DE69825896T2

DE69825896T2 - Verfahren zur kovalenten immobilisierung von biomolekülen an einem träger mittels eines his-tags

Info

Publication number: DE69825896T2
Application number: DE69825896T
Authority: DE
Inventors: Alfons Bosman; Frans Van Wijnendaele; Dirk Van Den Broeck; Andre Van De Voorde
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2018-06-26
Also published as: EP0991944A1; ATE274698T1; ES2227868T3; AU8729098A; WO1999000670A1; CA2293777A1; AU746325B2; WO1999000670A8; EP0991944B1; DE69825896D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Biomolekülen an Trägern und Membranen mittels kovalenter Bindung mit fusionierten Histidin-Tags. Die Erfindung betrifft ebenso Wege zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer kovalenten Bindung zwischen Träger oder Membran und den Histidinresten, die das His-Tag bilden, indem die entsprechenden reaktiven Gruppen und/oder physikochemischen Parameter gewählt werden. Die vorliegende Erfindung zielt ebenso darauf ab, gleichzeitig ein universelles Nachweisverfahren mit erhöhter Empfindlichkeit nach Quervernetzung bereitzustellen.
Rekombinante Proteine werden häufig als Fusionsproteine exprimiert, um ihr Expressionsniveau zu erhöhen und/oder ihre Reinigung zu erleichtern. Der Fusionsteil kann eine chemische Spaltungsstelle (z.B. Hydroxylamin, CNBr) oder eine enzymatische Spaltstelle (z.B. Enterokinase, Thrombin) enthalten, die die nachfolgende Reinigung des reifen Proteins gestattet.
Die verfolgten Strategien zur Reinigung solcher Fusionsproteine können auf einer verstärkten Bindung an Ionenaustauschchromatographieharze durch Einführen eines polykationischen (poly Lys, poly Arg) oder eines polyanionischen (poly Asp, poly Glu) Schwanzes beruhen. Die meisten Fusionsproteine wurden entwickelt, um einen Affinitätschromatographieschritt einzuführen, da dieser spezifischer ist und eine höhere Anreicherung während der Chromatographie gestattet. Zu diesen Fusionspartnern auf Affinitätsbasis gehören beispielsweise: prot A für die Reinigung an immobilisierten IgG (Löwenadler et al, EMBO J, 5, 2393, 1986), GST-Fusion zur Reinigung an immobilisiertem GSH (Smith & Johnson, Gene, 67, 31, 1988) oder Maltose- Bindungsprotein zur Reinigung an immobilisierter Maltose (Chu Di Guan, Gene, 67, 21, 1988). Eine weitere Verfeinerung des letzteren Ansatzes bestand in der Einführung kleiner Affinitäts-Tags: z.B. Streptag zur Bindung an Aminobiotin (Schmidt & Skerra, Prot. Engeneering, 6, 109, 1993), der Z-Domäne von Protein A (Murby et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 14, 336, 1991) der Mannose-Bindungsdomäne („Taylor & Drickamer, Biochem.J, 274, 575, 1991) oder dem (His)₆-Tag. Histidin-Tags sind zur Zeit in der Biotechnologie äußerst populär. Sie gestatten eine leichte Reinigung auf einer immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC). Das „IMAC"-Reinigungskonzept wurde von Porath (Nature, 258, 598-299, 1975) eingeführt. Er stellte fest, daß einige Aminosäuren, wie etwa Histidin, Tyrosin und Cystein, auf nichtkovalenter (Elektronendonor-Akzeptor-) Basis mit Metallionen wechselwirken können, wobei er diese Erkenntnis auf die Proteinreinigung anwandte, indem er die Metallionen über einen harzgebundenen Chelator, wie etwa Iminodiessigsäure (IDA) immobilisierte. IMAC besitzt den Vorteil, daß die Bindung zwischen dem Metallion und dem Protein leicht durch ein kompetitives Agens, wie etwa Imidazol, oder durch Erniedrigung des pH-Werts leicht gelöst werden kann und daß das Harz sich durch einen EDTA-Waschschritt regenerieren läßt. Die Protein-Metallion-Wechselwirkung wird durch das Vorhandensein nichtionischer Detergenzien oder hoher Salzkonzentrationen nicht beeinflußt.
Die Stärke und Spezifität der Protein-Metallionen-Wechselwirkung hängt von der topographischen Verteilung der Histidinreste ab (Hemdan et al., PNAS, 86, 1811-1815, 1989).
Die Anwendungen von IMAC in der Biotechnologie wurden durch die Einführung der (His)₆-Tags in rekombinanten Fusionsproteinen sowie die Verwendung von Nitrilotriessigsäure (NTA) als harzimmobilisierten Chelator enorm erhöht (Hochuli et al., Bio/Technology, 6, 1321-1325, 1988). IMAC läßt sich unter nichtdenaturierenden ebenso wie unter denaturierenden (6M Harnstoff, 6M Gu.HCl) Bedingungen anwenden, wobei ein über 95% reines rekombinantes Protein in einem einzigen Chromatographieschritt erhalten werden kann. Weiterhin wird die Verwendung eines (His)₆-Tags durch die Tatsache begünstigt, daß das Tag in den meisten Fällen die biologische Aktivität oder die immunologische Reaktivität nicht stört und daß die (His)₆-Sequenz für E.coli weniger toxisch ist als die anderen getesteten Tag-Sequenzen (Viaplana & Villaverde, 12, 723-727, 1996). Die Produktion von Antikörpern gegen das (His)₆-Tag ist ziemlich schwierig, was darauf hindeutet, daß diese Sequenz nur eine geringe Immunogenität aufweist. Weitere Metall-Bindungssequenzen wurden veröffentlicht (Ljungquist et al., 186, 563-569, 1989; Smith et al, J Biol. Chem., 263, 7211-7215, 1988), doch erreichten diese Sequenzen nicht die Popularität des (His)₆-Tags.
Das IMAC-Reinigungskonzept wurde auf Polystyrolplatten für ELISA-Anwendungen übertragen (Paborsky et al, Anal. Biochem., 234, 60-65, 1996), und biotinyliertes NTA wurde für den Nachweis von (His)₆-Tag-Fusionsproteinen auf einem Western-Blot verwendet (O'Shannessy et al, Anal. Biochem.J. 229, 119-124, 1995). Das IMAC-Konzept wurde ebenso erfolgreich für eine reversible Immobilisierung an IDA-Harzen für Glykoproteine nach Kaliumperiodatoxidation und Histidinkopplung angewandt (Chaga, Biotechnol. Appl. Biochem, 20, 43-53, 1994). Die dreiseitige Chelator-Metallionen-(His)-Tag-Wechselwirkung wurde ebenso zur Insertion von Fusionsproteinen in Liposomen (Dietrich et al, Biochemistry, 35, 1100-1105, 1996) und zur Immobilisierung von Nukleinsäuren an Trägern (Komissarov et al, Anal. Biochem, 247, 2106-2113, 1997) verwendet. Rekombinante Proteine wurden mit ihren Histidin-Tags an Metallchelatoren reversibel (nicht kovalent) immobilisiert, die dann ihrerseits kovalent an Mikrotiterplatten (Paborsky et al, Anal. Biochem, 234, 60-65, 1996), synthetische Lipide (Dietrich et al, Biochemistry, 35, 1100-05, 1996) oder an die Biacore-Biosensormembran (Gershon & Khilko,J Immunol Methods, 183, 65-76, 1995) gebunden wurden. Glykoproteine wurden an Metallaffinitätsharz nach Oxidation und Histidinkopplung komplexiert, das Harz konnte nach Regenerierung mit EDTA leicht wiederverwendet werden (Chaga, Biotechnol Appl Biochem, 20, 43-53, 1994).
Während an rekombinante Proteine fusionierte (His)-Tags äußerst wirkungsvoll bei Reinigungsprotokollen sind, stellen sie einen wichtigen Nachteil dar, wenn sie zur Immobilisierung von Biomolekülen an Träger oder Membranen verwendet werden. Die IDA-(oder NTA-)-His-Tag-Wechselwirkung ist nicht kovalent und somit, per Definition, reversibel und hängt von den Gleichgewichtsregeln ab. Dies führt zu negativen Effekten, wie etwa „Off-Binding", verlust von Material und Instabilität des Produkts, Produktwanderung („Band Shuffling"), wobei dies wiederum zu einer geringeren Empfindlichkeit oder zu falschen Schlußfolgerungen führt. Aus diesem Grund scheint die kovalente Bindung von Biomolekülen an Membranen oder Träger häufig ein besserer Ansatz zu sein. Biomoleküle lassen sich an Membranen oder Träger über eine Umsetzung mit reaktiven Gruppen, die häufig ein breites Spektrum aufweisen, binden, was zu einer mehr oder weniger stochastischen Immobilisierung der Biomoleküle und damit häufig zu einem hohen Verlust an Bioaktivität führt. Dies wurde in der Vergangenheit dadurch verhindert, daß die Biomoleküle mit einem Schwanz bestehend aus chemischen Gruppen mit einer höheren Reaktivität, der gleichzeitig als