CN102061293A - 磁性固定化磷脂酶a1的制备方法及用磁性固定化磷脂酶a1精炼毛油的方法 - Google Patents

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江连洲
朱秀清
王玉
于坤弘
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孙博
刘晶
周晓丹
王妍
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磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，涉及一种固定化磷脂酶A1的制备方法及用固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。本发明为了解决现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收复杂，活力回收率低，及目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的问题。制备及精炼毛油的方法：一、制备磁性固定化磷脂酶A1；二、将毛油加热，加入柠檬酸溶液；三、冷却，调节pH值，再加入磁性固定化磷脂酶A1，搅拌，分离磁性固定化磷脂酶A1，即完成磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及精炼毛油的方法。本发明制备的磁性固定化磷脂酶A1的回收率达到85％以上，使毛油的磷含量降到7～10mg/kg。应用于油脂脱胶领域。

Description

磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法
技术领域
本发明涉及一种固定化磷脂酶A1的制备方法及用固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。
背景技术
固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点。固定化酶在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学领域广泛应用。使用现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收困难，活力回收率低(一股为40％～60％)的问题。
植物油脂中的胶质主要是磷脂混合物，脱胶是植物油精炼中非常重要的工序，脱胶效果好坏将直接影响精炼效率和产品质量；若脱胶不完全，则会加重脱色负担，影响油脂质量和精炼经济效益。植物油磷脂可分为水化磷脂和非水化磷脂，水化磷脂具有亲水性，可通过水化方法脱除，而非水化磷脂具有明显的疏水性，在水化脱胶中较难与水结合，其存在会给油脂精炼带来很多麻烦。
现已提出用游离酶法水解脱除非水化磷脂，但在实际生产中发现游离磷脂酶对反应环境敏感，易变性失活，反应条件不易控制。因此将酶进行固定化，可提高它的稳定性和利用效率。目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有方法制备固定化磷脂酶A1存在固定化酶分离回收复杂，活力回收率低，及目前尚没有将磁性固定化酶用于精炼毛油的问题，而提供一种磁性固定化磷脂酶A1的制备方法及用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法。
本发明的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行：一、制备Fe3O4纳米粒子；二、制备Fe3O4/SiOx复合粒子；三、制备Fe3O4/SiOx-APTS载体；四、制备磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子；五、将磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子加入到0.1mol/L且pH值为7～7.2的磷酸缓冲液中浸泡24～26h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0.1mol/L且pH值为5.5～9.5的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0.2％的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到12～88mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在10～50℃下用磁力搅拌器搅拌2～9h，搅拌速度为10～12r/min，然后进行磁分离，用0.1mol/L且pH值为7～7.2的磷酸缓冲液冲洗2～3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1；其中步骤五中每克磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子加入到48～50mL磷酸缓冲液中。
利用上述的磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步骤进行：一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至70～90℃，加入质量浓度为40％～50％的柠檬酸溶液，混匀，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0.1％～2％，在搅拌速度为400～600r/min的条件下反应10～30min；二、然后冷却至30～70℃，加入质量浓度为3％～5％NaOH溶液调节pH值至3～9，再加入磁性固定化磷脂酶A1，每千克除去水化磷脂的毛油加入0.04～0.16g的磁性固定化磷脂酶A1，于搅拌速度为40～120r/min下反应1～6h，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。
本发明的优点：
1、本发明的方法合成了磁性高分子微球载体，赋予了固定化磷脂酶A1较强的磁场响应性，从而可以借助外部磁场从反应体系中快速简便地富集、分离和回收固定化磷脂酶A1，可有效地提高酶的活力回收率，使回收率达到85％以上，进而提高酶的使用效率；
2、磁性固定化磷脂酶A1在50℃下反应120分钟后，固定化磷脂酶A1的活力保留值为初始活力的80％～85％；经过6次使用后固定化磷脂酶A1的活力保留值为初始活力的83％～85％，固定化磷脂酶A1的热稳定性和重复使用性都有所提高；
