JP5933923B2 - 新規な複合タンパク質及びペプチド - Google Patents
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Description
チドに付着される。
Xはポリマーを表し、
Q’は連結基を表し、
(his)uはu個のヒスチジン単位を含有するポリヒスチジンタグを表し、そして
Zは前記ヒスチジンタグを介して結合したタンパク質又はペプチドを表す。)
X及びX’の1つはポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Qは独立して連結基を表し、
Wは電子求引性部位又は電子求引性部位の還元により調製される部位を表し、
もしくは、X’がポリマーを表す場合は、X−Q−W−は一緒に電子求引性基を表
してもよく、そして更に、
もしくは、Xがポリマーを表す場合は、中間にある原子と一緒にX’及び電子求引
性基Wは環を形成してもよく、
Zは各ヒスチジン残基によってA及びBに連結されたタンパク質又はペプチドを表
し、
Aは炭素原子数1乃至5のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Bは結合又は炭素原子数1乃至4のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。)
で表される化合物を提供する。
Xはポリマーを表し、
Qは連結基を表し、
Wは電子求引性基又は電子求引性部位の還元により調整される部位を表し、
vは0又は1乃至4の整数を表し、
v’は1乃至8の整数を表し、そして
Zはポリヒスチジンタグを介して結合したタンパク質又はペプチドを表す。)
によって表される。
また本発明は、以下の[1]乃至[15]に記載された方法を提供する。
[1]一般式
X及びX’の1つはポリアルキレングリコール及びポリビニルピロリドンから選ばれる水溶性合成ポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Qは独立して直接結合、炭素原子数1乃至10のアルキレン基、又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基[それらのいずれかは1個以上の酸素原子、硫黄原子、−NR基(式中、Rは水素原子又はアルキル基又はアリール基、ケト基、−O−CO−基及び/又は−CO−O−基を表す。)により終端又は中断されていてもよい]から選ばれる連結基を表し、
WはCO基又は
Zはポリヒスチンタグを介してA及びBに連結されたタンパク質又はペプチドを表し、
Aは炭素原子数1乃至5のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Bは直接結合又は炭素原子数1乃至4のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。)
で表される化合物の調製方法であり、
該方法は
(i)一般式
W’はCO基を表し、そして
各Lは独立して−SR、−SO 2 R、−OSO 2 R、−N + R 3 、−N + HR 2 、−N + H 2 R、ハロゲン原子、又は−OΦ{式中、Rは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表し、そしてΦは少なくとも1つの置換基を含有する置換アリール基を表し、該少なくとも1つの置換基は−CN、−NO 2 、−CO 2 R、−COH、−CH 2 OH、−COR、−OR
、−OCOR、−OCO 2 R、−SR、−SOR、−SO 2 R、―NHCOR、−NRCOR、−NHCO 2 R、−NR’CO 2 R、−NO、−NHOH、−NR’OH、−C=N−NHCOR、−C=N−NR’COR、−N + R 3 、−N + HR 2 、−N + H 2 R、ハロゲン原子、特に塩素原子又は特にフッ素原子、−C≡CR、−C=CR 2 及び−C=CHR(式
中、R及びR’のそれぞれは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表す。)から選ばれる}から選ばれる脱離基を表す。]
で表される化合物
又は
(ii)一般式
X、X’、Q、W’、A及びLは一般式IIと同義であり、そして
mは整数1乃至4を表す。)
で表される化合物
のいずれかを、ポリヒスチジンタグを含有するタンパク質又はペプチドと、複合が前記ポリヒスチジンタグを介して起こるような条件下で、反応させることを含む、方法。
[2]一般式(II)又は(III)で表される化合物とタンパク質又はペプチドとの反応後、CO基を還元して
[3]前記ポリヒスチジンタグは2乃至12個のヒスチジン残基を含有する、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記ポリヒスチジンタグは4乃至10個のヒスチジン残基を含有する、[3]に記載の方法。
[5]前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、[1]乃至[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6]前記ポリマーがC 2 及び/又はC 3 単位を含有する、ポリアルキレングリコールである、[5]に記載の方法。
[7]前記ポリマーがポリエチレングリコールである、[6]に記載の方法。
[8]前記タンパク質又はペプチドがポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、血液因子、ペプチド・ホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質である、[1]乃至[7]のいずれか1つに記載の方法。[9]前記タンパク質又はペプチドが抗体又は抗体フラグメントである、[8]に記載の方法。
[10]前記タンパク質又はペプチドは、その表面上の感応性基を保護するべく、1つ以上の保護基と反応された天然タンパク質であるか、又は1個以上のポリマー、治療又は診断に用いる小分子、シアル酸、糖類、及び/又は澱粉と付加的に複合するタンパク質である、[1]乃至[9]のいずれか1つに記載の方法。
[11]前記Qがアルキレン基又は直接結合である、[1]乃至[10]のいずれか1つに記載の方法。
[12]前記Xがポリマー、及びX’−Q−がH−である、[1]乃至[11]のいずれか1つに記載の方法。
[13]6.8乃至8.5の範囲のpHで行われる、[1]乃至[12]のいずれか1つに記載の方法。
[14]7.0乃至8.0の範囲のpHで行われる、[13]に記載の方法。
[15]7.5乃至8.0の範囲のpHで行われる、[14]に記載の方法。
