora un procedimiento mejorado de conjugacion de un polfmero, especialmente PEG, a protemas y peptidos. En este procedimiento, el polfmero se conjuga con restos de histidina en un marcador de polihistidina. Los reactivos del documento WO 2005/007197 actuan como agentes de conjugacion extremadamente eficientes y estables para protemas y peptidos que contienen marcadores de polihistidina para producir conjugados novedosos.
Por consiguiente, la presente invention proporciona un procedimiento de conjugation de un poKmero a una protema o peptido que contiene un marcador de polihistidina, en el que el procedimiento se define como en la revindication 1.
Los conjugados de polfmero preparados mediante el procedimiento de la presente invencion son novedosos, y forman parte de la presente invencion.
5 Z es una protema o un peptido. A lo largo de la presente memoria descriptiva, el termino "protema" se usara por conveniencia, y excepto cuando el contexto requiera lo contrario, debe entenderse que las referencias a "protema" hacen referencia a " una protema o un peptido".
Un marcador de polihistidina es una cadena de histidina, que no se encuentra en la protema o peptido nativo, que ha sido fijado a la protema o peptido mediante medios adecuados, por ejemplo mediante medios qmmicos, mediante marcado 10 post-traslacional con un marcador de polihistidina o un resto que contiene un marcador de polihistidina, o mediante el diseno de protemas mediante la insertion de secuencias de histidina en fusion con la protema diana, por ejemplo mediante el uso de un gen que tiene una secuencia de codificacion corta que codifica un marcador de polihistidina de la longitud deseada.
en la que uno de entre X y X' representa un polfmero, y el otro representa un atomo de hidrogeno;
15 cada Q representa independientemente un grupo de union;
W representa un resto aceptor de electrones o un resto que puede ser preparado por reduction de un resto aceptor de electrones; o, si X' representa un polfmero, X-Q-W- juntos pueden representar un grupo aceptor de electrones; y ademas, si X representa un polfmero, X' y un grupo W aceptor de electrones junto con los atomos interyacentes pueden formar un anillo;
20 Z representa una protema o un peptido unido a A y B a traves de restos de histidina respectivos;
A es una cadena alquileno o alquenileno C1-5; y B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4.
Un grupo adicional de compuestos novedosos segun la invencion esta representado por la formula general: X-[Q-W-(CH=CH)v-(CH2)2-Z]v' (Ib)
25 en la que X representa un polfmero; Q representa un grupo de union; W representa un grupo aceptor de electrones o un resto que puede ser preparado por reduccion de un resto aceptor de electrones; v representa 0 o un numero entero de 1 a 4; v' representa un numero entero de 1 a 8; y Z representa una protema o un peptido enlazado a traves de un marcador de polihistidina. En estos compuestos, v' representa preferentemente un numero entero de 1 a 6, preferentemente de 1 a 4, por ejemplo 1. Preferentemente v es 0.
30 Otros reactivos que pueden usarse en el procedimiento de la presente invencion incluyen reactivos que son capaces de acilacion o de alquilacion. Dichos reactivos pueden ser mono o multifuncionales e incluyen por ejemplo carbonatos de PEG (por ejemplo, carbonato de PEG-p-nitrofenilo, carbonato de PEG-succinimidilo, carbonato de PEG-benzotriazolilo), carboxilatos de PEG y esteres de PEG (por ejemplo, ester de PEG-succinimidilo y ester de PEG-p-nitrofenilo y sus derivados), aldehfdo de PEG, PEG-tresilo o tosilo, PEG-diclortriazina o -clorotriazina, PEG vinilsulfona, PEG maleimida y 35 PEG-yodoacetamida; y los reactivos correspondientes que contienen polfmeros distintos de PEG.
Z en los conjugados novedosos de la presente invencion puede derivarse a partir de una protema o un peptido. A lo largo de la presente memoria descriptiva, el termino "protema" se usara por conveniencia, y excepto cuando el contexto requiera lo contrario, debe entenderse que las referencias a "protema" hacen referencia a "protemas o peptidos".
La protema que forma parte del novedoso conjugado de la formula la debe contener al menos dos residuos de histidina. 40 Estos dos residuos pueden estar presentes en la protema nativa y, si es asf, los dos residuos deben estar situados suficientemente proximos entre sf en la estructura nativa para permitir la conjugacion a los grupos A y B. Esto puede ocurrir cuando dos residuos de histidina son adyacentes entre sf en la cadena de protema, o pueden estar juntos como resultado del plegamiento de la protema. Dichas protemas generalmente se unen a columnas IMAC. Por ejemplo, el organismo procariota Escherichia coli tiene una protema conocida como YODA en la que puede producirse la union a 45 columnas IMAC. Preferentemente, sin embargo, los dos residuos de histidina forman parte de un marcador de polihistidina, es decir, una cadena de histidina, que no se encuentra en la protema o peptido nativo, que ha sido fijada a la protema o peptido mediante medios adecuados, por ejemplo mediante medios qmmicos, mediante marcado post- traslacional con un marcador de polihistidina o un resto que contiene un marcador de polihistidina, o mediante diseno de protemas mediante la insercion de secuencias de histidina en fusion con la protema diana, por ejemplo mediante el uso de 50 un gen que tiene una secuencia codificante corta que codifica para un marcador de polihistidina de la longitud deseada.
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Los marcadores de polihistidina usados en la presente invencion contienen hasta 12 residuos de histidina. Deben contener al menos 2 residuos; preferentemente contienen al menos 3 residuos, especialmente de 4 a 10 residuos, especialmente de 5 a 8 residuos, por ejemplo 5 o 6 residuos. Pueden contener solo residuos de histidina, o pueden contener tambien uno o mas residuos o secuencias separadoras ademas de residuos de histidina.
La naturaleza exacta de la union presente en los conjugados de la presente invencion no se conoce actualmente. La preparation de un posible conjugado, ilustrada usando un reactivo espedfico en el que cada SO2R representa un grupo saliente, y en la que R representa preferentemente un grupo alquilo, arilo, alcarilo o aralquilo, especialmente un grupo tolilo, se muestra en la Figura 1 de los dibujos adjuntos. Las Figuras 2(a) y 2(b) muestran conjugados alternativos que pueden prepararse mediante el procedimiento de la Figura 1. En las Figuras 1 y 2 se supone que la union es a residuos de histidina adyacentes, pero no puede descartarse la union a residuos de histidina separados, siempre que la separation no sea demasiado grande para prevenir la formation del conjugado.
Ademas de tener un marcador de polihistidina, la protema puede derivada o funcionalizada, si se desea. En particular, antes de la conjugation, la protema nativa puede hacerse reaccionar con diversos grupos de bloqueo para proteger los grupos sensibles en la misma; o puede ser conjugada previamente con uno o mas polfmeros u otras moleculas, usando el procedimiento de la presente invencion o usando un procedimiento alternativo. Ademas, los conjugados de la invencion pueden tener uno o mas polfmeros (incluyendo protemas) u otras moleculas conjugadas a la protema despues de la conjugacion segun la invencion. Los conjugados novedosos segun la presente invencion en los que la protema se conjuga a uno o dos polfmeros adicionales se muestran en las Figuras 3(a) y 3(b) de los dibujos adjuntos. En estas Figuras, los polfmeros junto con sus grupos de union se muestran esquematicamente como A, B y C, mientras que x, y y z representan el numero total de polfmeros A, B y C conjugados en cualquier combination a la protema a traves de residuos de histidina. Por supuesto, tambien es posible la conjugacion de uno o mas polfmeros a traves de residuos distintos de histidina. Ademas de estar conjugada a uno o mas polfmeros (incluyendo protemas), la protema puede estar conjugada a una o mas moleculas seleccionadas, por ejemplo, de entre moleculas pequenas, por ejemplo, agentes terapeuticos o de diagnostico; acido sialico; azucares; y almidones. Por lo tanto, B y C en la Figura 3 pueden representar dichas moleculas. Ademas, la Figura 3 muestra A, B y C situados adyacentes entre sf, pero esto es simplemente esquematico, y pueden estar separados unos de otros.
Muchas protemas suministradas comercialmente contienen marcadores de polihistidina, bien porque la protema ha sido purificada previamente mediante IMAC, o bien para ayudar a una futura purification de la propia protema o los productos derivados de la misma. Si se desea conjugar la protema a un polfmero, la conjugacion a los restos de histidina del marcador de polihistidina proporciona una via extremadamente conveniente, previamente no prevista. Los productos conjugados, espedficamente los productos PEGilados, pueden obtenerse con un alto grado de consistencia. El uso de los reactivos de conjugacion del documento WO 2005/007197, que resulta en la conjugacion a dos residuos de histidina, resulta en un macrociclo, que conduce a un conjugado particularmente estable y selectivo, generalmente obtenido con alto rendimiento.
Debido a que el marcador de polihistidina esta generalmente fijado a la superficie de la protema, generalmente en un extremo de la cadena de protema, y puede posicionarse en cualquier sitio deseado en la protema, la actividad biologica de la protema se mantiene en gran parte despues el procedimiento para la introduction de un marcador de polihistidina, y tambien despues del posterior procedimiento de conjugacion espetifica de sitio en residuos de histidina del marcador de polihistidina a un polfmero. Por estas razones, la presente invencion puede usarse para formar conjugados de protemas que previamente han demostrado ser intratables para los procedimientos de conjugacion tradicionales.