Abstandhalter fungiert, versehen wurden. Die Häufigkeit der Inaktivierung nach Immobilisierung der Biomoleküle wird dadurch drastisch herabgesetzt. Bei rekombinanten Proteinen lassen sich diese Schwänze leicht durch translationale Fusionen mit einem Abschnitt aus hochreaktiven Aminosäureresten binden. Poly-Lys, Poly-Arg, Poly-Glu, Poly-Asp und Poly-Cys wurden dabei in der Vergangenheit berücksichtigt und angewandt, wobei Poly-Lys am erfolgreichsten war. Obwohl Histidinreste ebenso ziemlich reaktiv sind, wurden Poly-His-Schwänze nie als Lösung für das obige Problem angesehen. Histidinreste sind zusammen mit α- und ϵ-Aminogruppen, Cystein, Tyrosin, Argenin, Methionin und sauren Resten die reaktivsten Reste. Histidinreste (pK~6,5) reagieren leicht mit den meisten Azylierungs-, Alkylierungs- und vielen elektrophilen Reagensien. Die Photooxidation wurde ebenso für die kovalente Immobilisierung von Proteinen über deren Histidinreste an ein Hydroxypropylmethacrylamidpolimer (Shen et al., J. Photochem Photobiol, 34, 203-210, 1996) oder zur Erzeugung von Proteinquervernetzung verwendet (Verwej et al., Biochem Biophys Acta, 647, 87-94, 1981). Die kovalente Immobilisierung von Protein-Einzelschichten über eine Linker-Anbindung an eine Siliziumnitridoberfläche oder ein Protein wurde von Williams& Blanch (Biosens Bioelectron, 9, 159-167, 1994) untersucht. Zwar ist die Häufigkeit von Histidinresten in Proteinen eher gering, doch spielen sie häufig eine wichtige Rolle für die biologische Aktivität des Proteins, wobei die Imidazolgruppen ziemlich reaktiv sind. Dies könnte zum Teil erklären, daß ein Interesse an der Berücksichtigung von Poly-His-Schwänzen als Mittel zur kovalenten Immobilisierung fehlt.
Andererseits sind Histidinreste mittels spezifischer chemischer Modifikationen gut untersucht, da sie häufig für die biologische Aktivität von Proteinen wichtig sind. Dabei ist chemische Modifikation als ein Prozeß definiert, der zu einer kovalenten Derivatisierung von Aminosäureresten, vorzugsweise in einer selektiven und spezifischen Weise und ohne die Konformation des Proteins zu ändern, führt. Auf diese Weise läßt sich ermitteln, ob Histidinreste eine wichtige Rolle beim enzymatischen Prozeß bestimmter Enzyme spielen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Wahrscheinlichkeit des Flusses von Bioaktivität eines Biomoleküls nach Immobilisierung zu verringern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Biomolekülen an Träger oder Membranen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer Funktionalitäten für His-Tags, die zur Zeit bei Reinigungsprotokollen eingesetzt werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Stabilität eines Produkts, das aus der Immobilisierung eines Biomoleküls resultiert, zu erhöhen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren, die die Bindung und/oder die kovalente Immobilisierung von Biomolekülen mittels Aminosäureresten, die ein His-Tag bilden, erhöhen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der gleichzeitigen Bereitstellung eines universellen Nachweisverfahrens für Biomoleküle, die ein His-Tag enthalten.
Das obige technische Problem wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen und unten dargelegten Ausführungsformen gelöst. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem das Vorhandensein von His-Tags für die kovalente Immobilisierung eines das His-Tag enthaltenden Biomoleküls ausgenutzt wird, wobei die das His-Tag umfassenden Aminosäurereste direkt an der kovalenten Bindung beteiligt sind. Dieses His-Tag, das Teil des Moleküls ist, erhöht in signifikanter Weise die Wahrscheinlichkeit der Immobilisierung des Biomoleküls in einer gerichteten Weise, ohne daß dabei die Konformation und Funktionalität des Biomoleküls gestört werden. Die Wahrscheinlichkeit einer spezifischen Verknüpfung des Biomoleküls durch direkte Reaktion der Histidinreste, die in dem His-Tag enthalten sind (und somit nicht durch die Histidinreste des Proteins selbst) wird bereits durch die Tatsache erhöht, daß (1) Histidinreste in Proteinen selten vorkommen und unter nativen Bedingungen normalerweise verdeckt sind und (2) die Histidine im Fusionsschwanz leicht erreichbar sind, da die rekombinanten Proteine sehr häufig unter nicht denaturierenden Bedingungen an IMAC gereinigt werden. Die polaren Aminosäuren (z.B. Lys, Arg, Gly, Asp) sind in ihrer Mehrheit an der Oberfläche des Proteins lokalisiert, während die hydrophoben (nicht polaren) Aminosäuren gegen die wäßrige Umgebung abgeschirmt sind. Somit bildet sich ein Polaritätsgradient von der Außenseite zum Zentrum eines Proteins aus, wobei sich dieser Gradient auch in „taschenähnlichen" Strukturen an der Proteinoberfläche findet. Neben ihrer Nukleophilität sind die Zugänglichkeit der Reste zusammen mit ihrer Mikroumgebung (Lösungsmittel, Reste in der Nachbarschaft) wichtige Aspekte für die Reaktivität mit modifizierenden Agenzien.
Vorzugsweise ist das His-Tag bereits im Expressionsprodukt (Fusionsprotein) vorhanden, wobei es aminoterminal oder carboxyterminal oder sogar innerhalb des rekombinanten Proteins lokalisiert sein kann. Die His-Tags können jedoch auch durch chemische Modifikation eingeführt werden, wodurch das His-Tag an jeder möglichen Stelle des Biomoleküls verankert wird. Vorzugsweise sind die His-Tags auf der Außenseite des Proteins an Stellen lokalisiert, die die Konformation des Proteins nach der Immobilisierung nicht stören und die die Bioaktivität, wenn auf enzymatische Reaktionen abgezielt wird, und/oder die Immunreaktion, wenn auf Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen abgezielt wird, bewahren. Gleichzeitig funktioniert das His-Tag zur gleichen Zeit als Abstandhalter, um die Präsentation zu verbessern, so daß eine Wechselwirkung mit dem Stütz- oder Trägermolekül minimiert wird.
Es sollte sich verstehen, daß, wann immer der Begriff „His-Tag" in der Beschreibung verwendet wird, diesem eine breite Definition gegeben werden kann, worunter alle Sequenzen verstanden werden, die eine Menge an Histidinresten aufweisen, die ausreichend hoch ist, um eine entsprechende Anwendung zu gestatten. Im Prinzip sollte eine 10-Aminosäuren lange Sequenz, die zwei Histidinreste aufweist und wenigstens zweimal wiederholt wird, ausreichen. Insbesondere enthält das „His-Tag" typischerweise wenigstens drei Histidine innerhalb eines Abschnitts aus sechs Aminosäuren. Der Begriff „His-Tag" kann ebenso die histidinreiche Domäne des WHP-Proteins aus E.coli (Wülfing et al., J.Biol. chem., 269, 2895, 1994) oder jede andere Wiederholung eines Histidins, dem unmittelbar wenigstens ein Rest folgt, umfassen. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff His-Tag auf wenigstens drei aufeinanderfolgende Histidinreste, besonders bevorzugt auf wenigstens vier Histidinreste oder noch bevorzugter auf wenigstens fünf oder wenigstens sechs aufeinanderfolgende Histidinreste.