を含有する。それらはヒスチジン残基のみを含有してもよく、またはヒスチジン残基に加えて、1個以上のスペーサー残基又は配列も含んでいても良い。
は好ましくは、アルキル基、アリール基、アルカリル基又はアラルキル基、特にトリル基を表す。)を使用して説明され、添付図面の図1に示される。図2(a)及び2(b)は図1の方法によって調製される別の複合体を示す。図1及び2において結合は隣接したヒスチジン残基にあるが、もし間隔が複合体の形成を妨げるほど大きくない場合は、間隙を介したヒスチジン残基への結合は不可能ではないと考えられる。
コールは適当な基、例えばアルコキシ基、具体的にはメトキシ基、アリールオキシ基、カルボキシ基又はヒドロキシ基により開始され、そして以下に述べるように鎖の反対側の端で連結基Q又はQ’に結合される。
炎症治療用のために、2000乃至30,000g/molの範囲でより低分子量のモノマーを使用するのが有利である。有用性のために、一般式Iで表される化合物が血液循環中にある場合には、より高分子量のモノマー、例えば20,000乃至75,000g/molの範囲内で使用するのが有利である。
ラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンを含む。ポリマーへの連結は、加水分解に不安定な結合法により、又は非不安定な結合によりされてもよい。
O2R、−SR、−SOR、−SO2R、−NHCOR、−NRCOR、−NHCO2R、
−NR’CO2R、−NO、−NHOH、−NR’OH、−C=N−NHCOR、−C=
N−NR’COR、―N+R3、−N+H3、―N+HR2、―N+H2R、ハロゲン原子、例えばフッ素原子又は塩素原子、―C≡CR、−C=CR2及び−C=CHR{式中、各R又
はR’は独立して水素原子又はアルキル基(好ましくは炭素原子数1乃至6のアルキル基)又はアリール基(好ましくはフェニル基)を表す。}から選ばれる同一又は異なった置換基を例えば1個以上含む。電子求引置換基の存在は特に好ましい。
O)R、アミン基CH.NH2、CH.NHR又はCH.NR2、又はアミド基CH.NHC(O)R又はCH.N(C(O)R)2、のような基を還元して得られる基を表す。X
−Q−W−が一緒に電子求引基を表す場合、この基は例えばシアノ基でもよい。
約6乃至約8.5の間であり、例えば約6.5乃至8.0であり、好ましくは約7.0乃至約7.5である。反応混合物中、タンパク質又はペプチドの濃度は一般的に0.20mg/mL以上であり、通常は0.4mg/mL以上であり、例えば0.5mg/mL乃至1.5mg/mLである。前記方法が国際公開2005/007197号に記載の二官能性試薬を使用する場合、該方法は(i)一般式
X及びX’の一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し、
Qは連結基を表し、
W’は電子求引基、例えばケト基、エステル基−O−CO−又はスルホン基−SO2−
、又は、X’がポリマーを表す場合は、X−Q−W’と一緒に電子求引基を表し、
Aは炭素原子数1乃至5のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、
Bは結合又は炭素原子数1乃至4のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
各Lは独立して脱離基を表す。)
で表される化合物
又は
(ii)一般式
X、X’、Q、W’、A及びLは一般式IIと同義であり、さらにXがポリマーを表す場合は、中間にある原子と一緒にX’及び電子求引性基W’は環を形成してもよく、
そして
mは請求1乃至4を表す。)
で表される化合物
のいずれかを、少なくとも2個のヒスチジン残基を含有するタンパク質又はペプチドと反応させることを含む。
R2、−N+H2R、ハロゲン原子、又は−OΦ[式中、Rは上記と同義で有り、そしてΦ
は置換されたアリール基、特に少なくとも1個の電子求引基、例えば−CN、−NO2、
−CO2R、−COH、−CH2OH、−COR、−OR、−OCOR、−OCO2R、−
SR、−SOR、−SO2R、―NHCOR、−NRCOR、−NHCO2R、−NR’CO2R、−NO、−NHOH、−NR’OH、−C=N−NHCOR、−C=N−NR’
COR、−N+R3、−N+HR2、−N + H 2 R、ハロゲン原子、特に塩素原子、特にフッ素原子、−C≡CR、−C=CR2及び−C=CHR(式中、R及びR’は上記と同義であ
る。)]を含有するフェニル基を表す。
、及び
切見られないことを意味する。それ故に、例えばポリヒスチジンタグによるPEG化、Wの還元、それからタンパク質中のジスルフィド結合の還元、そして還元されたジスルフィド結合の至る所での一連のPEG化を行うことが可能である。いくつかのタンパク質に対し、基Wの還元をしないで、そのような方法を実行することは可能である。
X、Q、V及びV’は上記と同義であり、
W’は電子求引基を表し、そして
Lは脱離基を表す。)
で表される化合物によって表される。
そのような複合方法に由来する直接的な生成物は、式Ib(Wは電子求引基を表す。)
で表される化合物である。必要に応じて、この結果として生じる式Ibで表される化合物は、他の所望の生成物に変換され得る。具体的には、上述のように、電子求引基は還元されてもよい。
一般式IVで表される特に好ましい試薬は、一般式IVa:
Arは未置換の又は置換されたアリール基、特にフェニル基を表し、ここで
は任意の置換基は連結基Qに含有されるアリール基に対し、上述で言及された
ものから選ばれ、そして
R、W’、v及びv’は上記と同義である。)
を有する。
で表される中間化合物の形成により、上記式IVで表される試薬を用いた複合方法が進行すると考えられる。複合させるための分子の存在下、式Vで表される化合物を発生させることが好ましい場合、相対的に高いpHは最適に完全に使用される。あるいは、単離段階で上記式Vで表される化合物を発生させ、そして複合させるために頻繁に分子を加えることが好ましい場合、初期段階は相対的に高いpH(例えば、7.5乃至8.0)で最適に行われ、一方、次の段階はより低いpH(例えば、6.0乃至6.5)で最適に行われる。
を達成するために、2つの相違するポリマー、例えばタンパク質とPEG、を別のタンパク質に加えることを望むとき、これは望ましい。そのような多量複合は従来の複合技術で実現するのは多くの場合、困難である。