Siempre que un marcador de polihistidina contenga un numero suficiente de residuos de histidina, un conjugado de la presente invencion todavfa puede ser purificado usando IMAC. Para que esto sea eficaz, al menos dos, preferentemente mas, residuos de histidina en el marcador de polihistidina deben permanecer no conjugados y disponibles para la union al mquel en la columna IMAC. La reduction en el numero de residuos de histidina libre tras la conjugacion permite selectividad en la union a la columna IMAC entre el peptido o la protema no conjugada y el derivado conjugado. Cuando se produce una conjugacion multiple a la misma molecula biologica, IMAC permite la separacion de los derivados multi- conjugados.
Un polfmero en un conjugado de la invencion (X o X') puede ser por ejemplo un polialquilenglicol, una polivinilpirrolidona, un poliacrilato, por ejemplo poliacrilol morfolina, un polimetacrilato, una polioxazolina, un alcohol polivimlico, una poliacrilamida o polimetacrilamida, por ejemplo policarboximetacrilamida o un poliacrilato o polimetacrilato con grupos colgantes de fosfatidilcolina, tal como 2-metacriloiloxietil fosforilcolina, o un copolfmero de HPMA. Ademas, el polfmero puede ser uno que es susceptible a la degradation enzimatica o hidrolftica. Dichos polfmeros, por ejemplo, incluyen poliesteres, poliacetales, poli (orto esteres), policarbonatos, poli (carbonatos de imino), y poliamidas, tales como poli (aminoacidos). El polfmero puede ser un homopolfmero, copolfmero aleatorio o un copolfmero definido estructuralmente tal como un copolfmero de bloque. Por ejemplo, puede ser un copolfmero de bloque derivado de dos o mas oxidos de alquileno, o de poli (oxido de alquileno) y un poliester, poliacetal, poli (orto-ester) o un poli (aminoacido). Los polfmeros polifuncionales que pueden usarse incluyen copolfmeros de divinileter-antudrido maleico y estireno-anlddrido maleico.
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Pueden usarse tambien poKmeros de origen natural, por ejemplo polisacaridos tales como quitina, dextrano, dextrina, quitosano, almidon, celulosa, glicogeno, poli (acido siaKlico) y sus derivados. Una protema puede ser usada como el poKmero. Esto permite la conjugacion de una protema, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, a una segunda protema, por ejemplo una enzima u otra protema activa. Ademas, si se usa un peptido que contiene una secuencia catalftica, por ejemplo, un sitio aceptor O-glicano para glicosiltransferasa, permite la incorporacion de un sustrato o un objetivo para una subsiguiente reaccion enzimatica. Pueden usarse tambien polfmeros tales como acido poliglutamico, asf como polfmeros hforidos derivados a partir de monomeros naturales tales como sacaridos o aminoacidos y monomeros sinteticos tales como oxido de etileno o acido metacrflico.
Si el polfmero es un polialquilenglicol, este es preferentemente uno que contiene unidades C2 y/o C3, y es especialmente un polietilenglicol. Un polfmero, en particular un polialquilenglicol, puede contener una unica cadena lineal, o puede tener una morfologfa ramificada y puede estar compuesto de muchas cadenas pequenas o grandes. Los denominados Pluronicos son una clase importante de copolfmeros de bloque de PEG. Estos se derivan de bloques de oxido de etileno y de oxido de propileno. Pueden usarse polialquilenglicoles sustituidos, por ejemplo metoxipolietinglicol. En una realizacion preferente de la invencion, un polietilenglicol de cadena unica se inicia por un grupo adecuado, por ejemplo un grupo alcoxi, por ejemplo, metoxi, ariloxi, carboxi o hidroxilo, y es conectado en el otro extremo de la cadena a un grupo de enlace Q o Q', tal como se describe a continuacion.
Opcionalmente, el polfmero puede ser derivado o funcionalizado en cualquier forma deseada. Los grupos reactivos pueden ser enlazados en el grupo terminal o final del polfmero, o a lo largo de la cadena de polfmero a traves de enlazadores colgantes; en tal caso, el polfmero es, por ejemplo, una poliacrilamida, polimetacrilamida, poliacrilato, polimetacrilato, o un copolfmero de anhudrido maleico. Los conjugados multimericos que contienen mas de una molecula biologica, pueden resultar en beneficios sinergicos y aditivos. Si se desea, el polfmero puede ser acoplado a un soporte solido usando procedimientos convencionales.
El peso molecular optimo del polfmero dependera, por supuesto, de la aplicacion prevista. Preferentemente, el peso molecular promedio en numero esta comprendido en el intervalo de 250 g/mol, por ejemplo 500 g/mol, a aproximadamente 75.000 g/mol. Cuando el compuesto de la formula I general esta destinado a abandonar la circulacion y penetrar en el tejido, por ejemplo para su uso en el tratamiento de la inflamacion causada por la enfermedad maligna, infeccion o enfermedad autoinmune, o por trauma, puede ser ventajoso el uso de un polfmero de peso molecular mas bajo comprendido en el intervalo 2.000-30.000 g/mol. Para aplicaciones en las que el compuesto de la formula I general esta destinado a permanecer en la circulacion, puede ser ventajoso el uso de un polfmero de peso molecular mayor, por ejemplo, comprendido en el intervalo de 20.000 - 75,000 g/mol.
El polfmero a usar debena seleccionarse de manera que el conjugado sea soluble en el medio disolvente para su uso previsto. Para aplicaciones biologicas, en particular para aplicaciones de diagnostico y aplicaciones terapeuticas para la administracion terapeutica clmica a un mairnfero, el conjugado sera soluble en medios acuosos. Muchas protemas, tales como enzimas, tienen utilidad en la industria, por ejemplo para catalizar reacciones qmmicas. Para conjugados destinados para su uso en dichas aplicaciones, puede ser necesario que el conjugado sea soluble en uno o ambos de entre medios acuosos y organicos. Por supuesto, el polfmero no debena perjudicar indebidamente la funcion prevista de la protema.
Preferentemente, el polfmero es un polfmero sintetico, y preferentemente es un polfmero soluble en agua. El uso de un polietilenglicol soluble en agua es particularmente preferente para muchas aplicaciones.
Un grupo de enlace Q' o Q pueden ser por ejemplo un enlace directo, un grupo alquileno (preferentemente un grupo alquileno C1-10), o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, cualquiera de los cuales puede estar terminado o interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, grupos -NR (en los que R tiene el significado proporcionado mas adelante), grupos ceto, grupos -O-CO- y/o grupos -CO-O-. Los grupos arilo adecuados incluyen grupos fenilo y naftilo, mientras que los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, primidina y purina. La union al polfmero puede ser a traves de un enlace hidrolfticamente labil, o mediante un enlace no labil.
Los sustituyentes que pueden estar presentes en un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido incluyen, por ejemplo uno o mas de los mismos sustituyentes o diferentes sustituyentes seleccionados de entre -CN, -NO2, -CO2R, - COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NRCO2R, -NO, - NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, halogeno, por ejemplo fluor o cloro, - C=CR, -C=CR2 y -C=CHR, en el que cada R o R' representa independientemente un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo (preferentemente alquilo Ci-e) o un grupo arilo (preferentemente fenilo). Es especialmente preferente la presencia de sustituyentes aceptores de electrones.
Preferentemente, el grupo Q que se une a un atomo de hidrogeno en un compuesto de la formula la es un grupo alquileno o un enlace directo. Mas preferentemente, X en la formula la es un polfmero, y X'-Q- es H-.
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W puede representar, por ejemplo, un grupo ceto o aldehfdo CO, un grupo ester -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, O un grupo obtenido mediante la reduccion de un grupo, por ejemplo, un grupo CH.OH, un grupo eter CH.OR, un grupo ester CH.O.C(O)R, un grupo amina CH.NH2, CH.NHR o CH.NR2, o una amida CH.NHC(O)R o CH.N(C(O)R)2. Si X-Q-W- juntos representan un grupo aceptor de electrones, este grupo puede ser, por ejemplo, un grupo ciano.
Las condiciones precisas usadas en el procedimiento de conjugacion de la invencion dependeran, por supuesto, de que reactivo de conjugacion se esta usando, y que protema o peptido esta siendo conjugado. Dichas condiciones estan dentro del conocimiento comun de la persona con conocimientos en la materia. Por ejemplo, el pH para la reaccion estara comprendido generalmente entre pH 4 y pH 10, tipicamente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8,5, por ejemplo aproximadamente 6,5 a 8,0, preferentemente aproximadamente de 7,0-7,5. La concentracion de la protema o peptido en la mezcla de reaccion sera en general por encima de 0,20 mg/ml y tfpicamente por encima de 0,4 mg/ml, por ejemplo de 0,5 mg/ml a 1,5 mg/ml. Los reactivos del documento WO 2005/007197, el procedimiento comprende hacer reaccionar (i) un compuesto de la formula general
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en la que uno de entre X y X' representa un polfmero y el otro representa un atomo de hidrogeno;
Q representa un grupo de union;
W representa un grupo aceptor de electrones, por ejemplo, un grupo ceto, un grupo ester -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-; o, si X' representa un polnriero, X-Q-W' juntos pueden representar un grupo aceptor de electrones;
A representa una cadena alquileno o alquenileno C1-5;
B representa un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4; y
cada L representa independientemente un grupo saliente;
o (ii) un compuesto de la formula general
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en la que X, X', Q, W', A y L tienen los significados proporcionados para la formula II general y, ademas, si X representa un polfmero, X' y un grupo W aceptor de electrones junto con los atomos interyacentes pueden formar un anillo, y m representa un numero entero de 1 a 4; con una protema o un peptido que contiene al menos dos residuos de histidina.