Der Begriff „Biomolekül", wie er in der gesamten Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein beliebiges Molekül biologischen Ursprungs, RNA Proteine, Peptide, einschließlich DNA, Aminosäuren, Stoffwechselverbindungen, Zucker, Lipide, u.ä., sowie Kombinationen davon, die sich für diagnostische und therapeutische Zwecke verwenden lassen. Der Begriff „Biomolekül" bezieht sich somit auf solche Moleküle, die durch Reinigung aus lebenden Systemen erhalten wurden. Der Begriff „Biomolekül" bezieht sich ebenso auf Moleküle, die chemisch synthetisiert wurden, oder die durch rekombinante Mittel, oder Kombinationen davon, erhalten wurden, wodurch sie Moleküle imitieren, wie sie in lebenden Systemen erhalten werden, ohne daß dabei ihre biologische Aktivität oder Funktion stark verändert wird, wodurch sie Peptidnukleinsäuren (PNAs), Arzneistoffe, die bestimmte Substrate oder Hormone imitieren können oder die Epitope imitieren können, wodurch sie Enzyme, Rezeptoren bzw. Antikörper stören und/oder daran binden, umfassen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ebenso ein Verfahren, bei dem die kovalente Immobilisierung oder kovalente Quervernetzung durch Ausnutzen des Vorhandenseins eines His-Tags erzielt wird, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem Träger oder der Membran und der aminoterminalen freien Amingruppe oder der carboxyterminalen freien Carboxygruppe des His-Tags gebildet wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Protein oder Peptid oder jedes andere Biomolekül, das ein His-Tag enthält, mittels des His-Tags immobilisiert werden, indem eine beliebige Art von Reagens verwendet wird, das mit Histidinresten reagieren kann, ohne dabei eine besondere Selektivität für Histidin aufzuweisen. Reagensien für die Histidinrestmodifikation lassen sich in zwei Gruppen einteilen: Nichtspezifische Reagensien oder angemessene histidinspezifische Reagensien. Obwohl die Liste alles andere als vollständig sein dürfte, lassen sich die folgenden Reagensien als nicht-histidinspezifische Reagensien angeben: alpha-Halogensäuren und -amide, bis-Alkylhalogenide wie etwa 1,3-Dibromaceton, N-Bromsuccinimid, Woodward-K-Reagens, Diazoniumsalze, Styrol und Styroloxid, Aldehyd, Iod, Sulfonylhalogenide, Dansylchlorid, Cyanierung, 1-Fluor- 2,4-Dinitrobenzol, N-Ethylmaleimid. Es sollte sich verstehen, daß andere Reagensien, die nicht in dieser Liste aufgeführt sind, dem Fachmann bekannt und hiermit umfaßt sind. Diese Ausführungsform betrifft die Ausnutzung des Vorhandenseins von His-Tags in allen Arten von Biomolekülen, um die Wahrscheinlichkeit einer Reaktion mit Aminosäureresten, die das His-Tag umfassen, zu erhöhen, indem die Anzahl der Histidinreste erhöht und/oder die Präsentation des His-Tags gegenüber den reaktiven Gruppen verbessert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Manipulation eines oder mehrerer physikochemischer Parameter der Reaktionsbedingungen, wodurch die Selektivität der Reaktion gegenüber den Histidinresten, die das His-Tag bilden, erhöht wird. Das Reaktionsmuster der oben aufgeführten Reagensien mit Protein kann von den Reaktionsbedingungen (z.B. pH-Wert, Temperatur, Lösungsmittel und/oder verwendeter Puffer, Beleuchtungsgrad, Überschuß an Reagens, und weitere physikochemische Parameter) deutlich beeinflußt werden: d.h. die Spezifität dieser Reagensien läßt sich gegenüber einer reaktiven Gruppe in signifikanter Weise erhöhen, indem die Bedingungen angepaßt werden. Als Beispiel für nichtspezifische Histidinreagensien seien nukleophile Substitutionsreaktionen von Alkylhalogeniden genannt. Die Reaktion findet über einen „bimolekularen Mechanismus" statt: Eine alpha-Carbonylgruppe, wie etwa die von Halogenacetaten, verbessert die Reaktivität durch direkte Verdrängung. Die Reaktivität der Halogenacetate hängt von dem Halogenid (d.h. l>Br>Cl≫F) ab, so daß Iod- und Bromacetate die geeigneteren Agenzien für die Proteinmodifikation sind. Die relative Reaktivität von alpha-Halogenacetaten gegenüber Proteinfunktionalitäten ist Sulfohydryl > Imidazolyl > Thioether > Amin, doch kann der pH-Wert hier als ein Reaktionsmoderator verwendet werden, da die Nukleophilität der Seitenketten sich stark unterscheidet (pK_a-Wert von -SH 8,8-9,0; pK_a-Wert Imidazolyl-Stickstoff ~ 6,0-6,5; pK_a-Wert epsilon-Amin des Lysins ~9,5 und pK_a-Wert alpha-Aminogruppe ~ 7,5-8,0). Iodacetat reagiert somit optimal mit Sulfhydrylgruppen bei ~ pH 8. Bei pH ~ 6, bei dem Imidazolgruppen wenigstens teilweise nicht protoniert sind, ist die Modifikation der Histidylseitenketten hinreichend schnell, so daß sie die Hauptreaktion in denjenigen Proteinen darstellt, die keine zugänglichen Sulfhydrylgruppen aufweisen. Die Reaktion mit Imidazolgruppen kann in zwei Schritten zu einem stabilen 1,3-Dicarboxylmethylderivat ablaufen. Die alpha-Halogenacetamidderivate weisen den gleichen Trend hinsichtlich der relativen Reaktivitäten auf und werden typischerweise als Blockierungsmittel verwendet, da ihnen die funktionelle Carboxylatgruppe fehlt. Diazoniumgruppen enthalten reaktive Wasserstoffatome, die in der Lage sind, an Konjugationsreaktionen teilzunehmen, wobei sie von einer angreifenden elektrophilen Gruppe, die in der Lage ist, eine neue stabile kovalente Bindung zu bilden, leicht verdrängt werden. Die Histidinseitenketten und die Tyrosine sind die Ziele für das Diazoniumsalz. Der pH-Wert kann hier wiederum als Reaktionsspezifizierungsmittel fungieren: Bei pH 8 reagieren die Diazoniumsalze hauptsächlich mit den Histidylresten; Bei höherem pH können die phenolischen Seitenketten des Tyrosins ebenso modifiziert werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Störung durch reaktive Gruppen im Biomolekül (vorwiegend Cys- und Lys-Reste) durch eine zuvor erfolgende und reversible Derivatisierung dieser Gruppen (z.B. Sulfonierung von Cys, Citraconylierung von Lysinen) ausgeschlossen werden. Die reversiblen Modifikationsgruppen werden nach der Immobilisierung oder Quervernetzung des Proteins entfernt. Die Störung durch reaktive Histidine oder Cysteine im aktiven Zentrum kann durch Quervernetzen oder Immobilisieren in Gegenwart eines Substrats oder Substratderivats oder eines kompetitiven oder nichtkompetitiven Inhibitors, vorzugsweise reversibel, umgangen werden, wodurch die Reste vor einer Reaktion und das Protein vor Inaktivierung geschützt werden und möglicherweise ebenso die native Konformation des Proteins oder Peptids oder Biomoleküls während des Immobilisierungsvorgangs bewahrt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ebenso Verfahren, die die Wahrscheinlichkeit einer Reaktion mit den Histidinresten des His-Tags des Biomoleküls erhöhen können, indem ein niedriger pH-Wert während der Reaktionsbedingungen und eine Erhöhung der Hydrophobizität der Membran oder des Trägers, an den das Biomolekül kovalent immobilisiert werden soll, kombiniert werden. Der niedrige pH-Wert, vorzugsweise weniger als 6, zielt auf eine Erhöhung der Hydrophobizität des His-Tags. Unter niedrig-pH-Bedingungen sind die Imidazolgruppen der Histidinreste vollständig deprotoniert, wodurch das Protein einen ziemlich hydrophoben histidinreichen Schwanz auf der Außenseite eines ansonsten ziemlich hydrophilen Proteins erhält. Wird dieses mit einer hydrophilen/hydrophoben Phasengrenzfläche in Kontakt gebracht, so versuchen die His-Tags, mit der hydrophoben Phase in Kontakt zu treten, wobei der Rest des Proteins in der hydrophilen oder wäßrigen Phase verbleibt. Die Hydrophobizität des His-Tags kann auch durch Einschluß hydrophober Reste verstärkt werden. Die Erhöhung der Hydrophobizität der Membran oder des Trägers zielt somit auf die Bereitstellung einer solchen Phasengrenzfläche ab, wobei der Kontakt zwischen den auf der Membran oder dem Träger vorhandenen reaktiven Gruppen mit den Histidinresten des His-Tags erhöht wird, während der Kontakt mit anderen reaktiven Gruppen oder einzelnen Histidinresten, die Teil des Rests des Biomoleküls sind, abnimmt, wodurch die Reaktion in Richtung der kovalenten Bindung mit dem His-Tag getrieben wird. Die Hydrophobizität des Trägers oder der Membran kann einfach dadurch erhöht werden, daß das entsprechende Material, aus dem sich der Träger oder die Membran zusammensetzt, gewählt wird. Ein Beispiel dafür ist die Verwendung von Polystyrol. Als Alternative können zusätzliche Verbindungen in das Polymer integriert oder daran gebunden werden, die dazu neigen, die Hydrophobizität der Mikroumgebung der Membran oder des Trägers zu erhöhen. Dabei lassen sich Glaskügelchen oder Platten oder Nylonstreifen mit 