CN107779461A - 一种引入多胺标签的基因改造方法，脂肪酶的可溶表达及生物仿生固定化方法 - Google Patents

一种引入多胺标签的基因改造方法，脂肪酶的可溶表达及生物仿生固定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种实现其可溶、有活性表达的基因改造方法：以N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因作为目的基因，在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10，并针对目的基因设计引物；通过PCR获得N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因。该基因表达后产出可溶的带有多胺标签的脂肪酶，其可以诱导仿生纳米硅的形成及固定化。本发明在温和的条件下、短时间就可获得高活力和固定化效率的固定化酶；操作简便，固定化条件易控制、成本低。

Description

一种引入多胺标签的基因改造方法，脂肪酶的可溶表达及生 物仿生固定化方法
技术领域
本发明涉及基因工程、蛋白固定化技术领域，具体地，本发明涉及用一种基因改造方法，在脂肪酶基因中引入多胺标签，可以有效实现脂肪酶在大肠杆菌中的可溶表达，产生带有多聚阳离子氨基酸标签的脂肪酶；该脂肪酶诱导硅酸聚集成硅颗粒，并通过电荷相互作用和离子间作用力将蛋白固定到硅粒子上，得到固定化酶及其应用。
背景技术
脂肪酶可以催化酯化、水解、转酯以及酰化等类型反应。在非水相催化合成中，很多脂肪酶，比如南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B，CalB)，表现出了极好的活性和操作稳定性；在有机合成、手性化合物拆分、制药、医药中间体等领域得到广泛应用。
据报道CalB等脂肪酶在真核微生物，如毕赤酵母(Pichiapastoris)，米曲酶(Aspergillus-oryzae)等可进行良好表达，但是在真核表达系统操作繁琐，生长周期较长。大肠杆菌代谢途径和基因表达调控机制清楚，培养周期短，目标基因表达水平高，成为构建、表达的良好宿主菌。目前已有将CalB等脂肪酶在大肠杆菌中进行表达的报道，如liu等人利用还原酶缺陷性菌株Origami B结合带有冷启动子的PcoldIII载体，成功将CalB在大肠杆菌中表达，但是大量的重组蛋白质都形成不可溶的包涵体(《Functional expressionof Candida antarctica lipase B in the Escherichia coli cytoplasm—a screeningsystem for a frequently used biocatalyst》)。Blank等人也成功将CalB在细胞周质空间里进行表达，但表达量较低，且大量重组蛋白质仍以不可溶形式存在(《Functionalexpression of Candida antarctica lipase B in Escherichia coli》)。虽然后期Jung等人通过密码子优化，及表面疏水残基突变的方法提升了CalB在细胞周质空间的表达量(《Improving the expression yield of Candida antarctica lipase B inEscherichiacoli by mutagenesis》)，但是仍然没有彻底解决重组蛋白质以不可溶形式存在的问题。
脂肪酶应用广泛，但直接将游离态的天然酶投入使用、催化反应等通常会遇到一些问题，例如：游离酶在非水溶剂中不溶解，易聚集，极大地降低了酶的利用率；游离酶活性不稳定，易受外界环境因素(温度、PH值、离子强度)变化而失活；酶的分离困难，参与反应后的酶无法回收再利用。
由于存在以上种种不利因素，那么通过某些方法将酶与载体相结合成不溶于含有底物的体系中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应，使它与整个体系隔开；反应时能发挥作用，反应结束后可回收再利用，即酶固定化技术。固定化技术的应用可追溯到20世纪50年代，最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”。1971年第一届国际酶工程会议上，正是建议采用“固定化酶”的名称。所谓固定化酶，是指在一定空间内程闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
目前常用的酶固定化技术可归纳为共价结合、离子键固定、非共价吸附、酶交联和包埋法5类。近年来，受生物启发，通过模拟生物界面，利用生物分子识别和借鉴生物矿化等，发展了许多新的固定化方法，效果显著。
自然界中硅藻细胞形态的一个重要特点是细胞外覆盖主要成分为SiO2的细胞壁。硅藻细胞壁的硅产生组织，主要是由一种特殊的蛋白质，硅蛋白(silaffin)所形成；硅蛋白的结构特点是：带有大量正电荷的多胺链，以及高度磷酸化。硅藻细胞壁的形成过程实现了氧化硅的结构控制和生物大分子的活性维持，这对生物仿生硅的制备有很大借鉴作用。利用聚胺或者酶来催化氧化硅的形成，并控制氧化硅的形貌结构；同时包埋酶分子，最大限度地保存酶活。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基因工程方法，针对外源蛋白在大肠杆菌中表达易形成包涵体，有活性的蛋白产率低，提供一种实现其可溶、有活性表达的基因改造方法，技术方案如下：