Los reactivos de conjugacion II y III son qmmicamente equivalentes entre sf, y se describen en el documento WO 2005/007197. Se caracterizan por tener un resto inter-funcionalizado inter-conjuntado de manera latente, bis-alquilante, que es selectivo para dos nucleofilos. Es sorprendente que pueda obtenerse una alta selectividad a dos residuos de histidina. Otros procedimientos de conjugacion tienden a producir mezclas de productos; por ejemplo, previamente se ha encontrado dificil la union de manera selectiva a residuos de histidina en lugar de a residuos de lisina.
El o cada grupo L saliente puede representar, por ejemplo, -SR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, halogeno o - O0, en la que R tiene el significado proporcionado anteriormente, y 0 representa un grupo arilo sustituido, especialmente fenilo, que contiene al menos un aceptor de electrones sustituyente, por ejemplo -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, - COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR'CO2R, -NO, -NHOH, -NR'OH, - C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, halogeno, especialmente cloro o, especialmente, fluor, -C=CR, -
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C=CR2 y -C=CHR, en las que R y R' tienen los significados proporcionados anteriormente. Las estructuras t^picas en las que W y X' juntos forman un anillo incluyen
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en la que n es un numero entero de 1 a 4, y
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En una realizacion preferente, el procedimiento segun la invencion usa un reactivo de la formula general:
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para producir un conjugado novedoso de la formula general:
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Una caractenstica clave de esta realizacion del procedimiento de la presente invencion es que un grupo saliente a- metileno y un doble enlace se conjugan de manera cruzada con una funcion aceptora de electrones que sirve como un resto de activacion de Michael. Si el grupo saliente es propenso a la eliminacion en el reactivo con funcionalidad cruzada en lugar de a un desplazamiento directo y el grupo aceptor de electrones es un resto activador adecuado para la reaccion de Michael, entonces puede producirse una bis-alquilacion intramolecular secuencial mediante reacciones Michael y retro- Michael consecutivas. El resto saliente sirve para enmascarar un doble enlace conjugado latente que no es expuesto hasta despues de que se haya producido la primera alquilacion y la bis-alquilacion resulta de las reacciones Michael y retro-Michael secuenciales e interactivas tal como se describe en J. Am. Chem. Soc. 1979,101, 3098-3110 y J. Am. Chem. Soc. 1988,110, 5.211-5.212). El grupo aceptor de electrones y el grupo saliente se seleccionan optimamente de manera que la bis-alquilacion pueda producirse mediante reacciones Michael y retro-Michael secuenciales. Tambien es posible preparar agentes de alquilacion con funcionalidad cruzada con enlaces multiples adicionales conjugados al doble enlace o entre el grupo saliente y el grupo aceptor de electrones, tal como se describe en J. Am. Chem. Soc. 1988,110, 5.211-5.212.
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Algunos ejemplos de conjugados novedosos segun la invencion incluyen los siguientes:
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Algunos ejemplos de reactivos que pueden ser usados en el procedimiento segun la invencion incluyen los siguientes:
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Con respecto a la protema, los residuos de histidina se posicionan en un marcador de polihistidina. Por supuesto, poKmeros distintos de polietilenglicol pueden reemplazar el PEG en las formulas anteriores. Sin desear estar limitados por la teona, la union a los residuos de histidina puede ser tal como se muestra en la siguiente formula:
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pero tambien es posible la union a otros atomos de nitrogeno en las histidinas.
El producto inmediato del procedimiento anterior es un compuesto de la formula general la en la que W es un grupo aceptor de electrones. Dichos compuestos tienen utilidad en sf mismos; debido a que el procedimiento de la invencion es reversible bajo condiciones adecuadas, ademas, los compuestos de formula la en la que W es un resto aceptor de electrones tienen utilidad en aplicaciones en las que se requiere la liberacion de la protema libre, por ejemplo, en aplicaciones clmicas directas. Sin embargo, un resto W aceptor de electrones puede ser reducido para dar un resto que previene la liberacion de la protema, y dichos compuestos tendran tambien utilidad en muchas aplicaciones clmicas, industriales y de diagnostico. Ademas, el hecho de que una vez que W ha sido reducido ya no pueden producirse reacciones inversas, significa que no se observara ningun cambio si se anade un nucleofilo mas fuerte. Por lo tanto, se hace posible, por ejemplo, la PEGilacion a traves de un marcador de polihistidina; reducir W; a continuacion, reducir un enlace disulfuro en la protema; y llevar a cabo una PEGilacion posterior a traves del enlace disulfuro reducido. Para algunas protemas, puede ser posible llevar a cabo dicho un procedimiento sin reducir el grupo W.
De esta manera, por ejemplo, un resto W que contiene un grupo ceto puede ser reducido a un resto W que contiene un grupo CH(OH); un grupo eter CH.OR puede obtenerse mediante la reaccion de un grupo hidroxi con un agente de eterificacion; un grupo ester CH.O.C(O)R puede obtenerse mediante la reaccion de un grupo hidroxi con un agente de acilacion; un grupo amina CH.NH2, CH.NHR o CH.NR2 puede prepararse a partir de una cetona o un aldehfdo mediante aminacion reductora; o una amida CH.NHC(O)R o CH.N(C(O)R)2 puede ser formada mediante acilacion de una amina. Un grupo X-Q-W- que es un grupo ciano puede reducirse a un grupo amina, formado mediante acilacion de una amina. Un grupo X-Q-W- que es un grupo ciano puede reducirse a un grupo amina.
El procedimiento puede llevarse a cabo en un disolvente o una mezcla de disolventes en los que todos los reactivos son solubles. La protema puede dejarse reaccionar directamente con el compuesto de la formula general II o Ill en un medio de reaccion acuoso. Este medio de reaccion puede ser tambien tamponado, dependiendo de los requisitos de pH del nucleofilo. El pH optimo para la reaccion sera generalmente de al menos 6,0, tfpicamente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 8,5, por ejemplo de aproximadamente 6,5 o 7,0 a 8,0, por ejemplo de aproximadamente 7,5-8,0, pero preferentemente de aproximadamente 7,0 a 7,5. Es sorprendente que el procedimiento segun la invencion es selectivo para la union a residuos de histidina en un marcador de polihistidina a pH basico, ya que los procedimientos de la literatura de PEGilacion tienden a sugerir que las condiciones basicas conducen a una PEGilacion no selectiva, incluyendo una PEGilacion de residuos de lisina, y que la PEGilacion a histidina se optimiza a un pH de 6,0 a 6,5. Incluso entonces, los procedimientos de la literatura sugieren una PEGilacion no selectiva, incluyendo una PEGilacion a lisina. Por supuesto, las condiciones de reaccion optimas dependeran de los reactivos espedficos empleados pero, en general, el uso de un pH hacia el extremo inferior del intervalo anterior tendera a aumentar la selectividad hacia la union a histidina, mientras que el uso de un pH hacia el extremo superior del intervalo anterior tendera a aumentar el rendimiento.
Las temperaturas de reaccion entre 3-37°C son generalmente adecuadas: las protemas pueden descomponerse o desnaturalizarse alterando la funcion si la reaccion de conjugacion se realiza a una temperatura a la que pueden producirse estos procesos. Las reacciones que se llevan a cabo en medios organicos (por ejemplo, THF, acetato de etilo, acetona) se llevan a cabo tfpicamente a temperaturas de hasta la temperatura ambiente.
La protema puede conjugarse efectivamente con el reactivo deseado usando un equivalente estequiometrico o un ligero exceso de reactivo, a diferencia de muchos otros reactivos. Sin embargo, debido a que los reactivos no experimentan reacciones competitivas con los medios acuosos usados para solvatar protemas, es posible llevar a cabo la reaccion de conjugacion con un exceso de estequiometna de reactivo. El exceso de reactivo y el producto pueden separarse facilmente por cromatograffa de intercambio ionico durante la purificacion rutinaria de protemas, o por separacion usando mquel.
Tal como se ha indicado anteriormente, dependiendo del numero de residuos de histidina presentes, mas de un polfmero puede conjugarse a una protema adecuada, y esto se muestra esquematicamente en la Figura 3. Por ejemplo, dos polfmeros podnan conjugarse con un marcador de polihistidina de 6 residuos. Esto proporciona un procedimiento util de fijacion de multiples residuos de polfmero a una protema. Esto puede ser deseable cuando se desea obtener un producto
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de alto peso molecular usando un PEG de peso molecular inferior, por ejemplo, para obtener un producto de peso molecular 60 kD usando tres cadenas PEG de 20 kD; o cuando se desea anadir dos poKmeros diferentes, por ejemplo una protema y un PEG, a otra protema para obtener multiples efectos; o para conseguir, por ejemplo, glicosilacion y PEGilacion en una unica etapa. Dicha conjugacion multiple es frecuentemente diffcil de conseguir con la tecnologfa de conjugacion convencional.
