CN105483111A - 固定化脂酶及其制备方法 - Google Patents

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CN105483111A CN201410504720.1A CN201410504720A CN105483111A CN 105483111 A CN105483111 A CN 105483111A CN 201410504720 A CN201410504720 A CN 201410504720A CN 105483111 A CN105483111 A CN 105483111A
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王明启
许骏
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Abstract

本申请涉及一种固定化脂酶，其包括脂酶和作为固定载体的磁性颗粒。本申请还涉及上述固定化脂酶的制备方法，以及固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用。

Description

固定化脂酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及固定化脂酶及其制备方法，特别涉及固定化脂肪酶的制备方法。本发明还涉及制备的固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用。
背景技术
脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、及立体异构体拆分等化学反应，常被应用于食品、日化、生物能源等领域。然而，它的广泛应用仍然被稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，给分离纯化带来困难等缺陷所限制。为了改善脂肪酶的这些特性，开发了许多利用载体固定化脂肪酶的技术，主要包括物理吸附，共价交联和有机/无机材料包裹三种方式。
物理吸附方法的代表是目前诺维信公司(Novozymes)商品化的固定化脂肪酶(Novozym435)，是用大孔树脂吸附的脂肪酶。此外还有用活性炭、硅胶等材料进行吸附的方法。其次，共价交联法多采用高碘酸钠、戊二醛等化学试剂将酶与载体进行交联。包裹方式的脂肪酶固定化方法主要采用聚丙烯酸酯、聚氨酯、有机硅等作为粘合剂与粗酶粉或酶溶液混合成浆状涂布于载体上。然而，吸附法存在温度稳定性较差、反应扩散阻力较大、吸附不牢固等问题。共价法和包埋法，需要借助多种化学试剂，共价法甚至涉及多步化学反应，会导致脂肪酶部分位点的失活，造成脂肪酶活力的下降。而且，上述传统方法得到的固定化酶是脂肪酶粗酶制剂，含有多种杂蛋白，不具有专一性；此外酶与产物分离仍然需要高速离心的方式，费时耗力，不具有便捷性。
发明内容
第一方面，本申请提供了一种固定化脂酶，其包括脂酶和作为固定载体的磁性颗粒。
在本发明的一些实施方案中，所述脂酶携带分子标签，所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。在优选的实施方案中，所述脂酶所携带的分子标签为组氨酸标签(His-tag)。
在一些实施方案中，与上述分子标签结合的物质为金属离子，在优选的实施方案中，所述金属离子为钴、镍、铜、锌、铁等。更优选地，所述金属离子为Co2+。
在一些实施方案中，本发明所用的磁性颗粒的直径为0.1-10μm，优选为约1-5μm。在一实施方案中，所述磁性颗粒的磁核选自铁氧体、金属、金属合金、铁氧化物、二氧化铬等。在优选的实施方案中，所述磁核为铁氧化物，更优选为γFe3O4。
在优选的实施方案中，固定化脂酶的固定作用力是基于磁珠表面的金属离子(例如Co2+)与脂酶上分子标签(例如His-tag)之间的螯合亲和作用。这种固定方式能方便快捷地利用磁分离回收酶(便捷性)，且结合力(亲和作用)比普通物理吸附法更为牢固(高稳定性)。