3、将磁性固定化磷脂酶A1用于精炼毛油，使磷含量降到7～10mg/kg；
4、重复脱胶4次以后，磁性固定化磷脂酶A1的活力仍保留80％～85％，提高了酶的重复利用性，降低了生产成本；
5、可以利用外部磁场控制磁性固定化磷脂酶A1的运动，从而代替传统的机械搅拌方式，提高磁性固定化磷脂酶A1的催化效率，适合大规模连续化操作。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一、本实施方式的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行：一、制备Fe3O4纳米粒子；二、制备Fe3O4/SiOx复合粒子；三、制备Fe3O4/SiOx-APTS载体；四、制备磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子；五、将磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子加入到0.1mol/L且pH值为7～7.2的磷酸缓冲液中浸泡24～26h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0.1mol/L且pH值为5.5～9.5的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0.2％的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到12～88mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在10～50℃下用磁力搅拌器搅拌2～9h，搅拌速度为10～12r/min，然后进行磁分离，用0.1mol/L且pH值为7～7.2的磷酸缓冲液冲洗2～3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1；其中步骤五中每克磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子加入到48～50mL磷酸缓冲液中。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中制备Fe3O4纳米粒子的具体方法为：a、将1mol/L的FeCl2溶液和1.75mol/L的FeCl3溶液混合，使Fe2+与Fe3+的摩尔比为1∶1.5，在氮气保护下，于水浴60℃搅拌，搅拌速度为10～40r/min，同时滴加质量浓度为25％～28％的氨水调节pH值至10，然后升温至80℃保持lh，之后冷却至室温，得产物A；b、用永久磁体将产物A分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，于室温下真空干燥24h，即得到Fe3O4纳米粒子。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中制备Fe3O4/SiOx复合粒子的具体方法为：a、称取2gFe3O4纳米粒子，加入160mL乙醇、40mL水和5mL质量浓度为25％的氨水，用20～40KHz的超声波分散lh后，进行搅拌，搅拌速度为10～50r/min，同时滴加10～50mL的正硅酸乙酯，反应12h后，得产物B；b、用永久磁体将产物B分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，然后用lmol/L的盐酸将产物B覆盖，浸泡12h，磁分离后，用蒸馏水洗至pH值为中性，室温下真空干燥24h，即得到Fe3O4/SiOx复合粒子。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中制备Fe3O4/SiOx-APTS载体的具体方法为：a、称取1g Fe3O4/SiOx复合粒子，加入60mL无水乙醇，用20～40KHz的超声波分散1h，加入6mLNH3·H2O，再用超声波分散10min，在氮气保护下，于搅拌速度为20r/min的条件下滴加4mL γ-氨丙基三乙氧基硅烷，在水浴50℃条件下保持8h，自然冷却至室温，得产物C；b、用永久磁体将产物C分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，再用无水乙醇洗涤3次，每次10min，于室温下真空干燥24h，得到Fe3O4/SiOx-APTS载体。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中制备磁性Fe304/SiOx-g-P(GMA)复合粒子的具体方法为：a、称取2.0g Fe3O4/SiOx-APTS载体，加入30mL二甲基甲酰胺中，用20～40KHz的超声波分散1h，向其中加入5～20mL的三乙胺，在冰浴冷却下向其中滴加含有3mL氯乙酰氯的二甲基甲酰胺溶液5mL，滴加时间不超过0.5h；b、加热回流，反应10h，然后用无水乙醇于20KHz超声波下洗涤，真空干燥至恒重，得产物D；c、称取0.5g产物D，加入20mL二甲基甲酰胺溶液，二甲基甲酰胺与水的体积比为1∶1，用20～40KHz的超声分散30min，通入氮气0.5h，然后加入50mL甲基丙烯酸缩水甘油酯、1mL联吡啶、0.5gCuCl和0.1gCuCl2，室温下搅拌，反应12h，得产物E；d、用永久磁体将产物E从溶液中分离，并用丙酮抽提48h，最后将产物E于室温下真空干燥24h，得到磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤六中将磷脂酶A1加入0.1mol/L且pH值为7～8的磷酸缓冲液中。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤六中将浸泡后的载体加入到25～62.5mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤六中在20～40℃下用磁力搅拌器搅拌4～7h。