Los compuestos de la formula general la tienen una serie de aplicaciones. Por ejemplo, pueden ser usados para su aplicacion clmica directa a un paciente y, por consiguiente, la presente invention proporciona ademas una composition farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. La invencion proporciona ademas un compuesto de la invencion para su uso en terapia, y un procedimiento de tratamiento de un paciente que comprende administrar una cantidad farmaceuticamente eficaz de un compuesto o una composicion farmaceutica segun la invencion al paciente. Cualquier efecto farmaceutico deseado, por ejemplo tratamiento de trauma, remplazo de enzimas, remplazo de protemas, tratamiento de heridas, elimination de toxinas, antiinflamatorio, antiinfeccioso, inmunomodulador, vacunacion o anti-cancer, puede obtenerse mediante una election adecuada de la protema.
Los compuestos de la invencion pueden usarse tambien en aplicaciones no clmicas. Por ejemplo, muchos compuestos fisiologicamente activos, tales como enzimas, son capaces de catalizar reacciones en disolventes organicos, y los compuestos de la invencion pueden usarse en dichas aplicaciones. Ademas, los compuestos de la invencion pueden usarse como herramientas de diagnostico. Los compuestos de la invencion pueden incluir un agente de obtencion de imagenes, por ejemplo un radio nucleotido, para permitir el seguimiento del compuesto in vivo.
La protema puede ser por ejemplo un peptido, polipeptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, enzima, citoquina, quimioquina, receptor, factor sangumeo, hormona peptfdica, toxina, protema de transcription o protema multimerica.
A continuation, se proporcionan algunas protemas espedficas que pueden tener utilidad en la presente invencion, dependiendo de la aplicacion deseada. Las enzimas incluyen enzimas especficas de carbohidratos, enzimas proteolfticas y similares. Las enzimas de interes, tanto para aplicaciones industriales (reacciones con base organica) como para aplicaciones biologicas en general y aplicaciones terapeuticas en particular incluyen las oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas divulgadas en el documento US 4.179.337. Las enzimas espedficas de interes incluyen asparaginasa, arginasa, adenosina desaminasa, superoxido dismutasa, catalasa, quimotripsina, lipasa, uricasa, bilirrubina oxidasa, glucosa oxidasa, glucuronidasa, galactosidasa, glucocerebrosidasa, glucuronidasa, glutaminasa.
Las protemas usadas en los compuestos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, factor VII, VIII o IX y otros factores sangumeos, insulina, ACTH, glucagen, somatostatina, somatotropinas, timosina, hormona paratiroidea, hormonas pigmentarias, somatomedinas, eritropoyetina, hormona luteinizante, factores liberadores del hipotalamo, hormonas antidiureticas, prolactina, interleuquinas, interferones, factores estimulantes de colonias, hemoglobina, citoquinas, anticuerpos, gonadotropina corionica, hormona estimuladora de folmulo, hormona estimuladora de la tiroides y activador tisular del plasminogeno.
Algunas de las protemas anteriores, tales como las interleuquinas, interferones y factores estimulantes de colonias existen tambien en forma no glicosilada, normalmente como resultado de una preparation mediante tecnicas de protemas recombinantes. Las versiones no glicosiladas pueden usarse en la presente invencion.
Otras protemas de interes son las protemas alergenas, de las cuales Dreborg et al Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315 365 divulga que tienen una alergenicidad reducida cuando se conjugan con un polfmero tal como poli(oxido de alquileno) y, por consiguiente, son adecuadas para uso como inductores de tolerancia. Entre los alergenos divulgados estan el antfgeno E de ambrosia, veneno de abeja, alergenos de acaros y similares.
Los glicopolipeptidos, tales como inmunoglobulinas, ovoalbumina, lipasa, glucocerebrosidasa, lectinas, activador tisular del plasminogeno e interleucinas glicosiladas, interferones y factores estimulantes de colonias son de interes, al igual que las inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y sus fragmentos.
De particular interes son los receptores y las protemas de union a ligando y los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se usan en la medicina clmica con fines diagnosticos y terapeuticos. El anticuerpo puede usarse individualmente o puede conjugarse covalentemente ("cargarse") con otro atomo o molecula, tal como un radioisotopo o un farmaco citotoxido/anti-infeccioso. Pueden usarse epftopos para la vacunacion, para producir un conjugado inmunogenico polfmero-protema.
Los ejemplos siguientes ilustran la invencion. Los resultados de los ejemplos se proporcionan en las Figuras 4 a 12 y 14 a 20 adjuntas. En los ejemplos, se usaron protemas pro-BNP que conteman un marcador de polihistidina de 6 residuos de histidina, y sinuclema beta que contema un marcador de polihistidina de 8 residuos de histidina. En el tejido cardfaco, el peptido natriuretico cerebral (BNP) se sintetiza como un precursor de 134 aminoacidos (prepro-BNP), que es escindido por proteasas para formar un pro-BNP de 108 aminoacidos. La sinuclema beta es una protema pequena, soluble, que se
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encuentra principalmente en el tejido cerebral, y tiene una actividad de tipo chaperon. Otras protemas usadas son interferon a-2b, endostatina, un fragmento de anticuerpo de dominio alfa anti-TNF.
Ejemplo 1: PEGilacion 12 kDa de His6-proBNP
Estructuras de reactivo de PEG:
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15 Se preparo mono-sulfona PEG 12 kDa (estructura (2)) mediante incubacion de la bis-sulfona PEG (estructura (1)) en tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 7,8, (10 mg/ml) durante 5 horas. Dos partes almuotas de proBNP marcado 6 x histidina C-terminal (Abcam, ab51402, 13 kDa) en fosfato sodico 50 mM pH 7,8 (10 pl, 0,5 mg/ml) se enfriaron en hielo y, a continuacion, se anadieron 1 equivalente molar (con respecto a la concentracion de protema) o 3 equivalentes molares de mono-sulfona PEG 12 kDa (1,6 pl o 4,8 pl respectivamente). A continuacion, las mezclas de reaccion se colocaron en 20 el refrigerador y se dejaron durante 16 horas.
Las mezclas de reaccion resultantes se analizaron usando SDS-PAGE para la separacion dependiente del tamano de sus constituyentes y el gel resultante despues de la tincion con tinte azul Instant (Novexin) se muestra en la Figura 4. En la Figura 4, el carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. La banda con la etiqueta B en el carril 1 es la muestra de His6-proBNP tal como se suministra (Abcam, 1 25 mg/ml). La banda A es una impureza. El carril 2 se obtiene a partir del 1 equivalente de la mezcla de reaccion PEG 12 kDa y muestra bandas, con las etiquetas C, D y E, que corresponden a un producto mono-PEGilado, un producto di- PEGilado y un producto tri-PEGilado, respectivamente. Las bandas inferiores, con las etiquetas A y B corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y la impureza en la muestra suministrada, respectivamente. El carril 3 se obtiene a partir de los 3 equivalentes de la mezcla de reaccion PEG 12 kDa y muestra bandas, con las etiquetas C, D y E, que corresponden 30 a un producto mono-PEGilado, un producto di-PEGilado y un producto tri-PEGilado, respectivamente. Las bandas inferiores, con las etiquetas B y A, corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y la impureza en la muestra suministrada, respectivamente.
A continuacion, el gel se tino tambien con yoduro de bario para la visualizacion de PEG con el resultado mostrado en la Figura 5. Las bandas en el carril 1 corresponden a reactivo PEG sin reaccionar que tiene la etiqueta C, y las bandas con 35 las etiquetas D, E y F que corresponden a un producto mono-PEGilado, un producto di-PEGilado y un producto tri- PEGilado, respectivamente. Las bandas inferiores, con las etiquetas B y A corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y la impureza en la muestra suministrada, respectivamente. El carril 3, que se obtiene a partir de los 3 equivalentes de la mezcla de reaccion PEG 12 kDa muestra una banda con la etiqueta C que corresponde a reactivo PEG sin reaccionar y las bandas con las etiquetas D, E y F, que corresponden a un producto mono-PEGilado, un producto di-PEGilado y un 40 producto tri-PEGilado, respectivamente. Las bandas inferiores, con las etiquetas B y A, corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y la impureza en la muestra suministrada, respectivamente.
Ejemplo 2: PEGilacion 30 kDa de His6-proBNP
Se preparo monosulfona PEG 30 kDa (estructura (2) del ejemplo 1) mediante incubacion de la bis-sulfona PEG (estructura (1) del ejemplo 1) en tampon de fosfato sodico 50 mM a pH 7,8, mM (10 mg/ml) durante 5 horas. Dos partes 45 almuotas de proBNP marcadas con 6 x histidina C-terminal (Abcam, ab51402) en fosfato sodico 50 mM pH 7,8 (10 pl, 0,5
mg/ml) se enfriaron en hielo, a continuacion o se anadieron 1 equivalente molar (con respecto a la concentracion de protema) o 3 equivalentes de mono-sulfona PEG 30 kDa (2,0 pl o 6,0 pl respectivamente). A continuacion, la reaccion se coloco en la nevera y se dejo durante 16 horas.