在优选的实施方案中，上述脂酶为脂肪酶或磷脂酶，更优选为微生物脂肪酶。在一些实施方案中，上述微生物脂肪酶为来自以下微生物的脂肪酶：米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、南极假丝酵母(Candidaantarctic)、黑曲霉菌(Aspergillusniger)、褶皱假丝酵母(Candidarugosa)、假单胞菌属(Pseudononassp.)等。在一优选的实施方案中，本发明所述的脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase,RML)。
本发明的固定化脂酶具有下述至少一种特性：更好的热稳定性、更高的有机溶剂耐受性，更优异的储藏稳定性和可重复利用性，有利于酶法生物加工在工业化中的应用，例如大量制备生物柴油。
第二方面，本申请提供了固定化脂酶的制备方法，其包括将携带分子标签的脂酶与磁性颗粒接触，从而得到固定于所述磁性颗粒上的脂酶，其中所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。
本发明通过金属离子(如Co2+)修饰的磁性颗粒借助His-tag和Co2+之间的螯合作用，一步法特异纯化并固定化脂酶。这种方式既实现了固定化酶的高纯度(专一性)，又能方便快捷地利用磁分离回收酶(便捷性)，且结合力(亲和作用)比普通物理吸附法更为牢固(高稳定性)。
在本发明的一些实施方案中，将脂酶与磁性颗粒接触10-30分钟，优选为约20分钟。在一些实施方案中，上述脂酶与磁性颗粒的比例为1-5mg脂酶/mg磁性颗粒。在优选的实施方案中，所述脂酶与磁性颗粒在pH为7-10、更优选为约8的条件下进行接触。
在一些实施方案中，本申请所用的脂酶溶液为细胞裂解得到的粗酶溶液。在优选的实施方案中，上述脂酶为脂肪酶或磷脂酶，更优选为微生物脂肪酶。在一些实施方案中，上述微生物脂肪酶为来自以下微生物的脂肪酶：米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、南极假丝酵母(Candidaantarctic)、黑曲霉菌(Aspergillusniger)、褶皱假丝酵母(Candidarugosa)、假单胞菌属(Pseudononassp.)等。在一优选的实施方案中，本发明所述的脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase,RML)。
本发明人将分子标签引入脂酶，利用磁性颗粒一步法完成了脂酶的纯化和固定化。此外，固定化后的酶还具有下述至少一种特性：更好的热稳定性、更高的有机溶剂耐受性，更优异的储藏稳定性和可重复利用性，有利于酶法生物加工在工业化中的应用，例如大量制备生物柴油。
第三方面，本申请还提供了由上述方法制备的固定化脂酶，其中所述脂酶携带分子标签，所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。优选地，所述固定化脂酶为固定于磁性颗粒的脂肪酶。
在优选的实施方案中，不仅本申请的固定化酶能重复利用，连所用的基材(磁性颗粒)本身都能重复利用。
第四方面，本申请提供了本发明的固定化脂酶在生产生物柴油中的应用。
本申请的固定化酶具有更优异的有机溶剂(甲醇)耐受性，利于脂肪酶在生物柴油(高级脂肪酸与甲醇酯化后的产物)制备中的应用。
第五方面，本申请提供了磁性颗粒的用途。
具体地，提供了磁性颗粒在制备固定化脂酶中的用途，所述磁性颗粒用于纯化和固定化脂肪酶。在优选的实施方案中，所述脂酶携带分子标签，所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。
另外，本申请还提供了磁性颗粒在回收固定化脂酶中的用途，其中所述磁性颗粒作为固定化脂酶的载体，提供磁响应性，便于固定化脂酶的回收和重新利用。
附图简要说明
图1显示了固定化脂肪酶RML经洗涤和洗脱后的样品的凝胶电泳图，其中从左到右，各泳道加载的样品分别为泳道1：菌体破碎离心后的上清液(即粗酶液)；泳道2：粗酶液与磁珠孵育后的上清液；泳道3-5：洗涤孵育后的磁珠得到的上清液，泳道3-5分别对应第1、2、3次洗涤得到的上清液；泳道6：第一次洗脱得到的洗脱液样品，泳道7为：第二次洗脱得到的洗脱液样品。