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九、本实施方式的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行：一、制备Fe3O4纳米粒子；二、制备Fe3O4/SiOx复合粒子；三、制备Fe3O4/SiOx-APTS载体；四、制备磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子；五、将1g磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子加入到50mL的0.1mol/L且pH值为7的磷酸缓冲液中浸泡24h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0.1mol/L且pH值7的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0.2％的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到62.5mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在30℃下用磁力搅拌器搅拌5h，搅拌速度为10r/min，然后进行磁分离，用0.1mol/L且pH值为7的磷酸缓冲液冲洗3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1。
本实施方式制得的磁性固定化磷脂酶A1的酶蛋白负载量为98.4mg/g固定化酶，磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合载体的粒径为90～100nm，其比饱和磁化强度为19.6emu/g载体，无剩余磁和矫顽力。
具体实施方式十：本实施方式用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步骤进行：一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至70～90℃，加入质量浓度为40％～50％的柠檬酸溶液，混匀，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0.1％～2％，在搅拌速度为400～600r/min的条件下反应10～30min；二、然后冷却至30～70℃，加入质量浓度为3％～5％NaOH溶液调节pH值至3～9，再加入磁性固定化磷脂酶A1，每千克除去水化磷脂的毛油加入0.04～0.16g的磁性固定化磷脂酶A1，于搅拌速度为40～120r/min下反应1～6h，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式十不同的是：步骤一中将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至80℃。其它与具体实施方式十相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十或十一不同的是：步骤一中加入质量浓度为45％的柠檬酸溶液。其它与具体实施方式十或十一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十至十二之一不同的是：步骤一中柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0.1％。其它与具体实施方式十至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十至十三之一不同的是：步骤一中柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0.5％～1.5％。其它与具体实施方式十至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十至十四之一不同的是：步骤一中在搅拌速度为500r/min的条件下反应20min。其它与具体实施方式十至十四之一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十至十五之一不同的是：步骤二中然后冷却至40～60℃。其它与具体实施方式十至十五之一相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十至十六之一不同的是：步骤二中然后冷却至50℃。其它与具体实施方式十至十六之一相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十至十七之一不同的是：步骤二中加入质量浓度为4％NaOH溶液调节pH值至5～8。其它与具体实施方式十至十七之一相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十至十八之一不同的是：步骤二中每千克除去水化磷脂的毛油加入0.08～0.12g的磁性固定化磷脂酶A1。其它与具体实施方式十至十八之一相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十至十九之一不同的是：步骤二中每千克除去水化磷脂的毛油加入0.09～0.11g的磁性固定化磷脂酶A1。其它与具体实施方式十至十九之一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式十至二十之一之一不同的是：步骤二中于搅拌速度为60～100r/min下反应2～5h。其它与具体实施方式十至二十之一相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式十至二十一之一不同的是：步骤二中于搅拌速度为70～90r/min下反应3～4h。其它与具体实施方式十至二十一之一相同。
具体实施方式二十三：本实施方式用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步骤进行：一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将300g除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至80℃，加入0.36mL质量浓度为50％的柠檬酸溶液，混匀，在搅拌速度为500r/min的条件下反应20min；二、然后冷却至50℃，加入质量浓度为4％NaOH溶液调节pH值至6，再加入0.03g磁性固定化磷脂酶A1，于搅拌速度为60r/min下反应4h，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。
本实施方式制备的脱胶油中磷含量降到8mg/kg，磁性固定化磷脂酶A1的活力回收率达到90％，重复使用4次以后，磁性固定化磷脂酶A1的活力仍保留85％。

Claims (10)