ン酸ナトリウム緩衝液(10mg/mL)において、PEGビス−スルホン(構造(1))のインキュベーションにより調整した。pH7.8、50mMリン酸ナトリウム(10μL、0.5mg/mL)において、C末端の6個のヒスチジンタグProBNP(アブカム(Abcam)、ab41402、13kDa)の2つのアリコートを氷上で冷やし、その後12kDa PEGモノ−スルホンを(タンパク質濃度に対して)1モル当量又は3モル当量のいずれかを加えた(各々1.6μL又は4.8μL)。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、16時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにSDS−PAGEを用いて分析し、そしてインスタントブルーステイン(ノベクサン(Novexin))で染色後得られたゲルを図4に示す。図4では、レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1において標識Bが付されたバンドは、供給されたHis6−proBNPのサンプル(アブカム(Abc
am)、1mg/mL)である。バンドAは不純物である。レーン2は、1当量の12kDa PEG反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物、ジ−PEG化生成物及びトリ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識C、D及びEが付されたバンドを示す。標識A及びBが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、未反応のHis6−proBNP及び不純物にそれぞれ相当する。レーン3は、3当量の12kDa P
EG反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物、ジ−PEG化生成物及びトリ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識C、D及びEが付されたバンドを示す。標識B及びAが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、未反応のHis6−pr
oBNP及び不純物にそれぞれ相当する。
その後、ゲルもまた図5に示される結果と共にPEGを可視化するためにヨウ化バリウムで染色した。レーン1におけるバンドは標識Cが付された未反応のPEG試薬、そしてモノ−PEG化生成物、ジ−PEG化生成物及びトリ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識D、E及びFが付されたバンドに相当する。標識B及びAが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、それぞれ未反応のHis6−proBNP及び不純物に
相当する。12kDa PEG反応混合物の3当量から得られたレーン3は、未反応のPEG試薬に相当する標識Cが付されたバンドとモノ−PEG化生成物、ジ−PEG化生成物及びトリ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識D、E及びFが付されたバンドを示す。標識B及びAが付された下側のバンドは提供されたサンプルにおいて、未反応のHis6−proBNP及び不純物にそれぞれ相当する。
30kDa PEGモノ−スルホン(実施例1における構造(2))を5時間、pH7.8、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(10mg/mL)において、PEGビス−スルホン(実施例1における構造(1))のインキュベーションにより調整した。pH7.8、50mMリン酸ナトリウム(10μL、0.5mg/mL)において、C末端の6個のヒスチジンタグProBNP(アブカム(Abcam)、ab51402)の2つのアリコートを氷上で冷やし、その後30kDa PEGモノ−スルホンを(タンパク質濃度に対して)1モル当量又は3モル当量のいずれかを加えた(各々2.0μL又は6.0μL)。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、16時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにSDS−PAGEを用いて分析し、そしてインスタントブルーステイン(ノベクサン(Novexin))で染色後得られたゲルを図6に示す。レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1において標識Bが付されたバンドは、供給されたHis6−proBNPのサンプル(アブカム(Abcam)、1
mg/mL)である。バンドAは不純物である。レーン2は、1当量の30kDa PE
G
反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物に相当する標識Cが付されたバンド並びに、提供されたサンプルにおいて、未反応のHis6−proBNP及び不純物にそ
れぞれ相当する標識A及びBが付された下側のバンドを示す。レーン3は、3当量の30kDa PEG反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物及びジ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識C及びD及が付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のHis6−proBNP及び不純物に相当する標識A及びBが付された下
側のバンドを示す。
その後、ゲルもまたPEGを可視化するためにヨウ化バリウムで染色し、結果として生じたゲルを図7に示す。レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1において標識Bが付されたバンドは、提供されたHis6−proBNPのサンプル(アブカム(Abcam)、1m
g/mL)である。バンドAは不純物である。レーン2は、1当量の30kDa PEG反応混合物から得られ、そして未反応のPEG試薬に相当する標識Cが付されたバンド、P
EG不純物に相当する標識Fが付されたバンド、モノ−PEG化生成物及びジ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識D及びEが付されたバンド、そして提供されたサンプルにおいて、未反応のHis6−proBNP及び不純物にそれぞれ相当する標識B及びAが
付された下側のバンドを示す。レーン3は3当量の30kDa PEG反応混合物から得られ、未反応のPEG試薬に相当する標識Cが付されたバンド、PEG不純物に相当する標識Fが付されたバンド、モノ−PEG化及びジ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識D及びEが付されたバンド、提供されたサンプルにおいて未反応のHis6−p