图2显示了固定化RML在不同温度下的相对酶活力，以检测其与游离RML相比的最适温度(图2A)和热稳定性(图2B)。
图3显示了固定化RML和游离RML在不同浓度甲醇存在下的剩余酶活力，其中横坐标为甲醇浓度，纵坐标为剩余酶活力。
图4显示了固定化RML和游离RML在储存不同时间后剩余的酶活力。
图5显示了固定化RML的磁响应性。A图显示未置于磁场的固定化RML悬浮液的分布状态，B图是固定化RML悬浮液置于磁场后的分布状态。
图6显示了(△)回收的固定化RML的酶活力，以及(□)由重生磁珠重新吸附RML后得到的固定化RML的酶活力，其中纵坐标为相对剩余酶活力，横坐标为重复利用次数。
图7显示不同尺寸的磁性颗粒的磁响应性，左侧样品的磁性颗粒直径为1μm，右侧样品的磁性颗粒直径为10nm。
图8A显示了固定化磷脂酶PLC(CLOPLC8(GenBank:D49969.1)经洗涤和洗脱后的样品的凝胶电泳图，其中从左到右，各泳道加载的样品分别为泳道1：菌体破碎离心后的上清液(即粗酶液)；泳道2：粗酶液与磁珠孵育后的上清液；泳道3-6：洗涤孵育后的磁珠得到的上清液，泳道3-6分别对应第1、2、3、4次洗涤得到的上清液；泳道7：洗脱液样品；图8B和图8C显示了固定化磷脂酶在不同温度下的相对酶活力，以检测其与游离磷脂酶相比的最适温度(图8B)和热稳定性(图8C)；图8D显示的是磷脂酶活力测定的标准曲线。
具体实施方式
一方面，本申请提供了一种固定化脂酶，其包括脂酶和作为固定载体的磁性颗粒。
在本发明的一些实施方案中，所述脂酶携带分子标签，所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。
本文所用的“分子标签”是指能够被磁性颗粒识别并与其结合的生物分子片段，例如肽或核酸片段。通常所述分子标签为异源引入的片段。在一实施方案中，所述分子标签为短肽片段。在优选的实施方案中，上述脂酶所携带的分子标签为添加至脂酶末端的组氨酸分子标签(His-tag)。
本文所用的“磁性颗粒”为具有磁性、能磁化或具有顺磁性、并且适于进行磁性分离的颗粒。本文所用的“磁性颗粒”、“磁体”以及“磁性基材”可以互换使用。在优选的实施方案中，所述磁性颗粒为磁珠。
在一些实施方案中，本发明的磁性颗粒包含磁核以及表面被修饰的多聚物外壳。在优选的实施方案中，磁性颗粒表面由金属离子修饰，所述金属离子能够与上述分子标签结合。在进一步优选的实施方案中，磁性颗粒表面的金属离子为钴、镍、铜、锌、铁等。更优选地，所述金属离子为Co2+。
磁性颗粒的磁核可以由任何适合的磁性材料组成。例如，所述磁核可以选自铁氧体、金属、金属合金、铁氧化物、二氧化铬等。在优选的实施方案中，所述磁核为铁氧化物，优选为Fe3O4，更优选为超顺磁性γFe3O4。在具体的实施方案中，所述磁性颗粒为Dynabeads磁珠(Sigma，目录号为10103D)。
在一些实施方案中，本发明所用的磁性颗粒的直径为0.1-10μm，优选为约1-5μm。本发明可利用磁场快速回收固定化酶(例如，仅需30秒)，而无需长时间高速离心等分离步骤，可非常方便地分离回收固定化酶，具有便捷性。
此外，本发明所用的磁性颗粒具有的良好磁响应性不仅使得固定化酶能重复利用，连所用的基材(磁珠)本身都能利用磁场作用方便地回收以便重复利用。
在优选的实施方案中，本发明固定化的作用力是基于磁珠表面的金属离子(例如Co2+)与脂酶上分子标签(例如His-tag)之间的螯合亲和作用。这种固定方式与普通的包埋、吸附固定化酶技术相比，具有更高的牢固度和更好的稳定性。
本发明所用的“脂酶”指催化脂类中的酯键水解反应的一类酶，其广泛存在于生物体中。由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物统称为脂类，包括油脂和类脂，后者进一步包括磷脂、糖脂等。
在一些实施方案中，本发明的脂酶为脂肪酶或磷脂酶。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽等；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。