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Las mezclas de reaccion resultantes se analizaron usando SDS-PAGE para la separacion dependiente del tamano de sus constituyentes y el gel resultante despues de la tincion con azul Instant (Novexin) se muestra en la Figura 6. El carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. La banda con la etiqueta B en el carril 1 es la muestra de His6-proBNP tal como se suministra (Abcam, 1 mg/ml). La banda A es una impureza. El carril con la etiqueta 2 se obtiene a partir del 1 equivalente de mezcla de reaccion de PEG 30 kDa y muestra una banda con etiqueta C que corresponde a un producto mono-PEGilado y bandas inferiores, con las etiquetas A y B, que corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente. El carril con la etiqueta 3 se obtiene a partir del 3 equivalente de mezcla de reaccion PEG 30 kDa y muestra bandas con etiquetas C y D que corresponden a un producto mono-PEGilado y un producto di-PEGilado, respectivamente, y bandas inferiores, con las etiquetas B y A, que corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente.
A continuacion, el gel se tino tambien con yoduro de bario para la visualizacion de PEG y el gel resultante se muestra en la Figura 7. El carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. La banda con la etiqueta B en el carril 1 es la muestra de His6-proBNP tal como se suministra (Abcam, 1 mg/ml). La banda A es una impureza. El carril con la etiqueta 2 se obtiene a partir del 1 equivalente de la mezcla de reaccion PEG 30 kDa y muestra un banda con la etiqueta C que corresponde al reactivo de PEG sin reaccionar, una banda con la etiqueta F que corresponde a una impureza PEG, bandas con las etiquetas D y E y F, que corresponden a productos mono-PEGilado y di-PEGilado, respectivamente, y bandas inferiores, con la etiqueta B y A, que corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente. El carril con la etiqueta 3 se obtiene a partir de los 3 equivalentes de mezcla de reaccion PEG 30 kDa y muestra una banda con la etiqueta C que corresponde al reactivo PEG sin reaccionar, una banda con la etiqueta F que corresponde a una impureza PEG, bandas con las etiquetas D y E, que corresponden a productos mono-PEGilado y di-PEGilado respectivamente, y bandas inferiores, con las etiquetas A y B, que corresponden a His6-proBNP sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente.
Ejemplo 3: PEGilacion 12 kDa de Hiss-beta sinuclema y reaccion comparativa con beta sinuclema no marcada con histidina
Se preparo monosulfona PEG 12 kDa (estructura (2) del ejemplo 1) mediante incubacion de la bis-sulfona PEG (estructura (1) del ejemplo 1) en tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 7,8 (10 mg/ml) durante 5 horas. Dos partes almuotas de beta sinuclema marcada con 8 * histidina N-terminal (Abcam cat. No. Ab40545, 15 kDa) en fosfato sodico 50 mM pH 7,8 (10 pl, 0,39 mg/ml) se enfriaron en hielo, a continuacion se anadieron 1 equivalente molar (con respecto a la concentracion de protema) o 3 equivalentes de mono-sulfona PEG 12 kDa (1,6 pl o 4,7 pl respectivamente). A continuacion, la reaccion se coloco en la nevera y se dejo durante 16 horas.
Las mezclas de reaccion resultantes se analizaron usando SDS-PAGE para la separacion dependiente del tamano de sus constituyentes y el gel resultante despues de la tincion con azul Instant (Novexin) se muestra en la Figura 8. El carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores.
La banda con la etiqueta B en el carril 1 es la muestra de Hiss-beta sinuclema suministrada por Abcam (0,8 mg/ml). La banda A es una impureza. El carril con la etiqueta 2 se obtiene a partir del 1 equivalente de mezcla de reaccion PEG 12 kDa y muestra bandas, con las etiquetas C y D, que corresponden a un producto mono-PEGilado y un producto di- PEGilado, respectivamente, y bandas inferiores, con las etiquetas A y B, que corresponden a His8-beta sinuclema sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente. El carril con la etiqueta 3 se obtiene a partir de los 3 equivalentes de mezcla de reaccion PEG 12 kDa y muestra bandas, con las etiquetas C, D, E y F que corresponden a un producto mono-PEGilado, un producto di-PEGilado, un producto tri-PEGilado y un producto tetra-PEGilado, respectivamente, y bandas inferiores, con las etiquetas B y A, que corresponden a His8-beta sinuclema sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente.
A continuacion, el gel se tino tambien con yoduro de bario para la visualizacion de PEG y el gel resultante se muestra en la Figura 9. En la Figura 9, el carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. El carril con la etiqueta 1 se obtiene a partir de His8-beta sinuclema tal como es suministrada por Abcam. El carril con la etiqueta 2 se obtiene a partir del 1 equivalente de mezcla de reaccion PEG 12 kDa y muestra bandas con etiquetas C, D y E, que corresponden a un producto mono-PEGilado, un producto di-PEGilado y un producto tri-PEGilado, respectivamente, y las bandas inferiores, con etiquetas B y A, que corresponden a His8-beta sinuclema sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente. El carril con la etiqueta 3 se obtiene a partir de los 3 equivalentes de mezcla de reaccion PEG 12 kDa y muestra bandas con etiquetas D, E y F que corresponden a un producto mono-PEGilado, un producto di-PEGilado, un producto tri-PEGilado y un producto tetra-PEGilado, respectivamente, y las bandas inferiores, con etiquetas A y B, que corresponden a His8-beta sinuclema sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente. La banda C es una impureza PEG.
Se llevo a cabo un estudio de comparacion de PEGilacion 12 kDa entre His8-beta sinuclema y beta sinuclema no marcada
con histidina (Abcam. cat n° ab48853) usando 1 equivalente del reactivo PEG (2) a pH 7,0 y el resultado de SDS-PAGE se muestra en la Figura 10. El carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. El resultado de la Hiss-beta sinuclema se muestra en el carril con la etiqueta 1. En el carril 1, la banda con la etiqueta B es Hiss-beta sinuclema sin reaccionar y la banda con la etiqueta C es Hiss-beta sinuclema mono- 5 PEGilada. El carril con la etiqueta 2 muestra la reaccion de beta sinuclema no marcada con histidina y la unica banda visible tiene la etiqueta A y es la beta sinuclema no marcada con histidina. No hay ninguna banda de protema PEGilada en el carril 2.
Ejemplo 4: PEGilacion 30 kDa de Hiss-beta sinuclema
Se preparo monosulfona PEG 30 kDa (estructura (2) del ejemplo 1) mediante incubacion de la bis-sulfona PEG 10 (estructura (1) del ejemplo 1) en tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 7,8 (10 mg/ml) durante 5 horas. Una parte almuota de beta sinuclema marcada con 8 * histidina N-terminal (Abcam, ab40545, 15 kDa) en fosfato sodico 50 mM pH 7,8 (10 |jl, 0,39 mg/ml) se enfrio en hielo y, a continuacion, se anadio 1 equivalente molar (con respecto a la concentracion de protema) de mono-sulfona PEG 30 kDa (1,6 jl). A continuacion, la reaccion se coloco en la nevera y se dejo durante 16 horas.
15 La mezcla de reaccion resultante se analizo usando SDS-PAGE para la separacion dependiente del tamano de sus constituyentes y el gel resultante despues de la tincion con azul Instant (Novexin) se muestra en la Figura 11. En la Figura 11, el carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. El carril con la etiqueta 1 se obtiene a partir de la muestra de Hiss-beta sinuclema suministrada por Abcam (0,8 mg/ml) y la banda con la etiqueta B es la protema marcada con polihistidina, mientras que la banda con la etiqueta A es una 20 impureza. El carril con la etiqueta 2 se obtiene a partir del 1 equivalente de mezcla de reaccion PEG 30 kDa y muestra una banda con etiqueta C que corresponde a un producto mono-PEGilado y bandas inferiores, con etiquetas A y B, que corresponden a His8-beta sinuclema sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente.
A continuacion, el gel se tino tambien con yoduro de bario para la visualizacion de PEG y el gel resultante se muestra en la Figura 12. En la Figura 12, el carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) 25 usados como calibradores. El carril con la etiqueta 1 se obtiene a partir de His8-beta sinuclema tal como es suministrada por Abcam. El carril con la etiqueta 2 se obtiene a partir del 1 equivalente de mezcla de reaccion PEG 30 kDa y muestra una banda con la etiqueta C que corresponde a un reactivo PEG sin reaccionar, bandas con etiquetas E y G que corresponden a las impurezas de PEG, bandas con etiquetas D y F, que corresponden a un producto mono-PEGilado y un producto di-PEGilado, respectivamente, y bandas inferiores, con etiquetas A y B, que corresponden a His8-beta 30 sinuclema sin reaccionar y a la impureza en la muestra suministrada, respectivamente.