2-(3,4,Epoxy-cyclohexyl)ethyl-trimethoxysilan silanisieren. Neutrale Nylonstreifen können mit hydrophoben Siliziummolekülen behandelt werden. Vorzugsweise mit (Epoxy-cyclohexylethyl)-Methylsiloxan-Dimethylsiloxan-Copolymeren. Durch ein solches Siliziummolekül wird der Streifen mit einem hydrophoben Film überzogen, der die Reaktion mit den Histidinen, die das His-Tag bilden, begünstigt und dennoch die Reaktion mit ringgespannten Epoxy-cyclohexylethylgruppen gestattet. Als Alternative kann der Träger oder können die Membranen mit Verbindungen behandelt werden, die aufgrund ihres von Natur aus amphotären Charakters eine Phasengrenzfläche an der Träger- oder Membranoberfläche erzeugen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung apolarer Lösungsmittel, in die der Träger oder die Membran getaucht werden kann, bevor er bzw. sie in eine wäßrige Phase überführt wird, in der die Reaktion mit dem His-Tag enthaltenden Biomolekül stattfindet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ebenso die Verwendung von Anti-(His-Tag)-Antikörpern oder Mikroproteinen oder von Ni-Chelatoren wie etwa NTA oder IDA, oder allen anderen Molekülen, die eine Affinität für Histidinreste aufweisen. Diese Verbindungen weisen die Eigenschaft auf, daß sie eine hohe bis sehr hohe Affinität für das His-Tag besitzen. Werden diese Verbindungen kovalent an die Träger oder Membranen gebunden oder sonstwie immobilisiert, so können sie verwendet werden, um das His-Tag in enge Nachbarschaft mit dem Träger oder der Membran zu bringen, wonach eine beliebige kovalente Verknüpfung eingegangen werden kann, wodurch die Wahrscheinlichkeit, daß das His-Tag an dieser Reaktion beteiligt ist, erhöht wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere die Verwendung reaktiver Verbindungen, die eine mäßige bis hohe Selektivität für Histidinreste aufweisen, wobei wiederum die Wahrscheinlichkeit, daß das His-Tag an der kovalenten Immobilisierung des Biomoleküls beteiligt ist, erhöht wird. Diethylpyrocarbonat (DEP) sowie photooxidation in Gegenwart von Farbstoffen wie etwa Bengalrosa oder Methylenblau werden häufig als histidinspezifische Modifikationsmittel angegeben. Diethylpyrocarbonat wurde in großem Ausmaß zur Bestimmung der Lokalisierung eines Histidinrests im aktiven Zentrum von Enzymen (Fruchter & Crestfield, J Biol. Chem, 242, 5807-5812, 1967; Davis et al, Biochemistry, 33, 1278-86, 1994; Kunno et al, Arch Biochem Biophys, 277, 211-7 1990) und Cytokinen als Tumornekrosefaktor (Yamamoto et al, Protein engineering, 2, 553-559, 1989) und als rekombinanter menschliche Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor-β (Glockner et al, Biochemistry, 35, 14625-14633, 1996) und Rezeptor (Lacorazza et al, Neurochem Int, 28, 77-87, 1996) verwendet. An die Modifikation von Histidinresten kann sich eine Erhöhung der Absorption bei 230 bis 240 nm anschließen, die als solche zur Quantifizierung der Anzahl modifizierter Reste verwendet werden kann (Roosemont, Anal. Biochem, 88, 314-320, 1978; Melchior & Farhney; Biochemistry, 9, 251, 1970). Die Reaktion mit Diethylpyrocarbonat kann durch Inkubation mit Hydroxylamin-Hydrochlorid bei pH 7 oder durch Inkubation in alkalischer Lösung (Melchior und Farhney, 1970) umgekehrt werden. Von Raab (Z. Biol., 39, 524, 1900) wurde erstmals über die letalen Wirkungen von sichtbarem Licht auf Mikroorganismen, die mit Farbstoffen behandelt worden waren, berichtet, wobei dies später auf die Oxidation bestimmter Aminosäuren zurückgeführt wurde. Methylenblau und Rose Bengal sind die am häufigsten verwendeten Farbstoffe. Diese vermitteln eine Reaktion zwischen Histidinresten und gestatten somit die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen His-Tags. Der Reaktionsmechanismus ist noch nicht vollständig geklärt, doch lassen verschiedene Untersuchungen vermuten, daß die Photooxidation durch photochemisch erzeugten Singulett-Sauerstoff und/oder andere reaktive Sauerstoffspezies vermittelt zu werden scheint (Henderson & Dougherty, Photochem Photobiol, 55, 145-157, 1992). Es stellte sich heraus, daß die Quantenausbeuten allgemein mit steigender Sauerstoffkonzentration ansteigen (Webster et al., Anal Biochem, 179, 154-157, 1989). Die Photooxidation verläuft schnell, selbst bei niedriger Temperatur, und ihre Spezifität läßt sich wiederum durch den pH-Wert beeinflussen (Straight & Spikes, Singlet O₂ Bd. IV, CRC Press, Boca Raton, FL, S. 91-143, 1985). Rose Bengal scheint am selektivsten für Histidinreste zu sein: Man nimmt an, daß die Farbstoffspezifität durch die Bildung kurzlebiger Farbstoff-Imidazolkomplexe begünstigt wird (Bellin und Yankus, Arch. Biochem. Biophys., 123, 18, 1968). Nichtprotonierte Imidazolgruppen des Histidins reagieren schneller mit dem Einzelsauerstoff als die protonierte Form (Shen et al., J. Photochem Photobiol, 35, 213-219, 1996) Wird dieser Reaktionstyp für die kovalente Immobilisierung von Biomolekülen mit einem His-Tag an einen Träger oder eine Membran verwendet, so wird der Träger bzw. die Membran zunächst durch Einführen von Histidinresten oder His-Tags oder beliebigen anderen Molekülen, die Imidazolgruppen enthalten, wie z.B. Histamin, präpariert. Dies läßt sich mit einer beliebigen im Fachgebiet bekannten Reaktion durchführen. Typischerweise wird an die Träger oder Membranen eine Polyhistidinsequenz durch Umsetzung mit aktiviertem Aldehyd gebunden, wodurch eine kovalente Bindung zwischen dem Träger bzw. der Membran und der endständigen Aminogruppe der Polyhistidinsequenz erzeugt wird. Eine Histidinmodifikation findet auch in vivo statt: Das Chinon acetylierter Katecholamine durchläuft nukleophile Additionsreaktionen mit Histidin in kutikulären Proteinen (Xu et al, Arch Biochem Biophys, 329, 56-64, 1996); Michael-Additionsarten von Alkanaladdukten liegen aufgrund von oxidativem Streß in Proteinen vor und sind Marker für Erkrankungen (Friguet et al, J Biol Chem, 34, 21639-21643, 1994; Bruenner et al, Rapid Commun Mass Spectrom, 8, 509-512, 1994; Ohya, Biol Pharm Bull, 17, 554-556, 1994). Brombenzol-3,4-oxid alkyliert Histidinreste von Rattenleberproteinen (Bambal & Hanzlik, Chem. Res Toxicol, 8, 729-35, 1995).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ebenso die Verwendung des His-Tags als Marker oder Nachweiswerkzeug z.B. direkten Einbau markierter Aminosäureanaloge während der Translation oder chemischen Synthese, oder als Tag zur Modifikation. Nachweis von Histidinen unter spezifischen Bedingungen oder durch Verwendung spezifischer Reagensien (Nakamura, J Chromatogr, 131, 215-222, 1977; Sundler & Hakanson, Brain Res Bull, 9, 107-116, 982) oder durch Quervernetzung des His-Tags mit bindenden Verbindungen, wie etwa Antikörpern. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, daß der Nachweis universell ist und daß die Signalintensität unmittelbar mit der Konzentration der „His-reichen" Sequenz korreliert und keine weiteren Werkzeuge/Modifikationen benötigt werden.
Weiterhin läßt sich die „histidinreiche" Sequenz als Quervernetzungselement verwenden, und die Quervernetzten Biomoleküle können dann zur Konjugation an die Membran/Stütze präsentiert werden. Diese Ausführungsform betrifft ebenso die Verwendung verzweigter Peptide, die die Bildung von Aggregaten erhöhen können, oder von reaktiven Zentren für die kovalente Immobilisierung von Biomolekülen an den Träger oder die Membran. Letzteres würde zu einer erhöhten Konzentration an Antigen auf der Membran führen und die Empfindlichkeit erhöhen. Der „Quervernetzung"-Aspekt kann sich auch zur Produktion von Antikörpern gegen Moleküle eignen, die nur eine schwache Immunogenität aufweisen. Dieser Effekt kann beispielsweise mit der bereits gut beschriebenen Verwendung von 1-Fluor-2,4-dinitrofluorbenzol zur Quervernetzung an Trägerstützen durch Lysine verglichen werden.