因此，优选地，本发明所用的脂肪酶来自产生脂肪酶的微生物。例如，所述微生物可以是米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、德氏根霉(Rhizopusdelemar)、米根霉(Rhizopusoryzae)、米曲霉(Aspergillusoryzea)、南极假丝酵母(Candidaantarctic)、黑曲霉菌(Aspergillusniger)、褶皱假丝酵母(Candidarugosa)、柱状假丝酵母(Candidacylindracea)和假单胞菌属(Pseudononassp.)等。在一优选的实施方案中，本发明所用的脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶(RML)。
与直接使用游离酶的技术相比，本发明的固定化酶具有以下至少一种优点：1)更高的最适温度，更好的热稳定性；2)更优异的有机溶剂(甲醇)耐受性；3)更优异的储藏稳定性；4)更好的重复利用性以及5)反应后的分离便捷性等。
另一方面，本申请提供了固定化脂酶的制备方法，其包括将携带分子标签的脂酶溶液与磁性颗粒接触，从而得到固定于所述磁性颗粒上的脂酶，其中所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。
在一些实施方案中，脂酶溶液与磁性颗粒的接触时间为10-30分钟，优选为约20分钟。在一些实施方案中，上述脂酶与磁性颗粒的比例为1-5mg脂酶/mg磁性颗粒。在一些具体的实施方案中，得到的固定化脂酶的吸附量约为5-50μg酶/mg磁性颗粒，优选为10-30μg酶/mg磁性颗粒，例如为12.5μg酶/mg磁性颗粒。
在一些实施方案中，溶解脂酶的缓冲液包括但不限于Tris-Cl缓冲液、磷酸缓冲液、RIPA缓冲液等。在优选的实施方案中，所述脂酶溶液为裂解包含脂酶的细胞而得到的粗酶溶液。在某些实施方案中，将磁性颗粒直接加入粗酶溶液中与脂酶进行结合。在优选的实施方案中，所述脂酶与磁性颗粒在pH为7-10，更优选pH为约8的条件下进行结合。
在一些实施方案中，本申请所用的脂酶溶液为细胞裂解得到的粗酶溶液。在优选的实施方案中，上述脂酶为脂肪酶或磷脂酶，更优选为微生物脂肪酶。在一些实施方案中，上述微生物脂肪酶为来自以下微生物的脂肪酶：米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、南极假丝酵母(Candidaantarctic)、黑曲霉菌(Aspergillusniger)、褶皱假丝酵母(Candidarugosa)、假单胞菌属(Pseudononassp.)等。在一优选的实施方案中，本发明所述的脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase,RML)。
在一示例性的实施方案中，固定化脂酶的制备方法包括如下步骤：
(1)将六个组氨酸多肽组成的标签(His-tag)引入到表达载体pET30a；
(2)将脂肪酶RML序列重组到该pET30a表达载体上；
(3)将重组表达载体转化至大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21中；
(4)将大肠杆菌细胞在LB培养基中于16℃下培养，以150转/分(rpm)的转速培养过夜；
(5)收集菌体，并悬浮在Tris-Cl(pH8.0)缓冲液中，然后用超声波破碎菌体；
(6)将菌体破碎液以10000rpm、15min离心，离心后得到的上清液与Dynabeads共孵育20min；以及
(7)用缓冲液简单洗涤后，即得磁珠固定化的脂肪酶。
任选地，用棕榈酸对硝基苯酯(p-nitrophenylpalmitate,pNPP)法对获得的固定化酶的热稳定性、有机溶剂耐受性和储藏稳定性等特性进行检测。
现有技术中在制备固定化酶时需要首先购买或制备已经纯化的酶粉或未经纯化的粗酶制剂。与之相比，本发明借助脂酶的分子标签(例如组氨酸分子标签)和磁性颗粒表面的修饰物质(例如金属离子)的结合作用能够一步法直接从粗酶液中完成脂酶的纯化和固定化，即保证了固定化酶的高纯度，又节约了时间和成本。