以N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因作为目的基因，在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10，并针对目的基因设计引物；通过PCR获得N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因。
优选的技术方案如下：
以N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因作为目的基因，在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10，并针对目的基因设计引物；通过PCR获得N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因mHis-脂肪酶-nLys或mHis-脂肪酶-nArg。
所述脂肪酶优选为南极假丝酵母脂肪酶B，缩写为脂肪酶CalB，获得的N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因分别为mHis-CalB-nLys或mHis-CalB-nArg。
脂肪酶CalB的基因序列为Atgctaccttccggttcggaccctgccttttcgcagcccaagtcggtgctcgatgcgggtctgacctgccagggtgcttcgccatcctcggtctccaaacccatccttctcgtccccggaaccggcaccacaggtccacagtcgttcgactcgaactggatccccctctcaacgcagttgggttacacaccctgctggatctcacccccgccgttcatgctcaacgacacccaggtcaacacggagtacatggtcaacgccatcaccgcgctctacgctggttcgggcaacaacaagcttcccgtgcttacctggtcccagggtggtctggttgcacagtggggtctgaccttcttccccagtatcaggtccaaggtcgatcgacttatggcctttgcgcccgactacaagggcaccgtcctcgccggccctctcgatgcactcgcggttagtgcaccctccgtatggcagcaaaccaccggttcggcactcaccaccgcactccgaaacgcaggtggtctgacccagatcgtgcccaccaccaacctctactcggcgaccgacgagatcgttcagcctcaggtgtccaactcgccactcgactcatcctacctcttcaacggaaagaacgtccaggcacaggccgtgtgtgggccgctgttcgtcatcgaccatgcaggctcgctcacctcgcagttctcctacgtcgtcggtcgatccgccctgcgctccaccacgggccaggctcgtagtgcagactatggcattacggactgcaaccctcttcccgccaatgatctgactcccgagcaaaaggtcgccgcggctgcgctcctggcgccggcagctgcagccatcgtggcgggtccaaagcagaactgcgagcccgacctcatgccctacgcccgcccctttgcagtaggcaaaaggacctgctccggcatcgtcaccccctga。
本发明提供了一种N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因，一种N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因，其结构如下：在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10。
优选的技术方案如下：
一种N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因，其结构如下：在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10。该N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因的结构通式如下：mHis-脂肪酶-nArg，mHis-脂肪酶-nLys，m＝2～10，n＝2～10。
本发明提供了一种带有多胺标签的脂肪酶，其结构如下：在脂肪酶的N末端连接m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸，m＝2～10，同时在脂肪酶C末端连接n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸，n＝2～10。
优选的技术方案如下：
一种带有多胺标签的脂肪酶，其结构如下：在脂肪酶的N末端连接m个组氨酸，m＝2～10，同时在脂肪酶C末端连接n个精氨酸或n个赖氨酸，n＝2～10。
本发明还提供了含有N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因的重组表达质粒，例如，可为mHis-脂肪酶-nLys-pET21a(m＝2～10，n＝2～10)或mHis-脂肪酶-nArg-pET21a(m＝2～10，n＝2～10)。
优选的，所述含有N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因的重组表达质粒，例如，可为mHis-CalB-nLys-pET21a(m＝2～10，n＝2～10)或mHis-CalB-nArg-pET21a(m＝2～10，n＝2～10)。