roBNP及び不純物にそれぞれ相当する標識B及びAが付された下側のバンドを示す。
ベータシヌクレインとの比較反応
12kDa PEGモノ−スルホン(実施例1における構造(2))を5時間、pH7.8、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(10mg/mL)において、PEGビス−スルホン(実施例1における構造(1))のインキュベーションにより調整した。pH7.8、50mMリン酸ナトリウム(10μL、0.39mg/mL)において、N末端の8個のヒスチジンベータシヌクレイン(アブカム(Abcam)、ab40545、15kDa)の2つのアリコートを氷上で冷やし、その後12kDa PEGモノ−スルホンを(タンパク質濃度に対して)1モル当量又は3モル当量のいずれかを加えた(各々1.6μL又は4.8μL)。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、16時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにSDS−PAGEを用いて分析し、そしてインスタントブルー(ノベクサン(Novexin))で染色後得られたゲルを図8に示す。レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質
マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1において標識Bが付されたバンドは、アブカム(Abcam)により、提供されたHis8−ベータシヌクレインのサンプル
(0.8mg/mL)である。バンドAは不純物である。レーン2は、1当量の12kDa PEG反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物及びジ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識C及びDが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のHis8−ベータシヌクレイン及び不純物にそれぞれ相当する標識A及びBが付
された下側のバンドを示す。レーン3は、3当量の12kDa PEG反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物、ジ−PEG化生成物、トリ−PEG化生成物及びテトラ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識C、D、E及びFが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のHis8−ベータシヌクレイン及び不純物にそれ
ぞれ相当する標識A及びBが付された下側のバンドを示す。
その後、ゲルもまたPEGを可視化するためにヨウ化バリウムで染色し、結果として生じたゲルを図9に示す。図9において、レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen)を示す。レーン1は、アブカム(Abcam)により提供されたHis8−ベータシヌクレインから得られる。レーン2は
、1当量の12kDa PEG反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物、ジ−PEG化生成物及びトリ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識C、D及びEが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のHis8−ベータシヌクレイン
及び不純物にそれぞれ相当する標識B及びAが付された下側のバンドを示す。レーン3は3当量の12kDa PEG反応混合物から得られ、そしてモノ−PEG化生成物、ジ−PEG化生成物、トリ−PEG化生成物、及びテトラ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識D、E及びFが付されたバンド並びに提供されたサンプルにおいて、未反応のHis8−ベータシヌクレイン及び不純物にそれぞれ相当する標識B及びAが付された下側の
バンドを示す。バンドCはPEG不純物である。
比較の12kDa PEG化の研究は、pH7.0において1当量のPEG試薬(2)を使用してHis8−ベータシヌクレインと非ヒスチジンタグベータシヌクレイン(アブ
カム(Abcam)、cat.no.ab48853)との間で行い、SDS−PAGEの結果を図10に示す。レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(NovexSharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。His8−ベータシヌクレインの結果を
標識レーン1に示す。レーン1において、標識Bが付されたバンドは未反応のHis8−
ベータシヌクレインであり、標識Cが付されたバンドはモノ−PEG化His8−ベータ
シヌクレインである。標識2が付されたレーンは非ヒスチジンタグベータシヌクレイン反応を示し、そして可視バンドのみ標識Aが付され、非ヒスチジンタグベータシヌクレインである。レーン2にはPEG化タンパク質バンドはなかった。
30kDa PEGモノ−スルホン(実施例1における構造(2))を5時間、pH7.8、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(10mg/mL)において、PEGビス−スルホン(実施例1における構造(1))のインキュベーションにより調整した。pH7.8、50mMリン酸ナトリウム(10μL、0.39mg/mL)において、N末端の8個のヒスチジンベータシヌクレイン(アブカム(Abcam)、cat.no.ab40545、15kDa)の2つのアリコートを氷上で冷やし、その後30kDa PEGモノ−スルホンを(タンパク質濃度に対して)1モル当量加えた(1.6μL)。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、16時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにSDS−PAGEを用いて分析し、そしてインスタントブルー(ノベクサン(Novexin))で染色後得られたゲルを図11に示す。図11において、レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1は、アブカム(Abcam)より提供されたHis8−ベータシヌクレインのサンプル(0.8mg/m