再一方面，本申请提供了使用上述方法制备的固定化脂酶，优选固定化脂肪酶。
与直接使用游离酶的技术相比，通过本发明方法制备的固定化酶具有以下至少一种优点：1)更高的最适温度，更好的热稳定性；2)更优异的有机溶剂(甲醇)耐受性；3)更优异的储藏稳定性；4)更好的重复利用性以及5)反应后的分离便捷性等。
再一方面，本申请提供了本发明的固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用。
如上所述，本申请的固定化脂肪酶具有优异的有机溶剂(甲醇)耐受性和良好的重复利用性，有利于脂肪酶在生物柴油(高级脂肪酸与甲醇酯化后的产物)制备中的应用，例如用于生物柴油的大规模生产。
其他方面，还提供了磁性颗粒在制备或回收固定化脂酶中的用途。
具体地，本申请提供了磁性颗粒在制备固定化脂酶中的用途。所述磁性颗粒用于纯化和固定化脂肪酶。在优选的实施方案中，所述脂酶携带分子标签，所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。
另外，本申请还提供了磁性颗粒在回收固定化脂酶中的用途，其中所述磁性颗粒作为固定化脂酶的载体，提供磁响应性，便于固定化脂酶的回收和重新利用。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域技术人员所公知的方法和技术。
实施例
除特别指明外，下述实施例中使用的试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
在下述实施例中，脂肪酶活力的测定方法如下所述。
采用硝基苯棕榈酸酯(pNPP)法测定脂肪酶活力：
以对硝基苯棕榈酸酯(pNPP)为底物，以单位体积的酶液在单位时间内酶解产生对硝基苯酚(pNP)的生成量进行酶活力的计算。具体方法如下：预先配置底物和缓冲液，底物：6mg/mLpNPP(异丙醇溶解)，缓冲液：0.05MTris(pH8.0，0.1％阿拉伯胶)。将底物和缓冲液以1:9(v/v)配成反应混合液。取两个2mL离心管，分别为对照管和样品管。分别添加400μL反应混合液至两离心管，在合适的反应温度(例如35℃)预温浴5min。向样品管中加入一定量的稀释酶液，混合均匀后，继续温浴15min。加入1.5mL乙醇至上述两离心管终止反应，并添加同样量的稀释酶液至对照管。以12000rpm离心2min，取上清，测405nm处的吸光值。
酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放1μmol的pNP所需的酶量。根据标准曲线所得酶活力计算公式为：A＝-([A1-A0]×0.7885-0.0118)×V1×n/(V2×t)。A：样品酶活(U/mL)，A1：样品酶液的OD405，A0：对照酶液的OD405，V1：总反应液的体积(mL)，n：酶液的稀释倍数，V2：酶液的体积(mL)，t：反应时间(min)。
在本发明的下述实施例中，使用的CIAP为牛小肠碱性磷酸酶，购自NewEnglandBiolabs(NEB)公司)。
实施例1磁珠一步法纯化和固定化脂肪酶RML
将生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称“上海生工”)合成的含His-tag(由6个组氨酸组成)的RML(RML序列参见UniProtKBaccessionP19515,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/417256)基因载体(PET30a)，转入大肠杆菌BL21感受态细胞(购自上海生工)，并将其在含卡那霉素(Kan)50μg/mL的LB固体培养基中于37℃培养过夜，随后挑单菌落转入5mLLB培养基(酵母粉5％、蛋白胨10％、NaCl5％)中。按厂商提供的方法，使用Qigen质粒提取试剂盒提取质粒，委托上海生工测序。测序正确的克隆重新转入50mLLB培养基中，培养至OD600值为0.6-0.8时，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，终浓度为1mM)进行诱导，继续在16℃下以150转/分(rpm)的转速过夜培养，而后分装到50mL离心管中，12000rpm/min离心弃去上清液，收集菌体。将收集的菌体加入裂解液(20mMTris-Cl、300mMNaCl、pH8.0)重新悬浮，冰浴破碎20min后，离心获得裂解上清液。