进一步优选的，所述含有N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因的重组表达质粒，例如，为6His-CalB-10Lys-pET21a和6His-CalB-10Arg-pET21a。
本发明还提供了所述重组表达质粒的构建方法，其包括如下步骤：
(1)将所述N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因(例如，mHis-脂肪酶-nLys或mHis-脂肪酶-nArg)连接到载体PMD-18T中，构建扩增质粒；
(2)用限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切扩增质粒和载体pET-21a后，用T4连接酶连接，构建得到含有多胺标签的脂肪酶基因的重组表达质粒。
所述重组表达质粒可以在表达菌细胞中表达。表达后在IPTG的低温诱导培养下，产出可溶、有活性的目的蛋白，即带有多胺标签的脂肪酶。所述表达菌细胞优选为BL21(DE3)感受态细胞。
本发明还提供了所述带有多胺标签的脂肪酶诱导仿生纳米硅的形成及固定化方法，其包括如下步骤：
(1)将上述带有多胺标签的脂肪酶用磷酸缓冲液稀释，制成酶液；
(2)正硅酸甲酯(TMOS)与盐酸溶液混溶，室温条件下匀速搅拌(例如，10～45min(优选15min))，使其充分水解；得到纳米硅(Silica Particles，SPs)前体；
(3)将纳米硅前体置于冰水浴中，加入步骤(1)制得的酶液，共固定化一段时间后，离心回收固定化样品，并用清洗缓冲液清洗固定化样品例如2～4次；除去未固定上的游离酶，得到的固定化酶mHis或mLys或mArg-脂肪酶-nHis或nArg或nLys-SPs。
其中，
优选地，步骤(2)中正硅酸甲酯的终浓度为1mol/L，HCL浓度为0.1mM；
优选地，步骤(1)中所述酶液中蛋白浓度为20～24mg/mL；
优选地，步骤(3)中所述酶液和所述纳米硅前体的体积比为1：1；
优选地，步骤(3)中所述共固定化在搅拌下进行，共固定化的时间为60～90min；
优选地，步骤(3)中所述离心的条件为5000～8000rpm，5～10min；
优选地，步骤(3)中所述清洗缓冲液为磷酸缓冲液。
得到的所述固定化酶mHis或mLys或mArg-脂肪酶-nHis或nArg或nLys-SPs可以被应用于催化不对称有机合成反应、手性化合物拆分等。
本发明有益效果：与其他固定化方法相比，本发明
(1)引入简单的多胺标签，即可实现蛋白可溶表达和固定化的双重效果；
(2)固定化方法简单、快速；不需要加入额外的偶联剂、添加剂，直接依靠蛋白本身的多胺标签与硅粒子之间的电荷相互作用，就能有效固定化目的蛋白；
(3)蛋白固定化效率和活力回收高；固定化效率高达95％，活力回收高达81％。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下实施例中涉及到但未具体说明的分子生物学实验技术、蛋白固定化技术，参照《分子克隆实验指南》(第三版)、pET系统操作手册(第十版)以及《酶工程》(第二版)中的具体方案实施，或按照产品说明书和试剂盒说明书进行；本发明实施例中的脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B，缩写为脂肪酶CalB)，脂肪酶CalB基因来源于质粒PA1K-pPIC9K(肖培亮硕士论文，酶催化不对称合成手性咖啡酸衍生物的研究)。
实施例中的载体PMD-18T购买自生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon(Shanghai,China))，限制性内切酶NdeI、XhoI双酶和T4连接酶购买自宝生物工程(大连)有限公司(Takara(Dalian,China))，TMOS购买自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(TCI(Shanghai,China))，载体pET-21a和BL21(DE3)感受态细胞购买自Novagen,Madison,WI。
实施例1：PCR方法构建表达具有多胺标签的脂肪酶基因6His-CalB-10Lys
以PA1K-pPIC9K为模板，根据已知的CalB基因序列，设计上游引物H6-CalB(F)(下划线为NdeI酶切位点)和下游引物CalB-K10(R)(下划线为XhoI酶切位点)序列如下：
H6-CalB(F):5’-ATATATCATATGCACCACCACCACCACCACCTACCTTCCGGTTCG GACCCTGC–3’
CalB-K10(R):5’-AATCGCCTCGAGTCATTTTTTCTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTCTTGGGGGTGACGATGCCG–3’
将质粒PA1K-pPIC9K、上游引物、下游引物、去离子水、DNA聚合酶反应混合物体系按照如下体积进行配比后，用PCR扩增出富含多胺标签的脂肪酶基因片段6His-CalB-10Lys。
所述PCR扩增程序为：94℃2min，94℃45s，55℃45s，72℃2min；共35个循环；72℃延伸5min。
脂肪酶基因片段6His-CalB-10Lys的基因序列为：