L)から得られ、標識Bが付されたバンドはポリヒスチジンタグタンパク質である、しかし一方、標識Aが付されたバンドは不純物である。レーン2は1当量の30kDa PEG反応混合物から得られ、モノ−PEG化生成物に相当する標識Cが付されたバンド及び提供されたサンプルにおいて、未反応のHis8−ベータシヌクレイン及び不純物にそれ
ぞれ相当する標識A及びBが付された下側のバンドを示す。
その後、ゲルもまたPEGを可視化するためにヨウ化バリウムで染色し、結果として生じたゲルを図12に示す。図12において、レーンMは校正として用いられるノヴェック
ス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1は、アブカム(Abcam)より提供されたHis8−ベータシヌクレインから得られる。レーン
2は、1当量の30kDa PEG反応混合物から得られ、そして未反応のPEG試薬に相当する標識Cが付されたバンド、PEG不純物に相当する標識E及びGが付されたバンド、モノ−PEG化生成物及びジ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識D及びFが付されたバンド、提供されたサンプルにおいて、未反応のHis8−ベータシヌクレイン及
び不純物にそれぞれ相当する標識B及びAが付された下側のバンドを示す。
1H NMR(400 MHz、DMSO−d6)
δ 1.79,2.96,3.45(br m,ピペリジン部位のCH2),3.36(
t,2H,COCH2),3.74(t,2H,NCH2),8.09(m,4H,ArH)
p−カルボキシ−3−ピペリジノプロプリオフェノンヒドロクロライド 3(2)(1.0g)及び4−メチルベンゼンチオール(417mg、3(3))を無水エタノール(7.5mL)及びメタノール(5mL)の混合物中で懸濁した。その後、ピペリジン(50μL)を加え、この懸濁液をアルゴン雰囲気下6時間撹拌させながら加熱還流した。室温まで冷却後、得られた白色の沈殿物をガラスフィルター(G3)で濾過し、冷やしたアセトンで注意い深く洗浄し、固形物を真空下で乾燥し、3(3)(614mg)を得た。
1H NMR(400 MHz、DMSO−d6)
δ 2.27(s,3H,フェニル−CH3),3.24,3.39(t,2H×2,C
H2),7.14,7.26(d,2H×2,トリル基部位のArH),8.03(m,
4H,カルボン酸部位のArH)
4−(3―(p−トシルチオ)プロパノイル)安息香酸 3(4)(160mg)を水(10mL)及びエタノール(10mL)の混合物中で懸濁した。氷浴で冷却後、オキソン(720mg、アルドリッチ社製)を加え、一晩中(15時間)撹拌させながら、この反応混合物を室温まで温めた。得られた懸濁液がほぼ均一になり、その後混合物をクロロホルム(合計100mL)で3回抽出できるように、得られた懸濁液を追加の水で希釈した。溜まったクロロホルム抽出物を食塩水で洗浄し、その後硫酸マグネシウム(MgSO4)で乾燥させた。30℃での真空下、揮発性物質の蒸発により、白色の固形物を得た3
(4)(149mg)。
1H NMR(400 MHz、DMSO−d6)
δ 2.41(s,3H,フェニル−CH3),3.42(t,2H,CO−CH2),3.64(t,2H,SO2−CH2),7.46,7.82(d,2H×2,トリル基部位のArH),8.03(m,4H,カルボン酸部位のArH)
4−(3―トシルプロパノイル)安息香酸3(4)(133mg)及びo−2−アミノエチル)−o’−メチル−PEG(MW 10kDa、502mg、バイオ べクトラ社製(BioVectra))を乾燥したトルエン(5mL)に溶解させた。加熱しないで真空下で溶媒を除去し、乾燥した固形残渣をアルゴン下で乾燥したジクロロメタン(15mL)に再溶解させた。得られた溶液を氷浴で冷やし、アルゴン下でジイソプロピルカルボジイミド(DIPC、60mg)をゆっくりと加えた。その後、この反応混合物を一晩(15時間)室温で撹拌させた。それから、揮発性物質を真空下(30℃、水浴)で除去し、アセトン中(20mL)微温(35℃)で再溶解させた固形残渣を得た。不溶性物質を除去するため、溶液を非吸収性コットンウールで濾過した。その後、溶液をドライアイス浴で冷却し、遠心分離(4600rpm、30分間)により分離された白色の沈殿物を得た。液相をデカントし、この沈殿操作を3回繰り返した。その後、得られた純白でない固体を真空下で乾燥し、PEG試薬 3(437mg)を得た。
1H NMR(400 MHz、CDCl3)
δ 2.46(s,3H,フェニル−CH3),3.38(s,3H,PEG−OCH3),3.44−3.82(br m,PEG),7.38,7.83(d,2H×2,トリル基部位のArH),7.95(m,4H,カルボン酸部位のArH)
IFN α―2b(pH7.5、2mM EDTA及び150mM NaClを含有する10mM リン酸ナトリウム緩衝液において1.13mg/mL)の20μL溶液に1モル当量の10kDa PEG試薬3(脱イオン水中6mg/mL溶液の1.8μL)を加え、得られた溶液を室温で一晩、インキュベートした。1モル当量の20kDa PEG試薬でも繰り返し行い、再び前述した(脱イオン水中6.6mg/mL溶液の3.3μL)ような類似の方法により調製した。その後、両サンプルをSDS−PAGE(ニューページ ノーべックス 4−12% ビス−トリスゲル、MES ランニングバッファー(NuPAGE(登録商標) Novex 4−12% Bis−Trisgels、MES running buffer)、全てインビトロジェン(Invitrogen
)、及びインスタントブルーステイン(イクスペデオン(Expedeon) cat.No.ISB1L))により分析した。その結果を図13に示す。レーン1はタンパク質マーカーである。レーン2は出発IFNのみである。レーン3は10kDa PEG試薬反応の結果を示す。複合された1乃至5個のPEG鎖と共にIFNに相当する30と160kDa タンパク質マーカーとの間に5つのはっきりと区別できるバンドがある。レーン4は20kDa PEG試薬反応の結果を示す。複合された1乃至3つのPEG鎖と共にIFNに相当する60と110kDa タンパク質マーカーとの間に3つのはっきりと区別できるバンドがある。レーン5は染色していない20kDa PEG試薬であり、そのためバンドは可視的ではない。レーン6は染色していない10kDa PEG試薬であり、そのためバンドは可視的ではない。