接下来使用DynabeadsHis-TagIsolation&Pulldown试剂盒(Sigma，目录号为10103D)进行脂酶的固定。将100μlDynabeads磁珠(含2mg磁珠，磁珠直径1μm)悬浮液加入离心管中，而后加入200μl裂解液浸泡10min，将离心管插入多功能磁分离器(上海奥润微纳新材料科技有限公司，产品编码MS-12)至溶液澄清，弃上清，得到磁珠。在磁珠中加入200μl含10mg脂酶的菌体裂解上清液(脂酶含量通过购自上海生工的Bradford试剂盒测定)，室温振荡孵育20min，而后加入200μlTris-Cl缓冲液(20mM,pH8.0)进行洗涤，将离心管涡旋振荡后，插入多功能磁分离器上进行分离，收集沉淀，按上述方法，使用Tris-Cl缓冲液重复洗涤三次，最终得到被磁珠固定的脂肪酶RML。
为了检验固定化磁性基材上酶的纯度，我们还对部分磁珠固定化脂酶样品进行洗脱，洗脱液是在上述裂解液中加入500mM咪唑得到的。将上述被磁珠固定的脂肪酶RML加入100μL洗脱液中重新悬浮，震荡，将离心管插入多功能磁分离器上进行分离，收集上清液，得到含纯酶的洗脱液样品，将该样品再按以上步骤重复洗脱一次。
取40μL上述洗涤所得上清样品或洗脱所得上清样品分别与5×上样缓冲液(购自上海生工)混匀，沸水煮3-5分钟后备用。将制备的样品利用聚丙烯胺凝胶电泳(10％SDS-PAGE,120V电压,2小时)检测，结果如图1所示。从图1中可以看出，加入His-tag的脂肪酶RML能够被磁珠一步法纯化和固定化，其中图1中的泳道1为菌体破碎离心后的上清液(即粗酶液)；泳道2为粗酶液与磁珠孵育后的上清液；泳道3-5为洗涤孵育后的磁珠得到的上清液，泳道3-5分别对应第1、2、3次洗涤得到的上清液；泳道6为第一次洗脱得到的洗脱液样品，泳道7为第二次洗脱得到的洗脱液样品。
实施例2固定化脂肪酶最适温度和热稳定性检测
按照与实施例1相同的方法，通过将5mg脂酶与2mg磁珠接触(即两者比例为2.5:1)制备得到磁珠固定化酶，，将其进行洗脱后，通过购自上海生工的Bradford试剂盒测得其酶含量为25μg，换算成吸附量约为12.5μg酶/mg磁珠。利用Tris-Cl缓冲液(20mMTris-Cl、300mMNaCl、pH8.0)将上述固定化RML和游离RML稀释至相同浓度(5μg/mL)。分别在20,30,40,50,55,60,70和80℃下测定两种RML酶的活力来检测其催化的最适温度，以及分别在45,55,65,75和85℃下测定两种RML酶的活力来检测其热稳定性(方法采用上述pNPP法，以所得最高酶活力为100％计，计算其他温度下的酶活力相对最高酶活力的比值，从而确定相对酶活)，数据结果如图2所示。从图2的结果可以看出，固定化酶的最适温度相对游离酶有大约5℃的升高，同时热稳定性也有较明显的改善。
本实施例以及其他实施例中使用的游离RML的制备方法与实施例1中所述的RML生产方法相同，但纯化采用购自Qigen公司的Ni柱试剂盒(货号30725)进行，具体操作请参照厂商提供的操作步骤。
实施例3固定化脂肪酶的甲醇耐受性检测
将用与实施例1相同的方法制备的固定化RML(通过将2mg脂酶与2mg磁珠接触得到；经计算其吸附量为12μg酶/mg磁珠)和游离RML用Tris-Cl缓冲液(20mMTris-Cl、300mMNaCl、pH8.0)调配至2μg/mL，分别与不同浓度(0-100％)的甲醇等体积混合，于30℃、在转速为160rpm的摇床上孵育30min。利用上述pNPP法测定其相对酶活力(以所得最高酶活力为100％计，计算其他甲醇浓度下的酶活力与最高酶活力的比值，作为相对酶活)，数据如图3所示。从图3可以看出，相比游离RML，固定化RML具有更高的剩余相对酶活力，这表明本发明的固定化酶具有更强的甲醇耐受性，有利于其在生物柴油领域的应用。
实施例4固定化脂肪酶储藏稳定性检测