Der Begriff „Träger", wie er in der gesamten Beschreibung verwendet wird, läßt sich auf enge Weise interpretieren, wobei er einen festen Träger bedeutet, der die Immobilisierung von Biomolekülen auf eine feste Oberfläche gestattet, wodurch alle Vorteile der Immobilisierung, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, bereitgestellt werden. In dieser Hinsicht kann es sich bei dem festen Träger um eine Membran handeln, die sich zur Bereitstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Werkzeugs verwenden läßt. Der Träger kann jedoch auch eine beliebige Form aufweisen, die für den Fachmann vorteilhaft sein kann, wie z.B. Kügelchen, Mikropartikel, Fasern und Hydrogele. Bei einer nicht einschränkenden Liste solcher festen Träger handelt es sich um Nylonstreifen, Polystyrolmembranen, auf Polysacchariden, wie z.B. Zellulose und Agarose beruhende Membranen, synthetische oder biologisch basierte Polymere, Polyphosphazene; und alle Stützen auf Siliziumbasis. Ein solcher Träger kann jedoch auch in Form von Kügelchen oder Mikropartikeln vorliegen, die in Suspension gehalten oder in Säulen gepackt werden können, oder die sich für die Präzipitation eignen. Eine solche Form kann für eine beliebige Form von Biofermentation oder ein beliebiges anderes Verfahren vorteilhaft sein, wobei auf die Bioaktivität des immobilisierten Biomoleküls abgezielt wird. Ebenso kann sie als Schritt in einem Diagnoseverfahren vorteilhaft sein, beispielsweise um einen Konzentrationsschritt mittels Präzipitation bereitzustellen. In dieser Hinsicht kann bzw. können der Träger bzw. die Mikropartikel zur Erhöhung der Empfindlichkeit verwendet werden. Eine Liste möglicher Materialien, die in dieser Hinsicht verwendet werden können, besteht aus weiteren Proteinen oder Peptiden oder Aggregaten davon, Mikropartikeln von viralem Ursprung, proteinhaltigen Partikeln oder Mikropartikeln, die Polysaccharide, DNA, RNA, Oligonukleotide oder Liposomen oder Kombinationen daraus umfassen, bestehen.
Der Begriff „Träger", wie er in der gesamten Beschreibung verwendet wird, kann ebenso weitgefaßt interpretiert werden. In dieser Hinsicht berücksichtigt der Träger die kovalente Verknüpfung mit einem Biomolekül, ohne daß dabei eine feste Form, wie z.B. Membranen oder Kügelchen, entsteht, die präzipitiert werden kann. Die Kügelchen oder Mikropartikel können so klein sein, daß sie nicht länger zu einer Suspension führen, die präzipitierbar ist, sondern eine kolloidale Lösung oder eine Lösung ergeben. Solche Mikropartikel können somit ein beliebiges Molekül oder beliebige Moleküle umfassen, die eine kovalente Quervernetzung mit Biomolekülen mittels Aminosäureresten des His-Tags der Biomoleküle berücksichtigen und die klein genug sind, um nicht zu präzipitieren. Dennoch kann durch einen Quervernetzungsvorgang zwischen solchen Partikeln ein Vorgang, wie z.B. eine Präzipitation, noch stattfinden, womit beispielsweise ein Werkzeug für diagnostische Zwecke bereitgestellt wird. Wird der Begriff „Träger" auf diese weitgefaßte Weise interpretiert, so betrifft die vorliegende Erfindung ebenso ein Verfahren zur kovalenten Verknüpfung zwischen zwei Biomolekülen, von denen wenigstens eines ein His-Tag enthält. Diese Biomoleküle können natürlicherweise dazu neigen, miteinander auf nichtkovalente Weise wechselzuwirken. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ebenso ein Verfahren zur kovalenten Stabilisierung von Oligomeren. Solche Oligomere sind beispielsweise die Dimere, die zwischen zwei Leucin-Zipper-Proteinen oder zwischen Myc- und Max-Proteinen ausgebildet werden. In einer typischen Situation werden beide Partner solcher Dimere mit einem His-Tag, z.B. aminoterminal vom Leucin-Zipper, versehen. Nach der Oligomerisierung sind beide His-Tags einander nahe genug, um eine kovalente Verknüpfung, beispielsweise mittels photooxidativer Quervernetzung mit Rose Bengal, zu gestatten. Einer der Partner kann ebenso eine Zuckergruppierung enthalten, die nach Oxidation Aldehydgruppen bereitstellt, die eine kovalente Verknüpfung mit den Histidinresten des His-Tags berücksichtigen.
Es versteht sich, daß die Erfindung ebenso alle Kombinationen der Verfahren, wie sie in den verschiedenen Ausführungsformen dargelegt sind, betrifft.
Es versteht sich ebenso, daß die Erfindung ebenso alle Produkte betrifft, die durch eine der Ausführungsformen, wie sie oben dargelegt sind, erhalten wurden, sowie die Verwendung davon.
Die Verwendung immobilisierter Enzyme und insbesondere von Enzymen, die unlöslich gemacht wurden, hat zunehmende Bedeutung in den großtechnischen Prozessen, beispielsweise der Fermentationsindustrie, der Produktion von Antibiotika und in chemischen und/oder biologischen Synthesen, erhalten. Zu den Anwendungsgebieten gehören darüber hinaus, ohne darauf beschränkt zu sein, metabolische Untersuchungen, vor allem für diagnostische Zwecke, wobei Antigene immobilisiert werden, sowie die Verwendung als Medikamente, insbesondere nach topischer, jedoch auch mit oraler und parenteraler Verabreichung, wobei die fixierten Biomoleküle vorzugsweise in Form von Mikrokapseln verabreicht werden. Innerhalb dieses Gebiets sollte man ebenso die wachsende Bedeutung der Verwendung von Oligomeren, beispielsweise in Form bispezifischer Antikörper mit erhöhter Avidität, oder von Oligomeren mit einer enzymatischen Eigenschaft einerseits und einer Zielfunktion andererseits in Betracht ziehen.
Da diese Biomoleküle in immer größerer Anzahl durch rekombinante Techniken erhalten werden, lassen sich viele Proteine und Peptide leicht in einem Ein-Schritt-Reinigungsverfahren mittels eines fusionierten His-Tags, das eine Metall-Immunaffinitätschromatographie berücksichtigt, gewinnen. Die vorliegende Erfindung zeigt, daß das Vorhandensein solcher His-Tags direkt für eine kovalente Immobilisierung ausgenutzt werden kann, eine Möglichkeit, die mehr als ein Jahrzehnt vernachlässigt worden ist. Eine solche Strategie berücksichtigt gerichtete kovalente Immobilisierungen mittels kovalenter Bindungen leicht erhältlicher Biomoleküle, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Inaktivierung des Biomoleküls nach Immobilisierung abnimmt. Die Wahrscheinlichkeit einer Inaktivierung wird weiter dadurch reduziert, daß das His-Tag als Abstandhalter fungiert. Eine solche Form von Immobilisierung optimiert ebenso die Präsentation des Biomoleküls, wenn auf Wechselwirkungen mit anderen Biomolekülen abgezielt wird, wie im Fall von DNA-DNA-Wechselwirkungen, DNA-RNA-Wechselwirkungen, DNA- oder RNA-Protein-Wechselwirkungen und Epitop-Antikörper-Wechselwirkungen. Gleichzeitig wird durch das His-Tag ein universelles Tag zum Nachweis mittels Verwendung von Anti-His-Antikörpern und/oder Mikroproteinen bereitgestellt, gleichgültig ob es chemisch oder mittels rekombinanten Mitteln eingeführt wurde. Wird es chemisch eingeführt, so können Fluoreszenzfarbstoffe eingebaut werden. Die vorliegende Erfindung berücksichtigt ebenso die kovalente Quervernetzung zwischen zwei Biomolekülen mittels eines His-Tags. Dies berücksichtigt die Synthese hochstabiler Oligomere, die für die Diagnose und Therapie extrem geeignet sein können, wie beispielsweise im Fall von bispezifischen Antikörpern. Darüber hinaus weisen die Polyhistidinsequenzen eine sehr niedrige Immunogenität auf, die sie vor allem für therapeutische Verwendungen geeignet macht.
Diese und weitere Verwendungen der Erfindung sollen im Umfang der Erfindung liegen. Die unten angegebenen Beispiele sind lediglich zu Veranschaulichungszwecken beigefügt und sollten nicht so verstanden werden, daß sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
Beispiel 1: Quervernetzung von (His)₆-Proteinen in Gegenwart von Rose Bengal in Lösung