PEGモノ−スルホンの1モル当量(0.18μL)又は3モル当量(0.52μL)のいずれかを加えた。その後反応は室温で6時間インキュベートした。得られた反応溶液をSDS−PAGEを用いて分析し、図14に示すようにインスタントブルー(エクスペデオン(expedeon))で染色した。レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1及び2はそれぞれ1当量の5kDa PEG反応混合物及び3当量のPEG反応混合物から得られる。標識Aが付されたバンドはHis8−ベータシヌクレインである。標識Aより下のか
すかなバンドはアブカム(Abcam)より提供されたタンパク質からの不純物である。B、C、D及びEを標識化したバンドは、モノ−PEG化、ジ−PEG化、トリ−PEG化、及びテトラ−PEG化タンパク質生成物にそれぞれ相当する。
kDa PEG化
10kDa PEGモノ−スルホン(実施例1における構造(2))を3時間、pH7.8、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(5mg/mL)において、PEGビス−スルホ
ン(実施例1における構造(1)、10mg/mL)のインキュベーションにより調整した。50mMリン酸ナトリウム、150mM塩酸ナトリウム及び2mM EDTAにおいて、C末端の6個のヒスチジンタグ抗TNFアルファドメイン抗体フラグメント(12.7kDa)溶液(0.6mg/mL)を4つの異なるpH(pH6.2、pH6.7、pH7.0及びpH7.4)で調製した。3モル当量の10kDa PEGモノ−スルホン(構造(2)、1.41μL)を4つの異なったpHそれぞれにおいてHis6−ドメイ
ン溶液に加えた(10μL、0.6mg/mL)。その後、反応を室温で3時間インキュベーションした。
得られた反応溶液をSDS−PAGEを用いて分析し、図15に示すようにインスタントブルー(エクスペデオン(expedeon))で染色した。レーンMはノヴェックス
シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1乃至4はそれぞれpH6.2、pH6.7、pH7.0及びpH7.4において、3当量の10kDa PEGを用いて反応混合物から得られる。標識Aが付されたバンドは未反応のHis6−抗TNFアルファドメイン抗体フラグメントである。標識Bが付されたバンドは、モ
ノ−PEG化ドメイン生成物である。標識C及びDが付されたバンドは、ジ−PEG化及びトリ−PEG化ドメインフラグメントにそれぞれ相当する。PEG化は4つのpHごとに見られ、pHが増加するにつれてPEG化の大きさも増加する。
NF−α ドメイン抗体フラグメントのPEG化
10kDa、20kDa、30kDa及び40kDa PEGビス−スルホン(実施例1における構造(1))を室温において3時間、pH7.8、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(5mg/mL)で、別々にインキュベーションし、対応するPEGモノ−スルホン(実施例1における構造(2))を得た。PEGの濃度は10kDa、20kDa、30kDa及び40kDa PEGそれぞれに対して、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL及び40mg/mLである。50mMリン酸ナトリウム、150mM塩酸ナトリウム及び2mM EDTAにおいて、C末端の6個のヒスチジンタグ抗TNFドメイン抗体(12.7kDa)溶液(1.25mg/mL、5μL)の4つのアリコートに、その後10kDa、20kDa、30kDa及び40kDa PEGモノ−スルホン(0.74μL、1.5モル当量)を加えた。それから、反応を4℃で8時間インキュベーションした。その後、反応溶液を図16に示すようにSDS−PAGEにより分析した。レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharpprotein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1は参照用にHis6−抗TNFドメイン抗体フラグメン
トである。レーン2乃至5は10kDa、20kDa、30kDa及び40kDa PEGの反応からそれぞれ得られる。標識Aが付されたバンドは未反応のHis6−抗TNF
ドメインである。標識B(B10、B20、B30及びB40)が付されたバンドは、10、20、30及び40kDa PEGに対するモノ−PEG化ドメインフラグメントにそれぞれ相当する。標識C10が付されたバンドは10kDa PEG反応に対するジ−PEG化生成物に相当し、C20バンドは20kDa PEG反応に対するジ−PEG化生成物に相当する。
さないエンドスタチンとの比較反応
2kDa PEGモノ−スルホン(実施例1における構造(2))を4時間、pH7.8、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(1mg/mL)において、PEGビス−スルホン(実施例1における構造(1))のインキュベーションにより調整した。pH6.2、5
0mMリン酸ナトリウム(30μL、0.5mg/mL)において、C末端の6個のヒスチジンタグエンドスタチン(カルバイオケム(Calbiochem)cat.no.324743)の2つのアリコートを氷上で冷やし、その後2kDa PEGモノ−スルホンを(タンパク質濃度に対して)1モル当量又は3モル当量のいずれかを加えた(各々1.4μL又は4.2μL)。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、16時間放置した。
pH6.2、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(10μL、0.2mg/mL)において、非タグエンドスタチン(カルバイオケム(Calbiochem)cat.no.324769)の2つのアリコートもまた氷上で冷やし、その後2kDa PEGモノ−スルホン(0.1mg/mL)を(タンパク質濃度に対して)1モル当量又は3モル当量のいずれかを加えた(各々2.0μL又は6.0μL)。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、16時間放置した。
得られた反応混合物を構成物質のサイズ依存分離のためにSDS−PAGEを用いて分析し、そしてインスタントブルー(エクスペデオン(Expedeon))で染色後得られたゲルを図17に示す。図17では、標識Mが付されたスポットの左側のカラムはノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein
markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1はHis6−エンドスタチン反応と共に1当量の2kDa PEGのサンプルから得られ、