将用与实施例1相同的方法制备的固定化RML(通过将8mg脂酶与2mg磁珠接触得到，即两者比例为4:1；经计算其吸附量为15μg酶/mg磁珠)和游离RML以0.5mg/mL的浓度分散至Tris-Cl缓冲液(20mMTris-Cl、300mMNaCl、pH8.0)中，然后于4℃保存，在不同时间取样测定其剩余酶活力(以所得最高酶活力为100％计，计算其他储藏时间下的酶活力与最高酶活力的比值，作为相对酶活)。结果如图4所示，我们可以看出，固定化脂肪酶在10天的保存期后仍然有约70％的剩余酶活力，而游离脂肪酶则仅剩余极低的活性，这表明固定于磁珠的脂肪酶具有更好的储存稳定性。
实施例5固定化脂肪酶的磁响应性
将实施例1制备的固定化RML悬浮于Tris-Cl缓冲液(20mMTris-Cl、300mMNaCl、pH8.0)中得到固定化RML悬浮液，如图5A所示。在外加磁板，即多功能磁分离器(上海奥润微纳新材料科技有限公司，产品编码MS-12)提供磁场作用下，悬浮液中的固定化酶在30秒即可被回收完毕，如图5B所示。相对于使用完毕后需要长时间离心才能去除的游离RML而言，固定化脂肪酶所具有的磁响应性使其回收方便快捷、省时省力。
实施例6固定化脂肪酶和固定化颗粒基材的可重复利用性检测
将实施例1制备的固定化RML在检测酶活力后利用图5的磁场分离方式收集，继续检测其活性(以新制备固定化酶样品为最高酶活(100％)，计算重复利用后的酶活力与最高酶活的比值，作为相对酶活)，以相对剩余酶活做纵坐标，重复利用次数为横坐标。结果如图6(△)所示，可以看到固定化RML重复利用5次后，仍然剩余60％左右的酶活。
接下来我们检测了固定化基材磁珠本身是否可以重复利用。首先我们通过简单处理使磁珠重生，重生步骤如下：
1)用5倍净磁珠体积的0.1MEDTA(pH8.0，含0.5MNaCl)重悬磁珠，室温摇动1分钟后，插入多功能磁分离器(上海奥润微纳新材料科技有限公司)至溶液澄清，弃上清；
2)用5倍净磁珠体积的2MNaCl重悬磁珠，室温摇动1分钟后，插入磁座，即上述多功能磁分离器至溶液澄清，弃上清；
3)用5倍净磁珠体积的1MNaOH重悬磁珠，室温摇动5分钟后，插入磁座至溶液澄清，弃上清；
4)重复步骤3)两次；
5)用5倍净磁珠体积的70％乙醇重悬磁珠，室温摇动1分钟后，插入磁座至溶液澄清，弃上清；
6)用5倍净磁珠体积的超滤水重悬磁珠，插入磁座至溶液澄清，弃上清；
7)重复步骤6)一次；
8)用4倍净磁珠体积的1MCoCl2重悬磁珠，室温摇动5分钟，储存于2-8℃备用。
如图6(□)所示，经过5次循环重复利用(即吸附、测吸附量、重生、吸附、测吸附量)，重生磁珠的酶吸附量仅降低了十几个百分点，这表明不仅固定化酶能重复利用，连固定化基材-磁珠本身也能重复利用多次。
实施例7具有不同尺寸磁核的磁性颗粒的磁响应性
我们检测了直径不同的磁性颗粒的磁响应性差异。图7左侧样品的磁性颗粒直径为1μm(10nm磁核的聚集体)，图7右侧样品的磁性颗粒直径为10nm。本实施例所用样品购自上海奥润微纳新材料科技有限公司。从图7可以看到，小颗粒磁核的磁珠很难被磁分离，不利于固定化酶的收集；而1-5μm直径的磁珠具有良好的磁响应性，这表明直径约为1-5μm的磁珠在固定化酶领域应用的可行性更高。
实施例8一步法纯化和固定化磷脂酶PLC及其特性研究
我们还检测了Dynabeads磁珠对磷脂酶PLC(CLOPLC8(GenBank:D49969.1)的纯化和固定化作用。纯化和固定化步骤与实施例1基本相同，只是把脂肪酶RML更换成了磷脂酶PLC，洗涤四次(前两次用Tris-Cl缓冲液(20mM,pH8.0)洗涤，第3次用含20mM咪唑的Tris-Cl缓冲液洗涤，第4次用含50mM咪唑的Tris-Cl缓冲液洗涤)，以及洗脱一次(洗脱液是在实施例1所述裂解液中加入300mM咪唑得到的)，结果显示于图8A中，各泳道对应的样品如下所示。泳道1为菌体破碎离心后的上清液(即粗酶液)；泳道2为粗酶液与磁珠孵育后的上清液；泳道3-6为洗涤孵育后的磁珠得到的上清液，泳道3-6分别对应第1、2、3、4次洗涤得到的上清液；泳道7为洗脱液样品。图8a的结果表明携带His-tag的磷脂酶同样可以被磁珠一步法纯化和固定化。