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Un matraz de fondo redondo de 250 ml con acido p-acetilbenzoico (15,0 g, 3(1)), 11,11g de clorhidrato de piperidina y 8,23 g de paraformaldelddo. A continuacion, se anadieron etanol absoluto (90 ml) y acido clorddrico concentrado (1 ml), y la suspension resultante se calento a reflujo durante 10 horas mientras se agitaba bajo argon. Despues de detener el reflujo, se anadio acetona (150 ml) y la mezcla de reaccion se dejo enfriar a temperatura ambiente. El precipitado blanco resultante se aislo sobre un filtro de vidrio (G3) y se lavo dos veces con acetona enfriada. A continuacion, el solido se seco bajo vado para dar un polvo blanco cristalino (3(2), 9,72 g). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 6 1,79, 2,96, 3,45 (br m, CH2 de resto de piperidina), 3,36 (t, 2H, COCH2), 3,74 (t, 2H, NCH2), 8,09 (m, 4H, ArH).
Etapa 2: Sintesis de acido 4-(3-(p-toliltio)propanoil)benzoico 3(5).
El clorhidrato de p-carboxi-3-piperidinopropriofenona 3(2) (1,0 g) y 4-metilbencenotiol (417 mg, 3(3)) se suspendieron en una mezcla de etanol absoluto (7,5 ml) y metanol (5 ml). A continuacion, se anadio piperidina (50 pl) y la suspension se calento a reflujo con agitacion durante 6 horas en una atmosfera de argon. El precipitado blanco obtenido despues de enfriar a temperatura ambiente se filtro con un filtro de vidrio (G3), se lavo cuidadosamente con acetona fna y se seco en vado para dar 3(3) (614 mg). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 6 2,27 (s, 3H, fenil-CHa), 3,24, 3,39 (t, 2 x 2H, CH2), 7,14, 7,26 (d, 2 x 2H, ArH de resto de tolilo), 8,03 (m, 4H, ArH de resto de acido carboxflico).
Etapa 3, Sintesis de acido 4-(3-tosilpropanool)benzoico 3(4).
Se suspendio acido 4-(3-(p-toliltio)propanoil)benzoico 3(4) (160 mg) en una mezcla de agua (10 ml) y metanol (10 ml). Despues de enfriar en un bano de hielo, se anadio oxona (720 mg, Aldrich) y la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente mientras se agitaba durante la noche (15 horas). La suspension resultante se diluyo con agua adicional (40 ml) de manera que se hizo casi homogenea y, a continuacion, la mezcla se extrajo tres veces con cloroformo (en total 100 ml). Los extractos de cloroformo reunidos se lavaron con salmuera y, a continuacion, se secaron con MgSO4. La evaporacion de los volatiles bajo vado a 30°C proporciono un solido blanco 3(4) (149 mg). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 6 2,41 (s, 3H, fenil-CHs), 3,42 (t, 2H, CO-CH2), 3,64 (t, 2H, SO2-CH2), 7,46, 7,82 (d, 2 x 2H, ArH de resto de tolilo), 8,03 (m, 4H, ArH de resto de acido carboxflico).
Etapa 4, Sintesis de acido 4-(3-tosilpropanoil)benzoico PEGilado, reactivo de PEG 3.
El acido 4-(3-tosilpropanoil)benzoico 3(4) (133 mg) y 0-(2-aminoetil)-O'-metil-PEG (MW 10 kDa, 502 mg, BioVectra) se disolvieron en tolueno seco (5 ml). El disolvente se elimino bajo vado sin calentamiento y, a continuacion, el residuo solido seco se volvio a disolver en diclorometano seco (15 ml) bajo atmosfera de argon. A la solucion resultante, enfriada en un bano de hielo, se anadio lentamente diisopropilcarbodiimida (DIPC, 60 mg) bajo atmosfera de argon. A continuacion, la mezcla de reaccion se mantuvo en agitacion a temperatura ambiente durante la noche (15 horas). A continuacion, los volatiles se retiraron bajo vado (30°C, bano de agua) para proporcionar un residuo solido que se volvio a disolver con calentamiento suave (35°C) en acetona (20 ml). La solucion se filtro a traves de lana de algodon no absorbente para eliminar el material insoluble. A continuacion, la solucion se enfrio en un bano de hielo seco para dar un precipitado blanco que se separo mediante centrifugacion (4.600 rpm, 30 minutos). La fase lfquida se separo por decantacion y este procedimiento de precipitacion se repitio tres veces. A continuacion, el solido de color blanco resultante
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se seco bajo vado para proporcionar el reactivo de PEG 3 (437 mg). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) 6 2,46 (s, 3H, fenil-CH3), 3,38 (s, 3H, PEG-OCH3), 3,44-3,82 (br m, PEG), 7,38, 7,83 (d, 2 x 2H, ArH de resto de tolilo), 7,95 (m, 4H, ArH de resto de acido carboxflico).
Etapa 5: PEGilacion en histidina de IFN a-2b marcado con Hiss C-terminal
A una solucion de 20 pl de IFN a-2b (1,13 mg/ml en tampon de fosfato sodico 10 mM que contema EDTA 2 mM y NaCI 150 mM, pH 7,5) se anadio 1 equivalente molar de reactivo 3 de PEG 10 kDa (1,8 pl de una solucion de 6 mg/ml en agua desionizada) y la solucion resultante se incubo durante la noche a temperatura ambiente. Se realizo tambien una repeticion con 1 equivalente molar de 20 kDa
Ejemplo 6: PEGilacion 5 kDa de Hisg-p-sinuclema
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20 Se preparo monosulfona PEG 5 kDa (estructura (5)) mediante incubacion de la bis-sulfona PEG (estructura (4)) en tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 7,8 (5 mg/ml) durante 3 horas. Dos partes almuotas de beta sinuclema marcada con 8 x histidina N-terminal (Abcam cat. No. Ab40545, 15,4 kDa) en fosfato sodico 50 mM pH 7,4 (10 pl, 0,38 mg/ml) se enfriaron en hielo, a continuacion se anadieron 1 equivalente molar (con respecto a la concentracion de protema) o 3 equivalentes de mono-sulfona PEG 5 kDa (5) (0,25 pl) o < 0,74 pl, respectivamente). Como control, dos almuotas de beta 25 sinuclema (Abcam cat. No. Ab48853, 14,3 kDa) se trataron de la misma manera y se les proporciono 1 equivalente molar (0,18 pl) o 3 equivalentes (0,52 pl) de la mono-sulfona PEG 5 kDa. A continuacion, las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 6 horas. Las soluciones de reaccion resultantes se analizaron usando SDS-PAGE y se tineron con azul Instant (Expedeon) tal como se muestra en la Figura 14. El carril con etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. Los carriles con etiquetas 1 y 2 se obtienen a partir del 1 30 equivalente de mezcla de reaccion PEG 5 kDa y 3 equivalentes de mezcla de reaccion PEG, respectivamente. La banda con la etiqueta A es Hiss-beta sinuclema. Las bandas tenues debajo de la misma son impurezas de la protema suministrada por Abcam. Las bandas con etiquetas, B, C, D y E que corresponden a productos de protema mono- PEGilado, di-PEGilado, tri-PEGilado y tetra-PEGilado, respectivamente.
Ejemplo 7: PEGilacion 10 kDa de fragmento de anticuerpo de dominio His6-anti TNF-a a diferentes valores de pH
35 Se preparo monosulfona PEG 10 kDa (estructura (2) del ejemplo 1) mediante incubacion de la bis-sulfona PEG (estructura (1) del ejemplo 1, 10 mg/ml) en tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 7,8 (5 mg/ml) durante 3 horas. La solucion (0,6 mg/ml) de fragmento de anticuerpo de dominio alfa anti-TNF marcado con 6 x histidina C-terminal (12,7 kDa) en fosfato sodico 50 mM, cloruro sodico 150 mM y EDTA 2 mM se preparo a 4 pH diferentes (pH 6,2, pH 6,7, pH 7,0 y pH 7,4). Se anadieron tres equivalentes molares de monosulfona PEG 10 kDa ((2), 1,41 pl) a las soluciones de dominio 40 His6 a cada uno de los cuatro diferentes valores de pH (10 pl, 0,6 mg/ml). A continuacion, las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas.
Las soluciones de reaccion resultantes se analizaron usando SDS-PAGE y se tineron con azul Instant (Expedeon) tal como se muestra en la Figura 15. El carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen). Los carriles con las etiquetas 1 a 4 se obtienen de la mezcla de reaccion usando 3 equivalentes molares de 45 PEG 10 kDa a pH 6,2, pH 6,7, pH 7,0 y pH 7,4 respectivamente. La banda con la etiqueta A es fragmento de anticuerpo de dominio His6-anti-TNF alfa sin reaccionar. La banda con la etiqueta B es el producto de dominio mono-PEGilado. Las bandas con etiquetas C y D corresponden a fragmento de dominio di-PEGilado y tri-PEGilado, respectivamente. La PEGilacion se observa en cada uno de los cuatro valores de pH y el grado de PEGilacion aumenta a medida que se
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aumenta el pH.
Ejemplo 8: PEGilacion de fragmento de anticuerpo de dominio His6-anti TNF-a usando PEG 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa.