a) (His)₆-p24 als Antigen: Eine Lösung von 10 mg/ml p24(His) wurde in luftgesättigtem Phosphat-Puffer bei pH 7 gelöst und Rose Bengal bis zu einer Endkonzentration von 0,01% zugegeben. Die Lösung wird bei 25°C temperiert und mit einem 300-Watt-Strahler 60 Minuten beleuchtet. Nach der Bestrahlung wird die Probe im Dunklen gehalten und der Bengalrosa-Farbstoff durch Dialyse gegen den Phosphat-Puffer entfernt.
b) (His)₆-ScFv-Antikörper: Anti-IFN-g-ScFv-D9D10 (His) wird über Ni²⁺-IMAC gereinigt und an Sephadex-G25 auf 50 mM MES, 150 mM NaCl, pH 6,5 entsalzt. Die ScFv-Quervernetzung wird wie unter a) beschrieben durchgeführt. Die quervernetzten oligomeren ScFv-D9D10 werden vom monomeren und Rose Bengal durch Chromatographie in PBS an Superdex G75 getrennt.

Beispiel 2: Immobilisierung von Peptiden mit His-Tag an Polymeren

a) Kovalente Bindung durch die His-reiche Sequenz, wobei das His-Tag als Abstandhalter fungiert: Nicht voraktivierte Nylonmembranen werden mit 2,9 M HCl 60 min. bei 40°C inkubiert und die Membranen nacheinander mit Wasser und 0,1 M K₂HPO₄, pH 8 gespült. Die Membranen werden mit 5% (v/v) Glutaraldehyd in 100 mM K₂HPO₄, pH 8,0 bei 40°C 60 min. inkubiert. Die Membranen werden wiederum mit Wasser sowie 50 mM Phosphat-Puffer, pH 6,5 gewaschen. Das Peptid 315 (enthält ein C-terminales His-Tag) wird über Nacht mit der Aldehyd-aktivierten Membran in 50 mM Phosphat bei pH 6,5 inkubiert, und die nichtreaktiven Gruppen werden nach Waschen mit 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 blockiert.
b) Nichtkovalente Bindung an nichtaktivierten Mikrokügelchen nach kovalenter Quervernetzung durch die His-Tags. Peptid 315 (5 mg/ml) wird mit dem wie in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren quervernetzt. Das quervernetzte Material wird von dem Rose Bengal und monomerem Peptid durch Gelfiltration in PBS getrennt, und die oligomeren Fraktionen werden nach Konzentration auf 1 mg/ml mit 10% Mikrokügelchen (Polystyrol K030, Prolabo), die wie vom Hersteller beschrieben vorbehandelt wurden, gemischt. Nach Lagerung über Nacht bei 4°C wird die Lösung von Antigen-Mikropartikel-Komplexen zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Die Mikropartikel werden danach durch Inkubation in Puffern mit 2% Gelatine blockiert. Die kovalente Quervernetzung erhöht die Antigendichte ebenso wie die Stärke der Bindung auf den Mikropartikeln.

Beispiel 3: Kovalente Immobilisierung von Peptid mittels eines Histidin-Tags auf voraktivierten Membranen durch Einschluß eines zugegebenen Abstandhalters zur Verwendung in LIA-Anwendungen.
Aminoaktivierte Nylonmembranen (Pall Biodyne A) werden mit 250 μg/ml heterobifunktionellem Sulfosuccinimidyl (4-Iodacetat) Aminobenzoat (sulfoSlAB, Pierce) in 100 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,5 1 h bei Raumtemperatur behandelt. Die Membran wird mit dem Wasser gewaschen, und 100 μg/ml Peptid 315 wird in 25 mM Phosphat-Puffer bei pH 6,2 auf die aktivierte Membran gesprüht.
Die nichtreagierten aktiven Gruppen werden nach Waschen mit einem Überschuß von Cystein in 100 mM Carbonatpuffer pH 8,2 blockiert, und die Membran wird mit menschlichem Serum Nr. IG 17 758 inkubiert, um die Reaktion mit dem Antigen zu verifizieren.
Der Nachweis wird durchgeführt, indem der Streifen mit alkalischer Phosphatase markiertem Anti-Mensch-IgG in Tris-Puffer, pH 9,5 in Gegenwart von NBT/BCIP inkubiert und die Farbreaktion durch Zugabe von 10 mM EDTA gestoppt wird.
Beispiel 4: Kovalente Immobilisierung von Protein mittels eines Histidin-reichen Tags auf voraktivierten Polymeren durch Einschluß eines zugegebenen Abstandhalters für ELISA-Anwendungen.
Durch Modifikation von aminoaktivierten Mikrotiterplatten erhaltene thiolaktivierte Mikrotiterplatten werden im Dunkeln mit dem bifunktionellen bis-Halogenacetyl-dibromaceton inkubiert, und der Überschuß an Reagens wird durch Waschen der Polystyrolplatten entfernt. Gereinigtes sulfoniertes H6TPN15 (5 μg/ml) wird 2 h in 50 mM Phosphat-Puffer, pH 6,3 inkubiert und anschließend mit dem gleichen Puffer gewaschen.
Die verbliebenen reaktiven Gruppen werden mit 5 mM Cys in Phosphat-Puffer, pH 7,5 blockiert, und die Vertiefung wird mit menschlichem Serum Nr. IG 12537 inkubiert, um die Reaktion mit dem Antigen zu verifizieren.
Der Nachweis wird durch Inkubation mit Pferd-Peroxidase markiertem Anti-Mensch-IgG in Gegenwart von TMB geführt und die Farbreaktion durch Zugabe von 1 N Schwefelsäure gestoppt.
Beispiel 5: „His"-Tag-vermittelte gerichtete kovalente Immobilisierung in Gegenwart eines „His"-Tag-Komplexierungsmittels.
Gereinigte Anti-(His)₆-Antikörper (1 mg/ml in Borat-Puffer, pH 9,0) werden kovalent mit MiniLeak-Harz (Kem En-Tec, Dänemark) verknüpft. Die nichtreagierten Antikörper werden durch Waschen abgetrennt und die verbliebenen aktiven Gruppen durch Inkubation in 100 mM Ethanolamin, pH 9 blockiert. Gereinigtes HCV-Els.His (0,1 mg/l) wird mit dem Harz gemischt und das freie Els(His) durch Waschen mit PBS abgetrennt. Der Els(His)-anti(His)-Antikörper-Komplex wird durch Zugabe von 5 mM sulfoBSOCOES in Borat-Puffer pH 9,0 kovalent quervernetzt. Nichtkovalent gebundenes Antigen wird durch Waschen der Vertiefung mit 100 mM Glycin-HCl abgetrennt.
Die quervernetzte Antigen-Antikörper-Säule wird zur Reinigung von E1s bindenden Proteinen, wie etwa des Rezeptors, verwendet.
Als Alternative wird die Antikörper-Antigen-Quervernetzung sowie die Trennung von freiem Antigen vor der Präsentation an das Harz durchgeführt.
Beispiel 6: His-Tag-vermittelte gerichtete kovalente Immobilisierung monoklonaler Antikörper für Immunaffinitätsreinigung.
Der monoklonale Anti-Interferon-g-Antikörper F1 wird mit Periodat versetzt, um die glyzidischen Gruppierungen zum Aldehyd zu oxidieren. Nach Entfernung von überschüssigem Reagens wird der modifizierte Antikörper mit Poly(His) bei pH 6,5 inkubiert. Das nichtreagierte Poly(His) wird durch Gelfiltration abgetrennt und der Poly(His)-modifizierte MAb bei pH 6,5 zu einem Polysaccharidträger, der zuvor durch Periodatbehandlung aktiviert wurde, gegeben.
Interferon-gamma enthaltendes CHO-Medium wird auf die Antikörpersäule geladen und das Harz mit einem 25 mM Phosphat-Puffer, pH 7,5, 150 mM NaCl gewaschen. Das IFN-g wird durch Auftragen von 100 mM Trinatriumphosphat-Puffer, pH 11 eluiert und das Eluat sofort danach durch Zugabe von 1 M Essigsäure neutralisiert.
Beispiel 7: Antigen-Oligomerisierung durch kovalente Quervernetzung zur Immunisierung und Antikörperproduktion.

a) Das vierfach verzweigte Peptid 315 mit einem (His)₆-Tag als Startsequenz wird in MES-Puffer, pH 6,5 solubilisiert und im Dunkeln in Gegenwart von 0,01% Rose Bengal inkubiert. Die Photooxidation wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die quervernetzten Formen des Peptids werden durch Gelfiltration an Superdex G75 in PBS getrennt und in Tiere (z.B. Kaninchen für polyklonale Antikörper, Mäuse für monoklonale Antikörper) nach Mischen mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA) injiziert.
b) Als Alternative wird das Rose Bengal für die Quervernetzung durch das bifunktionelle Reagens 1,3-Dibromaceton ersetzt und die Quervernetzung in einem MES-Puffer pH 6,5 durchgeführt. Die quervernetzten Antigene werden durch Gelfiltration in PBS getrennt und nach Mischen mit dem CFA in Tiere injiziert.