然后我们对固定化磷脂酶的最适温度和热稳定性进行了检测，结果如图8B和C所示，其中磷脂酶活力的测定方案如下所述：
首先，按表1配制试剂并依次加样，置37℃下反应30分钟。
表1
No 成分 母液浓度 反应终浓度 体积(μl)
1 混合磷脂 1％(w/v) 0.5％(w/v) 100
2 Tris-Cl缓冲液，pH 7.5 500mM 25mM 20
3 CaCl2 100mM 5mM 10
4 酶液 20
5 H2O 50
总计 200
然后，取上述200μL反应液置于新离心管中，加入200μL氯仿，混匀20秒，以12000rpm离心1分钟。取离心上清液80μL至新离心管中，根据表2所示的顺序和体积依次添加试剂并混匀，在37℃下反应30分钟。然后在上述反应体系中，继续按照表3所示顺序和体积添加其他试剂，在37℃下反应10分钟。取上述反应体系中的反应液于700nm处检测吸光度，空白对照采用灭活的酶液进行平行检测，利用标准曲线计算酶活力。标准曲线用已知活力的磷脂酶C(购自帝斯曼)作为标准品，重复上述步骤获得的标准曲线如图8D所示。
表2
No 成分 母液浓度 工作液浓度 体积(μl)
1 离心上清 80
2 Tris-Cl缓冲液，pH9.0 1M 50mM 10
3 MgCl2 500mM 10mM 4
4 CIAP 0.5U/μl 10U/ml 4
5 H2O 102
总计 200
表3
No 成分 母液浓度 工作液浓度 体积(μl)
1 CIAP酶切反应物 200
2 H2O 740
3 抗坏血酸 10％(w/v) 0.2％(w/v) 20
4 钼酸铵 2.5％(w/v) 0.1％(w/v) 40
总计 1000
从图8B和8C可以看出，与游离的磷脂酶(与游离RML的制备和纯化方法相同)相比，固定于磁珠上的磷脂酶具有更好的热稳定性，这表明本发明的方法可广泛地应用于其他种类酶的固定化。
可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。

Claims (10)

1.固定化脂酶，其包括脂酶和作为固定载体的磁性颗粒。
2.如权利要求1所述的固定化脂酶，其中所述脂酶携带分子标签，所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质，优选地，所述分子标签为组氨酸标签。
3.如权利要求1或2所述的固定化脂酶，其中与所述分子标签结合的物质为金属离子，所述金属离子选自钴、镍、铜、锌和铁，优选地，所述金属离子为Co2+。
4.如前述权利要求任一项所述的固定化脂酶，其中所述磁性颗粒的直径为0.1-10μm，优选为约1-5μm，和/或，所述磁性颗粒的磁核选自铁氧体、金属、金属合金、铁氧化物、二氧化铬以及它们的组合物，优选地，所述磁核为铁氧化物，更优选为γFe3O4。
5.如前述权利要求任一项所述的固定化脂酶，其中所述脂酶为脂肪酶或磷脂酶，优选为微生物脂肪酶。
6.权利要求1-5中任一项所述的固定化脂酶的制备方法，其包括将携带分子标签的脂酶与磁性颗粒接触，从而得到固定于所述磁性颗粒上的脂酶，其中所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质。
7.如前述权利要求6所述的方法，其中所述脂酶与所述磁性颗粒的接触时间为10-30分钟；优选地所述脂酶与所述磁性颗粒的比例为1-5mg脂酶/mg磁性颗粒；优选地所述脂酶与所述磁性颗粒在pH为7-10的条件下进行接触；以及优选地包含所述脂酶的溶液为细胞裂解得到的粗酶溶液。
8.由权利要求6或7所述的方法制备的固定化脂酶，优选为固定化脂肪酶。
9.权利要求1-5中任一项所述的固定化脂酶或权利要求8所述的固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用。
10.磁性颗粒在制备固定化脂酶和/或回收固定化脂酶中的用途，优选地，所述脂酶携带分子标签，所述磁性颗粒的表面包含能够与所述分子标签结合的物质，和/或，所述磁性颗粒作为固定化脂酶的载体。
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