Las bis-sulfonas PEG 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa (estructura (1) del ejemplo 1) se incubaron por separado en tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 7,8 durante 3 horas a temperature ambiente para dar las mono-sulfonas PEG correspondientes (estructura (2) del ejemplo 1). La concentracion de PEG era de 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml y 40 mg/ml para PEG 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa, respectivamente. Cuatro partes alfcuotas de la solucion (12,7kDa) de anticuerpo de dominio anti-TNF marcado con 6 * histidina C-terminal (1,25 mg/ml, 5 jl) en fosfato sodico 50 mM, cloruro sodico 150 mM y EDTA 2 mM se anadieron a continuacion con las soluciones mono-sulfona PEG 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa (0,74 jl, 1,5 equivalentes molares). A continuacion, las reacciones se incubaron a 4°C durante 8 horas. A continuacion, las soluciones de reaccion se analizaron usando SDS-PAGE tal como se muestra en la Figura 16. El carril con etiqueta M muestra los marcadores de proterna Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. El carril con etiqueta 1 es el fragmento de anticuerpo de dominio His6-anti TNF mostrado como referencia. Los carriles con las etiquetas 2 a 5 se obtienen a partir de la reaccion de PEGs 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa y 40 kDa, respectivamente. Las bandas con etiqueta A son dominio His6-anti-TNF sin reaccionar. Las bandas con etiquetas B (B10, B20, B30 y B40) corresponden a los fragmentos de dominio mono-PEGilado para PEG 10, 20, 30 y 40 kDa, respectivamente. La banda con la etiqueta C10 corresponde al producto di-PEGilado para la reaccion de PEG 10 kDa y la banda C20 corresponde al producto di-PEGilado para la reaccion de PEG 20 kDa.
Ejemplo 9: PEGilacion 2 kDa de His6-endostatina y reaccion comparativa con endostatina que no posee un marcador de polihistidina.
Se preparo monosulfona PEG 2 kDa (estructura (2) del ejemplo 1) mediante incubacion de la bis-sulfona PEG (estructura (1)) del ejemplo 1) en tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 7,8 (1 mg/ml) durante 4 horas. Dos partes alfcuotas de endostatina marcadas con 6 * histidina C-terminal (Calbiochem cat. No. 324743) en fosfato sodico 50 mM pH 6,2 (30 jl, 0,5 mg/ml) se enfriaron en hielo, a continuacion se anadieron 1 equivalente molar (con respecto a la concentracion de proterna) o 3 equivalentes de mono-sulfona PEG 2 kDa (1,4 jl o 4,2 jl, respectivamente). A continuacion, la mezcla de reaccion se coloco en la nevera y se dejo durante 16 horas.
Dos partes alfcuotas de endostatina no marcada (Calbiochem cat. No. 324769) en fosfato sodico 50 mM pH 6,2 (10 jl, 0,2 mg/ml) se enfriaron tambien en hielo, a continuacion se anadieron 1 equivalente molar (con respecto a la concentracion de proterna) o 3 equivalentes de mono-sulfona PEG 2 kDa (0,1 mg/ml) (2,0 jl o 6,0 jl respectivamente). A continuacion, la reaccion se coloco en la nevera y se dejo durante 16 horas.
Las soluciones de reaccion resultantes se analizaron usando SDS-PAGE para la separacion dependiente del tamano de sus constituyentes y el gel resultante despues de la tincion con azul Instant (Expedeon) se muestra en la Figura 17. En la Figura 17, la columna de la izquierda de puntos con etiqueta M muestra los marcadores de proterna Novex Sharp (Invitrogen). El carril con la etiqueta 1 se obtiene a partir de la muestra del 1 equivalente de PEG 2 kDa con reaccion His6- endostatina y muestra bandas, con etiquetas B y C que corresponden a la proterna sin reaccionar, y productos mono- PEGilados, respectivamente. El carril con la etiqueta 2 se obtiene a partir de la muestra del 3 equivalente de PEG 2 kDa con reaccion His6-endostatina y muestra bandas, con etiquetas B y C, que corresponden a la proterna sin reaccionar y al producto mono-PEGilado, respectivamente. Los carriles con las etiquetas 3 y 4 se obtuvieron a partir del 1 equivalente de PEG 2 kDa con reaccion de endostatina y 3 equivalentes de PEG 2 kDa con reaccion de endostatina respectivamente. Solo hay presente una unica banda con la etiqueta A y B, respectivamente, que corresponde a la proterna sin reaccionar para ambas reacciones, mostrando que el PEG 2 kDa solo reacciona con la His6-endostatina.
Ejemplo 10. PEGilacion 20 kDa y 30 kDa de Hiss-interferon alfa y reaccion de comparacion con interferon alfa no marcado con histidina.
Se preparo una solucion de interferon a-2b marcado con 8 * histidina N-terminal (2,63 ml, 1,14 mg/ml) en tampon de fosfato sodico 50 mM pH 7,4 que conterna cloruro sodico 150 mM (PBS) y, a continuacion, se anadio 1,7 equivalentes molares (con respecto a la concentracion de proterna) de bis-sulfona PEG 20 kDa (estructura (1) del ejemplo 1)
(420 jl de 11,5 mg/ml de solucion de bis-sulfona PEG 20 kDa en agua desionizada). La reaccion se coloco en el refrigerador durante 18 horas. La mezcla de reaccion resultante se analizo usando SDS-PAGE y el resultado se muestra en la Figura 18. En la Figura 18, el carril con la etiqueta M muestra los marcadores de proterna Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. El carril con etiqueta 1 muestra la solucion de reaccion donde la banda con la etiqueta A corresponde a IFN sin reaccionar, la banda con la etiqueta B a IFN monoPEGilado, la banda con la etiqueta C a IFN diPEGilado y la banda con la etiqueta D a IFN triPEGilado.
Una segunda reaccion con un equivalente de PEG 30 kDa en 0,5 mg/ml y una solucion de interferon a-2b marcado con 8 * histidina N-terminal (3,2 ml, 0,793 mg/ml) a pH 7,5. El resultado fue similar a la reaccion 20 kDa con una banda de IFN
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mono-PEGilado visible entre los marcadores de protema de 60 y 80 kDa, una banda de entre 110 y 160 kDa que corresponde a IFN di-PEGilado y una tercera banda entre los marcadores de protema de 160 y 260 kDa correspondiente a IFN tri-PEGilado. Una comparacion con IFN alfa-2b no marcado con histidina no mostro reaccion con un equivalente de reactivo de PEG (1) despues de 18 horas y bajo las mismas condiciones, con el resultado mostrado en el carril 2 de la Figura 18.
Ejemplo 11. Uso de poli(vinil pirrolidona) (PVP bis-sulfona) para la conjugacion a interferon alfa marcado con 8 x histidina N-terminal
Preparacion de PVP con un grupo amina terminal: Un tubo de presion se cargo con cisteamina (0,042 g), dioxano (8 ml) y una barra de agitacion magnetica. Despues de un calentamiento suave para permitir la formacion de una solucion, la solucion se purgo con argon a temperatura ambiente durante 5 minutos. Mientras todavfa estaba siendo purgada, se anadio a continuacion 1 -vinil-2-pirrolidona (2,0 g) y, despues de otros 5 minutos fue seguido por 2,2'-azobis (2- metilpropionitrilo) (0,089 g). Despues de 2 minutos adicionales, el tubo de presion se sello con un tapon de rosca bajo atmosfera de argon y se coloco en un bano de aceite a 60°C durante 23 horas con agitacion. Despues de permitir que el tubo y el contenido se enfriaran a temperatura ambiente, se anadio eter dietflico (15 ml) causando la precipitacion del producto polimerico. La fase flquida se decanto y el residuo solido se volvio a disolver en acetona (3 ml). A continuacion, se anadio gota a gota la solucion de acetona resultante a eter dietflico (25 ml) agitado rapidamente y el precipitado se aislo sobre un embudo de vidrio sinterizado n° 2 con una ligera rafaga de vado. El solido se lavo con eter dietflico fresco (10 ml) y, a continuacion, se dejo secar bajo vado a temperatura ambiente (masa = 1,24 g, solido blanco).
Conjugacion de grupo final reactivo de protema a PVP-amina: PVP-amina (500 mg), acido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil) metil]acetil]benzoico (125 mg) y 4 dimetilaminopiridina (6 mg) se mezclaron con diclorometano anhidro (10 ml) bajo atmosfera de argon y con agitacion y, a continuacion, se anadio 1,3-diisopropilcarbodiimida (80 pl). La mezcla resultante se dejo en agitacion durante 20 horas a temperatura ambiente y, a continuacion, se filtro a traves de lana de algodon no absorbente. A continuacion, al filtrado se anadio eter dietflico (20 ml) y el precipitado resultante se aislo por centrifugacion (2.000 rpm, 2 minutos, 2°C). La fase flquida se separo por decantacion y el residuo restante se sometio a agitacion vorticial con acetato de etilo (5 ml) durante varios minutos. Despues de separar mediante decantacion la fase de acetato de etilo, el residuo solido se volvio a disolver en diclorometano (5 ml) seguido por la adicion de acetato de etilo (15 ml). La solucion se puso en hielo seco durante 15 minutos resultando en la precipitacion de un solido que, a continuacion, se aislo mediante centrifugacion (2.000 rpm, 2 minutos, 2°C). El residuo pegajoso obtenido se sometio a agitacion vorticial con acetato de etilo fresco (5 ml) y, a continuacion, se seco bajo vado a temperatura ambiente (masa = 0,118 g).