未反応のタンパク質及びモノ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識B及びCが付されたバンドを示す。レーン2はHis6−エンドスタチン反応と共に3当量の2kDa P
EGのサンプルから得られ、未反応のタンパク質及びモノ−PEG化生成物にそれぞれ相当する標識B及びCが付されたバンドを示す。レーン3及び4はそれぞれ、エンドスタチン反応と共に1当量の2kDa PEG及びエンドスタチン反応と共に3当量の2kDa
PEGから得られる。未反応のタンパク質に相当する標識A及びBがそれぞれ付された1個のバンドにのみ、2kDa PEGだけがHis6−エンドスタチンと反応すること
を示す両反応に存在する。
PEG化及び非ヒスチジンタグインターフェロン アルファとの比較反応
N末端の8個のヒスチジンタグインターフェロン α−2bの溶液(2.63mL/、1.14mg/mL)を150mM塩酸ナトリウム(PBS)を含有する、pH7.4、50mMリン酸ナトリウム緩衝液で調製し、その後(タンパク質濃度に対して)1.7モル当量の20kDa PEGビス−スルホン(実施例1における構造(1))を加えた(脱イオン水において11.5mg/mL 20kDa PEGビス−スルホン溶液の420μL)。その後、この反応混合物を冷蔵庫に入れ、18時間放置した。得られた反応混合物をSDS−PAGEにより分析し、その結果を図18に示す。図18において、レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1は、標識Aが付されたバンドが未反応のIFNに、標識Bが付されたバンドがモノ−PEG化IFNに、標識Cが付されたバンドがジ−PEG化IFNに及び標識Dが付されたバンドがトリ−PEG化IFNに相当する反応溶液を示す。
0.5mg/mLにおける1当量の30kDa PEGとの二次反応及びN末端の8個のヒスチジン溶液は、pH7.5においてインターフェロン α−2b(3.2mL、0.793mg/mL)をタグ付けした。その結果は、60と80kDa タンパク質マーカー間の可視的なモノ−PEG化IFNバンドとの20kDa反応、ジ−PEG化IFNに相当する110と160kDa間のバンド及びトリ−PEG化IFNに相当する160と260kDa タンパク質マーカー間の第三のバンドと似ている。非ヒスチジンタグIFN α−2bとの対比は、図18のレーン2に示される結果と共に、18時間後及び同じ条件下、1当量のPEG試薬(1)との反応を示さなかった。
<末端アミノ基を有するPVPの調製>
圧力管にシステアミン(0.042g)、ジオキサン(8mL)及びマグネチックスターバーを充填した。溶液を形成するために穏やかな加熱後、溶液を室温で5分間アルゴンでパージした。パージしながら、1−ビニル−2−ピロリドン(2.0g)をその後加え、さらに5分後、2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)(0.089g)を加えた。さらに2分後、アルゴン下で圧力管をねじぶたで封し、撹拌しながら23時間オイルバスの中に置いた。チューブと内容物を室温まで冷ました後、ポリマー生成物の沈殿物を得るため、ジエチルエーテル(15mL)を加えた。液相をデカントし固体残渣をアセトン(3mL)に再溶解した。その後、得られたアセトン溶液を迅速に撹拌されているジエチルエーテル(25mL)に一滴ずつ加え、沈殿物を真空のほんの僅かなバーストと共にno.2 焼結ガラス漏斗で単離した。固形物を未乾燥のジエチルエーテル(10mL)で洗浄し、その後室温で真空下乾燥させた(質量=1.24g、白色の固体)。
<PVP−アミンへのタンパク質反応末端基の複合>
PVP−アミン(500mg)、4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]アセチル]−安息香酸(125mg)、及び4−ジメチルアミノピリジン(6mg)をアルゴン下、無水ジクロロメタン(10ml)で混合し、その後撹拌しながら、1,3−ジイソプロピルカルボジイミド(80μL)を加えた。得られた混合物を室温で20時間撹拌し、その後非吸収性コットン−ウールを通して濾過した。それから濾液にジエチルエーテル(20mL)を加え、得られた沈殿物を遠心分離(2,000rpm、2分間、2℃)により単離した。液相をデカントし、残りの残渣を数分間、酢酸エチル(5mL)でボルテックス(vortex)した。酢酸エチル層をデカント後、固形残渣をジクロロメタン(5mL)に再溶解し、その後酢酸エチル(15mL)を加えた。溶液を15分間ドライアイス内に置き、その後遠心分離(2,000rpm、2分間、2℃)により単離された固形物の沈殿物を得た。得られた粘着性の残渣を未乾燥の酢酸エチル(5mL)でボルテックスし、その後室温で真空下乾燥した(質量=0.118g)。
<PVP ビス−スルホンの分別>
上述の段階で得られた固形物をpH 4.0、水性の20mM酢酸ナトリウム緩衝液、150mM NaClで混合し、その後澄明な液が可視的になるまで13,000rpmで遠心分離機にかけた。液相を固形残渣から除去し、その後溶出ピークの間1分ごとに留分を集めることにより1mL/minにおいて20mM酢酸ナトリウム緩衝液、150mM、pH4.0を稼動させながら、HiLoad 16/60 Superdex(登録商標) 200 prep grade size exclusion column(GEヘルスケア(GE Healthcare))で分別した。72〜80分の間で溶出した留分はタンパク質複合に使用される。
<N末端の8個のヒスチジンタグIFN アルファへのPVP複合化>
IFN(0.025mg、0.5mg/mL)を150mM塩酸ナトリウム(PBS)を含有するpH7.5、50mMリン酸ナトリウム緩衝液で調製した。IFN(25μg、0.5mg/mL)の50μLに分別PVP ビス−スルホン(留分72分、74分、78分及び80分)を50μL加えた。得られた溶液を静かに混合し、4℃で一晩放置した。結果として得られた反応溶液をSDS−PAGEにより分析し、その結果を図19に示す。図19において、レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン2乃至5は使用された異なった
サイズのPVP試薬留分からの反応溶液を示す(2〜5それぞれからの72〜80分のPVP留分)。標識Bが付されたバンドは得られたモノ−及び多量PVP化IFNを示す。