Beispiel 8: Beseitigung störender reaktiver Gruppen vor der kovalenten Immobilisierung des Biomoleküls durch die Histidin-reiche Sequenz.

a) Reversible Blockierung des enzymatischen aktiven Zentrums Das gereinigte Papain(His)₆-Protein wird durch Behandlung mit einem 70fachen Überschuß an Methylmethanthiosulfonat (gegenüber dem Thiol von Papain) in Phosphat-Puffer, pH 7,0, bei 4°C 4 h modifiziert, um das Cystein im aktiven Zentrum des Thiolenzyms zu modifizieren. Die Lösung wird auf pH 4,5 angesäuert und der Überschuß an Blockierungsreagens durch Gelfiltration an Sephadex G25 abgetrennt. Das Papain-(His)-Fusionsprotein wird in 50 mM MES-Puffer, pH 6,5, durch Inkubieren einer Polysaccharidstütze, die zuvor mit Periodat aktiviert wurde, immobilisiert. Das immobilisierte Enzym wird durch Behandlung in 35 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, der einen Überschuß einer Thiolverbindung, z.B. 10 mM Cystein, zur Abtrennung des Blockierungsmittels enthält, reaktiviert.
b) Beseitigung störender Gruppen auf Antigenen Das gereinigte rekombinante TPNp15(His)-Fusionsprotein wird in 50 mM Borat-HCl, 6 M Harnstoff, pH 8,5, 2 mM DTT solubilisiert. Citraconsäureanhydrid wird nach und nach über 1 h unter ständigem Rühren zu der Lösung gegeben, bis ein 100facher molarer Überschuß an Lysinen im Protein erhalten wird. Der pH-Wert wird mit 1 N NaOH unter Verwendung eines pH-Titrators bei pH 8,5 gehalten. Nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur wird festes Natriumphosphat bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 50 mM zugegeben und der pH-Wert mit 2 N HCl auf pH 7 eingestellt. Unter ständigem Rühren werden festes Na₂S₄O₆ und Na₂SO₃ bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 65 mM bzw. 130 mM zugegeben und 6 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wird auf PBS an Sepharose G25 entsalzt und die Proteinlösung auf 100 μg/ml in MES-Puffer, pH 6,5, unmittelbar vor dem Aufsprühen auf die LIA-Membran, die mit Glutaraldehyd wie in Beispiel 2a beschrieben aktiviert wurde, verdünnt. Die nichtreaktiven Gruppen auf der Membran werden mit 50 mM Ethanolamin-Puffer pH 9, blockiert. Die citraconylierten und Sulfonierungsgruppen werden durch aufeinanderfolgende Inkubation der Membran bei pH 4 über 2 h und in 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 mit 1 mM DTT und 1 mM EDTA über 30 min. abgetrennt.

Beispiel 9: Auf dem His-Tag beruhender gleichzeitiger Antigennachweis unterschiedlicher Erkrankungen.

a) Die in E.coli exprimierten Antigene Syphilis-(His)₆-p15, HIV-O(His)₆-p24 und HCV-(His)₆-E2s werden durch IMAC an IDA-Sepharose FF gereinigt und nach dem Entsalzen und Verdünnen auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml in Hydrogencarbonat-Puffer auf die ELISA-Polystyrolplatten geschichtet.

Zweitens wird HRP (10 mg/ml) in 10 mM Phosphat-Puffer, pH 7,2, 150 mM NaCl solubilisiert und im Dunkeln 30 min. durch Behandlung mit 8 mM Periodat oxidiert. Das aldehydaktivierte HRP wird in PBS entsalzt und die vereinigten HRP-Fraktionen werden 2 h bei Raumtemperatur in 100 mM Borat-Puffer pH 8,2 mit einem 2fachen molaren Überschuß an Poly(His) inkubiert. Die nichtreagierten aktiven Gruppen werden mit 50 mM Ethanolamin, pH 8,5 blockiert, und das Enzym wird vom Peptid durch Gelfiltration in 50 mM MES-Puffer, pH 6,5, 150 mM NaCl getrennt. Die HRP-Peptid-Lösung wird jeweils mit einer equimolaren Menge der (His)₆-Antigene gemischt und durch Behandlung mit Rose Bengal wie in Beispiel 1 beschrieben quervernetzt. Die kovalent photoquervernetzten Antigen-HRP-Komplexe werden vom freien (His)₆-Antigen durch Chromatographie an Con A Sepharose getrennt und die gebundenen Komplexe durch PBS mit 0,5 M a-Methylmanosid eluiert.
Das menschliche Serum wird im Probenverdünnungs-Puffer verdünnt und nach 2stündiger Inkubation bei 37°C gewaschen, um die freien Serumproteine abzutrennen.
Der HRP-Antigen-Komplex wird im Brücken-ELISA verwendet, wobei TMB als Nachweisreagens eingesetzt wird.
Beispiel 10: Die Bindung von His-haltigem Oligo an aktivierte Nylonmembran

a) Kovalente Bindung ohne Quervernetzung: 1,25 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.HCl (EDC.HCl) wird in einem Eppendorf-Röhrchen eingewogen. 7,5 μl Oligonukleotid (~100 μg oder ~10 nmol), das eine 5'-Phosphatgruppe enthält, sowie 5 μl 0,25 M bis-Hydrazid-Verbindung in 0,1 M Imidazol, pH 6, werden zugegeben und vermischt. Nach 5 min. werden zusätzliche 20 μl 0,1 M Imidazol zugegeben und die Lösung 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Ein 5facher molarer Überschuß an NH₂-(Gly)₂-(His)₄-Peptid wird zu der Nukleinsäurelösung gegeben und 1 h bei 50°C inkubiert. Die Sonde wird an Sephadex G25 in Phosphat-Puffer, pH 7,2, 10 mM EDTA entsalzt. Das „His"-markierte Oligo wird in Gegenwart von EDC.HC1 aktiviert und an die Pal-Nylon-Biodyne-A-Membran (Nylon-NH₂) präsentiert.
b) Die Bindung von (His)₆-haltigen Oligos an die Membran nach Quervernetzung Das Verfahren ist identisch zu dem im vorhergehenden Beispiel beschriebenen, und zwar bis zur Bindung der His-reichen Sequenz an das Oligo. Der kovalente Oligo-His-Komplex wird durch Sephadex G25 in Phosphat-Puffer, pH 7,0, entsalzt und im Dunkeln gehalten, wenn Rose Bengal zu der Lösung gegeben wird. Die Lösung wird mit Sauerstoff gesättigt, gerührt und mit einem Strahler von 300 W 30 min. beleuchtet. Die Lösung wird im Dunkeln gehalten, und die Produkte werden durch Chromatographie an Sephadex G25 in Phosphat-Puffer, pH 7,0, getrennt.

Beispiel 11:
Maleinsäureanhydrid-aktivierte Nylonstreifen ABC (LIA-Streifen) werden bei pH 9,0 mit Peptid 315, das einen hohen Anteil an Histidin, Tyrosin und Tryptophan enthält und in Carbonat-Puffer pH 9 gelöst ist, umgesetzt. Nach einer 5minütigen Reaktion, wird das überschüssige Peptid mit Carbonat-Puffer mit 5% DMSO weggewaschen.
Der Ni²⁺-Komplex des rekombinanten Antigens Ro60, enthaltend einen Histidin-Schwanz, wird durch Inkubation des Proteins in 6 M Guadinin oder Harnstoff mit einer Konzentration von 2 mg/ml mit 5 mM NiCl₂ präpariert. Nach einer 5minütigen Equilibrierung bei Raumtemperatur wird der Komplex gegen Carbonat-Puffer oder PBS dialysiert und anschließend auf 100 μg/ml, wobei es sich um die Sprühkonzentration handelt, verdünnt.
Unmittelbar vor dem Sprühen wird die Lösung mit 100 μM Monoperoxyphthalsäure (MMPP) supplementiert und der Streifen 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Als Alternative wird die Lösung ohne Zugabe von MMPP versprüht, doch wird nach dem Sprühen der Streifen in 100 μm MMPP inkubiert. Das Quenchen der Streifen wird durch Reaktion mit 0,1 M Tris-Puffer bei pH 9,0 durchgeführt.
Der Rest des Verfahrens entspricht etablierten LIA-Verfahren, wie sie beispielsweise in der WO 96/13590 offenbart sind.
Beispiel 11b
Nylonstreifen werden mit Peptid 315, das 6 terminale Histidine enthält, inkubiert. Anschließend wird die Membran mit Nickelchlorid inkubiert, um die Histidine abzusättigen. Überschüssiges NiCl₂ wird durch Waschen entfernt.
Die Membran wird mit SmD-Antigen-Lösung in der üblichen Konzentration, die MMPP zur Quervernetzung enthält, besprüht. Die weitere Entwicklung der Membran wird wie im für LIA beschriebenen Standardverfahren durchgeführt.
Beispiel 12
Maleinsäureanhydrid-aktivierte Nylonstreifen ABC_ werden mit Peptid 315 (mit 6C-terminalen Histidinen) in Carbonat-Puffer bei pH 9 5 Minuten reagiert und danach mit Carbonat-Puffer gewaschen. Nach Blockierung des Streifens mit 100 mM Tris-HCl, pH 8,5, sowie Waschen mit Wasser wird der Streifen mit 5 mM CrCl₃ oder NiCl₂ bei Raumtemperatur in Wasser inkubiert. Die Streifen werden zur Abtrennung überschüssiger Metallionen gründlich gewaschen.
Der Streifen wird dann mit einer Oligonukletidsonde zum Nachweis der HIV-Resistenz in 6 × SSC über 60 min. inkubiert, wonach der Streifen getrocknet und blockiert wird.
Das PCR-Produkt wird danach in Puffer mit 0,4 μM NaOH und 100 μM EDTA aufgetragen.
Die Hybridisierung wird wie für Nitrozellulosemembranen beschrieben durchgeführt.
Beispiel 13
Es werden Polyphosphazen-Mikropartikel präpariert, die das Peptid 315 (Histidin-Schwanz, 6 H) aufgepfropft auf dem Polymer, mit dem die Mikropartikel hergestellt werden, enthalten und in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer mit pH 7,4 suspendiert. Rekombinantes E1 HCV-Protein mit einem Histidinabschnitt wird im gleichen Puffer mit 0,05% Chaps gelöst. Das Gemisch wird luftgesättigt und mit Rose Bengal in einer Endkonzentration von 25 μM versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 25°C an der Luft gerührt und mit Breitbandlicht bei fixiertem Lichtenergiefluß beleuchtet.
Das Reaktionsgemisch wird gesammelt, entlüftet, und überschüssiges nichtreagiertes E1 und quervernetztes E1 von den E1-haltigen Partikeln mittels Größenausschlußchromatographie getrennt.
Die Partikel wurden ebenso wie quervernetzte E1-Fraktionen zur Immunisierung von Mäusen verwendet, wobei die immunstimulierende Aktivität von Phosphazen mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA) verglichen wurde.
Andererseits werden die Partikel auf ELISA-Platten zur Verwendung in unserem E1-Überwachungstest geschichtet. Die OD-Antworten und Leistung dieser Partikel werden mit E1s Oligomeren verglichen.
Beispiel 13b
In einem Parallelexperiment wird E1 verwendet, das keinen Histidin-Schwanz enthält.
Beispiel 13c
In einem weiteren Parallelexperiment werden die rekombinanten Proteine E1 und NS3, die beide eine His-Tag-Sequenz enthalten, in equimolaren Mengen gemischt und in der Lösung mit dem Partikel inkubiert, um nach Quervernetzung durch Rose Bengal ein multifunktionelles Nachweissystem zu erzeugen.
Beispiel 13d
Verwendung der gleichen Phosphazen-Mikropartikel mit Peptid 315, jedoch mit Verwendung des wie in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrens zur Kopplung von Histidinhaltigen rekombinanten Proteinen.
Beispiel 14:

a) Glasstreifen (SiO₂ mit Silanolen) werden gereinigt. Zur Silanisierung mit 2-(3,4-Epoyecyclohexyl)ethyl-trimethoxysilan werden die Streifen in einer inerten Atmosphäre in eine 2%-Lösung des Epoxyalkoxyds in trockenem Toluol über einen Zeitraum von 2 Stunden gelegt. Der Streifen wird aus der Lösung genommen, in trockenem Toluol gespült und an der Luft trocknen gelassen. Auf diese Weise wird ein Silanfilm aufgetragen. Die Streifen werden dann mit den in Phosphat-Puffer pH 6,0 mit 0,1% CHAPS gelösten rekombinanten Hüllproteinen E1 (mit His-Tag) oder E2 gesprüht. Verbliebene Epoxygruppen werden danach durch Inkubation in 1% Ethanolamin über 2 h bei Raumtemperatur blockiert.
b) Maleinsäureanhydrid-aktivierte Nylonmembranen werden mit 2-(3,4-Epoxycyclohexylethyl)-Amino zur Erzeugung ringgespannter Epoxycyclohexylgruppen reagiert. Die Membranen werden mit NS3 mit His-Tag bei pH 6,0 inkubiert und durch Behandlung mit Ethanolamin blockiert.

Beispiel 15:

a) Der neutrale Nylonstreifen wird mit einer 1%igen Lösung eines hydrophoben Siliziums, vorzugsweise mit Epoxy-cyclohexly-ethyl)methylsiloxan-dimethylsiloxan-copolymer, behandelt und bei Raumtemperatur getrocknet. NS3 mit His-Tag wird mit 100 μg/ml in Phosphat-Puffer pH 6,0 gesprüht und getrocknet.
b) Aminoaktivierte Nylonmembranen werden mit einem Überschuß des hydrophoben Silikons wie in a) beschrieben behandelt. Die weitere Behandlung mit Proteinen mit His-Tag erfolgt wie unter a beschrieben.

Claims

Verfahren zur kovalenten Immobilisierung und/oder kovalenten Konjugation von Proteinen oder Peptiden oder anderen Biomolekülen an eine Stütze oder einen Träger durch Ausnutzen des Vorhandenseins eines His-Tags, und wobei an der kovalenten Verknüpfung Aminosäurereste des His-Tags, das am Aminoterminus oder Carboxyterminus oder im Inneren des Proteins oder Peptids lokalisiert sein kann, beteiligt sind und die Verknüpfung durch chemische oder rekombinante Mittel eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das His-Tag mindestens 3 Histidingruppen umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die kovalente Immobilisierung und/oder kovalente Konjugation mittels der freien aminoterminalen Amingruppe oder der carboxyterminalen Carboxygruppe des endständigen Aminosäurerests des His-Tags erzielt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Gruppen der Stütze oder des Trägers nicht besonders selektiv für Histidin sind, wobei jedoch die Selektivität gegenüber Histidin in signifikanter Weise zugunsten von Histidin gegenüber den anderen Resten durch Anwendung wenigstens einer der folgenden Methoden vergrößert wird: –Verwenden geeigneter Reaktionsbedingungen, wie z.B. pH, Lösungsmittel, Reagensüberschuß, Kinetik, Temperatur u.ä., – Fusionieren des His-Tags an oder in das zu immobilisierende Peptid oder Protein oder Biomolekül, so daß das His-Tag auf der Außenseite des Proteins oder Peptids lokalisiert ist, wodurch die Wechselwirkung zwischen den Histidinresten des Peptids oder Proteins und den reaktiven Gruppen der Stütze oder des Trägers erleichtert wird, – Verwenden einer ausreichenden Anzahl an Histidinresten, aus denen sich das His-Tag zusammensetzt, wobei das His-Tag mindestens drei Histidine innerhalb eines Abschnitts von 6 Aminosäuren enthält, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Reaktion zwischen den reaktiven Gruppen der Stütze oder des Trägers und den Histidinresten erhöht wird, – durch Blockieren von von Histidin verschiedenen Resten, die mit den reaktiven Gruppen der Stütze oder des Trägers reagieren könnten, – Zugabe eines kompetitiven Inhibitors oder Substrats zur Blockierung der Reaktion derjenigen reaktiven Aminosäuren, die das aktive Zentrum bilden, – Erhöhen der Hydrophobizität der Stütze oder des Trägers oder der Mikroumgebung der Stütze oder des Trägers in Kombination mit einer Erniedrigung des pH-Werts, wodurch eine Reaktion mit von Histidin verschiedenen Resten vermieden und die Wechselwirkung mit Aminosäureresten des His-Tags erhöht wird, oder – Positionieren des His-Tags in enge Nachbarschaft zu der Stütze oder dem Träger durch Verwendung von Anti-His-Tag-Antikörpern oder Mikroproteinen oder durch Ni-Chelatoren, wie z.B. NTA oder IDA, oder andere His-Tag-bindende Verbindungen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Gruppen der Stütze oder des Trägers eine Selektivität für Histidin aufweisen, wobei die reaktiven Gruppen vorzugsweise aus den folgenden Gruppen ausgewählt sind: – Verwendung von Bengalrosa oder Methylenblau zur Vermittlung einer photooxidativen Quervernetzung zwischen Histidinresten, die das His-Tag umfassen, und Histidinresten, die auf dem Träger oder der Membran lokalisiert sind. – Verwendung von Diethylpyrocarbonat und einem Derivat davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur kovalenten Immobilisierung und/oder kovalenten Konjugation von Proteinen oder Peptiden oder anderen Biomolekülen an eine Stütze oder einen Träger mittels eines His-Tags, wobei die aktivierten Gruppen der Stütze eine Selektivität gegenüber den Histidinresten zeigen und wobei die Selektivität gegenüber Histidinresten des His-Tags durch eine Kombination der Verfahren, wie sie in Ansprüchen 1 bis 5 beschrieben sind, erreicht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man das His-Tag des Peptids, Proteins oder anderen Biomoleküls durch Photoreaktion in Gegenwart von Sauerstoff und Bengalrosa oder Methylenblau oder einem bifunktionellen Reagens mit anderen His-Tags reagieren läßt und wobei das andere His-Tag ein Teil von Proteinen, Peptiden oder anderen Biomolekülen sein kann oder mit einer Membran oder einem Träger verknüpft sein kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Stütze oder der Träger: – eine Membran mit Membranen auf Styrol- oder Nylonbasis, – andere Proteine oder Peptide oder Aggregate davon, – Mikropartikel viralen Ursprungs, – polysaccharidartige Mikropartikel, – proteinartige Mikropartikel, – Biomoleküle, wie z.B. Liposomen, DNA, RNA, Oligonukleotide, Liposomen, – organische synthetische Polymermikropartikel und Biopolymermikropartikel oder – anorganische Substrate auf Siliziumdioxidbasis umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das His-Tag eine beliebige Art einer nachweisbaren Markierung enthält.