Fraccionamiento de PVP bis-sulfona: El material solido obtenido a partir de la etapa anterior se mezclo con tampon de acetato de sodio acuoso 20 mM, NaCl 150 mM, pH 4,0 y, a continuacion, se centrifugo a 13.000 rpm hasta que pudo observarse una solucion clara. La fase de solucion se elimino del residuo solido y, a continuacion, se fracciono en una columna de exclusion por tamano de grado 200 prep HiLoad 16/60 Superdex™ (GE Healthcare) con tampon de acetato sodico 20 mM, 150 mM, pH 4,0 a 1 ml/min recogiendo fracciones cada 1 minuto durante la elucion de pico. Las fracciones que eluyeron entre 72 a 80 minutos se usaron para la conjugacion de protemas.
Conjugacion PVP a IFN alfa marcado con 8 x histidina N-terminal: Se preparo IFN (0,025 mg, 0,5 mg/ml) en tampon de fosfato sodico 50 mM 7,5, que contema cloruro sodico 150 mM (PBS). A 50 pl de IFN (25 |jg, 0,5 mg/ml) se anadieron 50 pl de la solucion de PVP bis-sulfona fraccionada (fracciones 72 minutos, 74 minutos, 76 minutos, 78 minutos y 80 minutos). La solucion resultante se mezclo suavemente y se dejo a 4°C durante la noche. La solucion de reaccion resultante se analizo usando SDS-PAGE y el resultado se muestra en la Figura 19. En la Figura 19, el carril con la etiqueta M muestra los marcadores de protema Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. Los carriles con las etiquetas 2 a 5 muestran las soluciones de reaccion a partir de las fracciones de reactivo PVP de tamanos diferentes usadas (fracciones de PVP de 72 minutos a 80 minutos de 2 a 5, respectivamente). Las bandas con etiquetas B muestran el IFN mono- y multi-IFN PVPilado obtenido.
Ejemplo 12. Conjugacion multimerica de interferon alfa con interferon alfa usando interferon alfa marcado con 8 x histidina N-terminal
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Se prepare una solucion de interferon a-2b marcado con 8 * histidina N-terminal (50 pl, 1,14 mg/ml) en tampon de fosfato sodico 50 mM pH 7,5, que conterna cloruro sodico 150 mM (PBS) y, a continuacion, se anadieron 0,125 equivalentes molares (con respecto a la concentracion de proterna) de reactivo PEG bifuncional de PEG 10 kDa (6) (0,47 pl de una solucion de 8 mg/ml de (6) en agua). La reaccion se dejo a temperature ambiente durante 18 horas. La mezcla de 5 reaccion resultante se analizo usando SDS-PAGE. El gel resultante mostro una banda entre los marcadores de proterna Novex Sharp (Invitrogen) de 50 kDa y 60 kDa despues de la tincion con azul Instant (Expedeon) que corresponde al conjugado de fusion IFN-PEG-IFN.
Ejemplo 13. Conjugacion multimerica de interferon alfa marcado con 8 x histidina N-terminal con albumina de suero humano (HSA) que conterna una cistema libre.
10 A una solucion de interferon a-2b marcado con 8 * histidina N-terminal (1 ml, 1,14 mg/ml) preparada en tampon de fosfato sodico 50 mM pH 7,5 que conterna cloruro sodico 150 mM (PBS) se anadio albumina de suero humano (3 equivalentes molares a IFN, 10,77 mg) y se dejo disolver. A esta solucion se anadio bis(bis-sulfona) PEG 10 kDa (estructura (6) del ejemplo 12) (1 equivalente molar a IFN, 75 pl de 8 mg/ml bis (bis-sulfona) PEG 10 kDa (6) solucion en agua). La mezcla de reaccion se dejo a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reaccion resultante se 15 purifico mediante cromatograffa de intercambio ionico seguida de cromatograffa de afinidad de iones metalicos y, a continuacion, se analizo usando SDS-PAGE y el resultado se muestra en la Figura 20. En la Figura 20, el carril con la etiqueta M muestra los marcadores de proterna Novex Sharp (Invitrogen) usados como calibradores. El carril con la etiqueta 1 muestra la solucion de reaccion purificada, en la que la banda con la etiqueta A es IFN sin reaccionar, la banda con la etiqueta B es IFN mono-PEGilado, la banda con la etiqueta C es IFN-PEG-IFN y la banda con la etiqueta D es IFN- 20 PEG-albumina.

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de preparacion de un compuesto de la formula general
    imagen1
    en la que uno de entre X y X' representa un polnriero, y el otro representa un atomo de hidrogeno; cada Q representa independientemente un grupo de enlace;
    W representa un resto aceptor de electrones o un resto que puede prepararse por reduccion de un resto aceptor de electrones; o, si X' representa un polfmero, X-Q-W-juntos pueden representar un grupo aceptor de electrones; y ademas, si X representa un polfmero, X' y un grupo W aceptor de electrones junto con los atomos interyacentes pueden formar un anillo;
    Z representa una protema o un peptido unido a A y B a traves de residuos de histidina contenidos en un marcador de polihistidina unido a dicha protema o peptido y que contiene de 2 a 12 residuos de histidina;
    A es una cadena alquileno o alquenileno C1-5; y
    B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4;
    que comprende hacer reaccionar (i) un compuesto de la formula general
    imagen2
    en la que:
    X, X', Q, A y B tienen los significados proporcionados anteriormente;
    W' representa un grupo aceptor de electrones; o, si X' representa un polfmero, X-Q-W' juntos pueden representar un grupo aceptor de electrones; y
    cada L representa independientemente un grupo saliente;
    o (ii) un compuesto de la formula general
    imagen3
    en la que X, X', Q, W', A y L tienen los significados proporcionados para la formula general II y, ademas, si X representa un polfmero, X' y un grupo W' aceptor de electrones junto con los atomos interyacentes pueden formar
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    un anillo, y m representa un numero entero de 1 a 4; con una protema o un peptido que tiene un marcador de poNhistidina unido a dicha protema o peptido y que contiene de 2 a 12 residuos de histidina; y, si se desea, reduciendo el grupo W aceptor de electrones.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, que se realiza a un pH comprendido en el intervalo de 6,8 a 8,5.
  3. 3. Procedimiento segun cualquiera de entre la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el marcador de polihistidina contiene al menos 3 residuos de histidina.
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, en el que el marcador de polihistidina contiene de 4 a 10 residuos de histidina.
  5. 5. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el polfmero es un polialquilenglicol, una polivinilpirrolidona, un poliacrilato, un polimetacrilato, una polioxazolina, un alcohol polivinilico, una poliacrilamida, una polimetacrilamida, un copolfmero de HPMA, un poliester, poliacetal, poli(orto-ester), policarbonato, poli(carbonato de imino), poliamida, un copolfmero de un oxido de alquileno y un poliester, poliacetal, poli(orto-ester), o poli(aminoacido), un polisacarido, una protema, acido poliglutamico, un copolfmero de un sacarido o un aminoacido y un monomero sintetico, o un copolnriero de divinileter-anhndrido maleico y estireno-anhfdrido maleico.
  6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que el polnriero es un polialquilenglicol.
  7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que el polfmero es un polialquilenglicol que contiene unidades C2 y/o C3.
  8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que el polnriero es un polietilenglicol.
  9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que el po^meno es una protema.
  10. 10. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que dicha protema o peptido conjugado es un peptido, polipeptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, enzima, citoquina, quimioquina, receptor, factor sangumeo, hormona peptfdica, toxina, protema de transcripcion o protema multimerica.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que dicha protema o peptido conjugado es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
  12. 12. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que cada Q representa independientemente un enlace directo, un grupo alquileno C1-10, o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, cualquiera de los cuales puede estar terminado o interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, grupos -NR en la que R representa un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo o un grupo arilo, grupos ceto, grupos -O-CO- y/o grupos -CO-O-.
  13. 13. Procedimiento segun la reivindicacion 12, en el que Q es un grupo alquileno o un enlace directo.
  14. 14. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en el que W representa un grupo ceto o aldehfdo CO, un grupo ester -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, o un grupo obtenido por reduccion de dicho un grupo; o en el que X- Q-W-juntos representan un grupo aceptor de electrones.
  15. 15. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en el que X es un pol^ero, y X'-Q- es H-.
  16. 16. Un compuesto de la formula general
    X—Q—W . A
    Z
    /
    X'-Q B
    (la)
    en la que uno de entre X y X' representa un pol^ero, y el otro representa un atomo de hidrogeno; cada Q representa independientemente un grupo de enlace;
    W representa un resto aceptor de electrones o un resto que puede prepararse por reduccion de un resto aceptor de electrones; o, si X' representa un polfmero, X-Q-W- juntos pueden representar un grupo aceptor de electrones; y ademas, si X representa un polfmero, X' y un grupo W aceptor de electrones junto con los atomos interyacentes pueden formar un anillo;
    10
    Z representa una protema o un peptido unido a A y B a traves de residuos de histidina contenidos en un marcador de polihistidina unido a dicha protema o peptido y que contiene de 2 a 12 residuos de histidina;
    A es una cadena alquileno o alquenileno C1-5; y
    B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4;
    en el que dicho compuesto ha sido preparado mediante un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
  17. 17. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun la reivindicacion 16, junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
  18. 18. Un compuesto segun la reivindicacion 16, o una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 17, para su uso en terapia.
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