1.磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，按以下步骤进行：一、制备Fe3O4纳米粒子；二、制备Fe3O4/SiOx复合粒子；三、制备Fe3O4/SiOx-APTS载体；四、制备磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子；五、将磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子加入到0.1mol/L且pH值为7～7.2的磷酸缓冲液中浸泡24～26h，然后进行磁分离，得浸泡后的载体；六、将磷脂酶A1加入0.1mol/L且pH值为5.5～9.5的磷酸缓冲液中，制成质量浓度为0.2％的磷脂酶A1磷酸缓冲液，然后将浸泡后的载体加入到12～88mL磷脂酶A1磷酸缓冲液中，在10～50℃下用磁力搅拌器搅拌2～9h，搅拌速度为10～12r/min，然后进行磁分离，用0.1mol/L且pH值为7～7.2的磷酸缓冲液冲洗2～3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1；其中步骤五中每克磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子加入到48～50mL磷酸缓冲液中。
2.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤一中制备Fe3O4纳米粒子的具体方法为：a、将1mol/L的FeCl2溶液和1.75mol/L的FeCl3溶液混合，使Fe2+与Fe3+的摩尔比为1∶1.5，在氮气保护下，于水浴60℃搅拌，搅拌速度为10～40r/min，同时滴加质量浓度为25％～28％的氨水调节pH值至10，然后升温至80℃保持lh，之后冷却至室温，得产物A；b、用永久磁体将产物A分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，于室温下真空干燥24h，即得到Fe3O4纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤二中制备Fe3O4/SiOx复合粒子的具体方法为：a、称取2gFe3O4纳米粒子，加入160mL乙醇、40mL水和5mL质量浓度为25％的氨水，用20～40KHz的超声波分散lh后，进行搅拌，搅拌速度为10～50r/min，同时滴加10～50mL的正硅酸乙酯，反应12h后，得产物B；b、用永久磁体将产物B分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，然后用lmol/L的盐酸将产物B覆盖，浸泡12h，磁分离后，用蒸馏水洗至pH值为中性，室温下真空干燥24h，即得到Fe3O4/SiOx复合粒子。
4.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤三中制备Fe3O4/SiOx-APTS载体的具体方法为：a、称取1g Fe3O4/SiOx复合粒子，加入60mL无水乙醇，用20～40KHz的超声波分散1h，加入6mLNH3·H20，再用超声波分散10min，在氮气保护下，于搅拌速度为20r/min的条件下滴加4mLγ-氨丙基三乙氧基硅烷，在水浴50℃条件下保持8h，自然冷却至室温，得产物C；b、用永久磁体将产物C分离出来，用蒸馏水洗至pH值为中性，再用无水乙醇洗涤3次，每次10min，于室温下真空干燥24h，得到Fe3O4/SiOx-APTS载体。
5.根据权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的制备方法，其特征在于步骤四中制备磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子的具体方法为：a、称取2.0g Fe3O4/SiOx-APTS载体，加入30mL二甲基甲酰胺中，用20～40KHz的超声波分散1h，向其中加入5～20mL的三乙胺，在冰浴冷却下向其中滴加含有3mL氯乙酰氯的二甲基甲酰胺溶液5mL，滴加时间不超过0.5h；b、加热回流，反应10h，然后用无水乙醇于20KHz超声波下洗涤，真空干燥至恒重，得产物D；c、称取0.5g产物D，加入20mL二甲基甲酰胺溶液，二甲基甲酰胺与水的体积比为1∶1，用20～40KHz的超声分散30min，通入氮气0.5h，然后加入50mL甲基丙烯酸缩水甘油酯、1mL联吡啶、0.5gCuCl和0.1gCuCl2，室温下搅拌，反应12h，得产物E；d、用永久磁体将产物E从溶液中分离，并用丙酮抽提48h，最后将产物E于室温下真空干燥24h，得到磁性Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)复合粒子。
6.利用权利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，按以下步骤进行：一、使用水化脱胶法脱除毛油中的水化磷脂，得到除去水化磷脂的毛油，将除去水化磷脂的毛油进行水浴加热至70～90℃，加入质量浓度为40％～50％的柠檬酸溶液，混匀，柠檬酸溶液的质量为除去水化磷脂的毛油质量的0.1％～2％，在搅拌速度为400～600r/min的条件下反应10～30min；二、然后冷却至30～70℃，加入质量浓度为3％～5％NaOH溶液调节pH值至3～9，再加入磁性固定化磷脂酶A1，每千克除去水化磷脂的毛油加入0.04～0.16g的磁性固定化磷脂酶A1，于搅拌速度为40～120r/min下反应1～6h，用磁铁将磁性固定化磷脂酶A1与除去水化磷脂的毛油分离，即得到脱胶油。
7.根据权利要求6所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步骤二中然后冷却至40～60℃。
8.根据权利要求6或7所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步骤二中加入质量浓度为4％NaOH溶液调节pH值至5～8。
9.根据权利要求8所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步骤二中每千克除去水化磷脂的毛油加入0.08～0.12g的磁性固定化磷脂酶A1。
10.根据权利要求9所述的用磁性固定化磷脂酶A1精炼毛油的方法，其特征在于步骤二中于搅拌速度为60～100r/min下反应2～5h。
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