150mM塩酸ナトリウム(PBS)を含有するpH7.5、50mMリン酸ナトリウム緩衝液で調製したN末端の8つのヒスチジンタグインターフェロン α−2b(1mL、1.14mg/mL)の溶液にヒト血清アルブミン(IFNに対して3モル当量、10.77mg)を加え、溶解させた。この溶液に10kDa PEGビス(ビス−スルホン)(実施例12における構造(6))(IFNに対して1モル当量、水において8mg/mL 10kDa PEGビス(ビス−スルホン)(6)溶液の75μL)を加えた。この反応混合物を室温で18時間放置した。得られた反応混合物をイオン交換クロマトグラフィー、続いて金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その後SDS−PAGEにより分析し、その結果を図20に示す。図20において、レーンMは校正として用いられるノヴェックス シャープ タンパク質 マーカー(Novex Sharp protein markers)(インビトロジェン(Invitrogen))を示す。レーン1は、標識Aが付されたバンドは未反応のIFNであり、標識Bが付されたバンドはモノ−PEG化IFNであり、標識Cが付されたバンドはIFN−PEG−IFNであり、そして標識Dが付されたバンドはIFN−PEG−アルブミンである精製された反応溶液を示す。
Claims (15)
- 一般式
X及びX’の1つはポリアルキレングリコール及びポリビニルピロリドンから選ばれる水溶性合成ポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Qは独立して直接結合、炭素原子数1乃至10のアルキレン基、又は随意に置換されたアリール基又はヘテロアリール基[それらのいずれかは1個以上の酸素原子、硫黄原子、−NR基(式中、Rは水素原子又はアルキル基又はアリール基、ケト基、−O−CO−基及び/又は−CO−O−基を表す。)により終端又は中断されていてもよい]から選ばれる連結基を表し、
WはCO基又は
Zはポリヒスチンタグを介してA及びBに連結されたタンパク質又はペプチドを表し、
Aは炭素原子数1乃至5のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Bは直接結合又は炭素原子数1乃至4のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。)
で表される化合物の調製方法であり、
該方法は
(i)一般式
W’はCO基を表し、そして
各Lは独立して−SR、−SO2R、−OSO2R、−N+R3、−N+HR2、−N+H2R、ハロゲン原子、又は−OΦ{式中、Rは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表し、そしてΦは少なくとも1つの置換基を含有する置換アリール基を表し、該少なくとも1つの置換基は−CN、−NO2、−CO2R、−COH、−CH2OH、−COR、−OR
、−OCOR、−OCO2R、−SR、−SOR、−SO2R、―NHCOR、−NRCOR、−NHCO2R、−NR’CO2R、−NO、−NHOH、−NR’OH、−C=N−NHCOR、−C=N−NR’COR、−N+R3、−N+HR2、−N + H 2 R、ハロゲン原子、特に塩素原子又は特にフッ素原子、−C≡CR、−C=CR2及び−C=CHR(式
中、R及びR’のそれぞれは水素原子又はアルキル基又はアリール基を表す。)から選ばれる}から選ばれる脱離基を表す。]
で表される化合物
又は
(ii)一般式
X、X’、Q、W’、A及びLは一般式IIと同義であり、そして
mは整数1乃至4を表す。)
で表される化合物
のいずれかを、ポリヒスチジンタグを含有するタンパク質又はペプチドと、複合が前記ポリヒスチジンタグを介して起こるような条件下で、反応させることを含む、方法。 - 一般式(II)又は(III)で表される化合物とタンパク質又はペプチドとの反応後、CO基を還元して
- 前記ポリヒスチジンタグは2乃至12個のヒスチジン残基を含有する、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記ポリヒスチジンタグは4乃至10個のヒスチジン残基を含有する、請求項3に記載の方法。
- 前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマーがC2及び/又はC3単位を含有する、ポリアルキレングリコールである、請求項5に記載の方法。
- 前記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項6に記載の方法。
- 前記タンパク質又はペプチドがポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、血液因子、ペプチド・ホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質である、請求項1乃至請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質又はペプチドが抗体又は抗体フラグメントである、請求項8に記載の方法。
- 前記タンパク質又はペプチドは、その表面上の感応性基を保護するべく、1つ以上の保護基と反応された天然タンパク質であるか、又は1個以上のポリマー、治療又は診断に用いる小分子、シアル酸、糖類、及び/又は澱粉と付加的に複合するタンパク質である、請求項1乃至請求項9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Qがアルキレン基又は直接結合である、請求項1乃至請求項10のいずれか1項に記載の方法。
- 一般式
X及びX’の1つはポリマーを表し、そして他方は水素原子を表し、
各Qは独立して連結基を表し、
Wは電子求引性部位又は電子求引性部位の還元により調製される部位を表し、
もしくは、X’がポリマーを表す場合は、X−Q−W−は一緒に電子求引性基を表してもよく、そして更に、
もしくは、Xがポリマーを表す場合は、中間にある原子と一緒にX’及び電子求引性基Wは環を形成してもよく、
Zはポリヒスチジンタグを介してA及びBに連結されたタンパク質又はペプチドを表し、
Aは炭素原子数1乃至5のアルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして
Bは結合又は炭素原子数1乃至4のアルキレン又はアルケニレン鎖を表す。)
で表される化合物である、前記請求項のうちのいずれか一項に記載の化合物。 - 6.8乃至8.5の範囲のpHで行われる、請求項1乃至請求項12のいずれか1項に記載の方法。
- 7.0乃至8.0の範囲のpHで行われる、請求項13に記載の方法。
- 7.5乃至8.0の範囲のpHで行われる、請求項14に記載の方法。
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