AtgcaccaccaccaccaccacctaccttccggttcggaccctgccttttcgcagcccaagtcggtgCtcgatgcgggtctgacctgccagggtgcttcgccatcctcggtctccaaacccatccttCtcgtccccggaaccggcaccacaggtccacagtcgttcgactcgaactggatccccctcTcaacgcagttgggttacacaccctgctggatctcacccccgccgttcatgctcaacgacAcccaggtcaacacggagtacatggtcaacgccatcaccgcgctctacgctggttcgggcaacaacaagcttcccgtgcttacctggtcccagggtggtctggttgcacagtggggtctgAccttcttccccagtatcaggtccaaggtcgatcgacttatggcctttgcgcccgactacAagggcaccgtcctcgccggccctctcgatgcactcgcggttagtgcaccctccgtatggCagcaaaccaccggttcggcactcaccaccgcactccgaaacgcaggtggtctgacccagAtcgtgcccaccaccaacctctactcggcgaccgacgagatcgttcagcctcaggtgtccAactcgccactcgactcatcctacctcttcaacggaaagaacgtccaggcacaggccgtgTgtgggccgctgttcgtcatcgaccatgcaggctcgctcacctcgcagttctcctacgtcGtcggtcgatccgccctgcgctccaccacgggccaggctcgtagtgcagactatggcattAcggactgcaaccctcttcccgccaatgatctgactcccgagcaaaaggtcgccgcggctGcgctcctggcgccggcagctgcagccatcgtggcgggtccaaagcagaactgcgagcccGacctcatgccctacgcccgcccctttgcagtaggcaaaaggacctgctccggcatcgtcAcccccaagaaaaagaaaaaaaagaaaaagaaaaaatga
将获得的基因片段6His-CalB-10Lys与载体PMD-18T重组，构建扩增质粒；再用限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切扩增质粒和载体pET-21a，用T4连接酶连接，构建含有多胺标签的脂肪酶表达质粒6His-CalB-10Lys-pET21a。
实施例2：PCR方法构建表达具有多胺标签的脂肪酶基因6His-CalB-10Arg
脂肪酶CalB基因来源于质粒PA1K-pPIC9K(肖培亮硕士论文，酶催化不对称合成手性咖啡酸衍生物的研究)，以PA1K-pPIC9K为模板，根据已知的CAL-B基因序列，设计上游引物H6-CalB(F)(下划线为NdeI酶切位点)和下游引物CalB-R10(R)(下划线为XhoI酶切位点)序列如下：
H6-CalB(F):5’-ATATATCATATGCACCACCACCACCACCACCTACCTTCCGGTTCGGACCCTGC–3’
CalB-R10(R):5’-AATCGCCTCGAGTCAACGACGACGACGACGACGACGACGACGACGGGGGGTGACGATGCCG–3’
将质粒PA1K-pPIC9K、上游引物、下游引物、去离子水、DNA聚合酶反应混合物体系按照如下体积进行配比后，用PCR扩增出富含多胺标签的脂肪酶基因片段6His-CalB-10Arg。
所述PCR扩增程序为：94℃2min，94℃45s，55℃45s，72℃2min；共35个循环；72℃延伸5min。
脂肪酶基因片段6His-CalB-10Arg的基因序列为：
ATGCACCACCACCACCACCACctaccttccggttcggaccctgccttttcgcagcccaagtcggtgctcgatgcgggtctgacctgccagggtgcttcgccatcctcggtctccaaacccatccttctcgtccccggaaccggcaccacaggtccacagtcgttcgactcgaactggatccccctctcaacgcagttgggttacacaccctgctggatctcacccccgccgttcatgctcaacgacacccaggtcaacacggagtacatggtcaacgccatcaccgcgctctacgctggttcgggcaacaacaagcttcccgtgcttacctggtcccagggtggtctggttgcacagtggggtctgaccttcttccccagtatcaggtccaaggtcgatcgacttatggcctttgcgcccgactacaagggcaccgtcctcgccggccctctcgatgcactcgcggttagtgcaccctccgtatggcagcaaaccaccggttcggcactcaccaccgcactccgaaacgcaggtggtctgacccagatcgtgcccaccaccaacctctactcggcgaccgacgagatcgttcagcctcaggtgtccaactcgccactcgactcatcctacctcttcaacggaaagaacgtccaggcacaggccgtgtgtgggccgctgttcgtcatcgaccatgcaggctcgctcacctcgcagttctcctacgtcgtcggtcgatccgccctgcgctccaccacgggccaggctcgtagtgcagactatggcattacggactgcaaccctcttcccgccaatgatctgactcccgagcaaaaggtcgccgcggctgcgctcctggcgccggcagctgcagccatcgtggcgggtccaaagcagaactgcgagcccgacctcatgccctacgcccgcccctttgcagtaggcaaaaggacctgctccggcatcgtcaccccccgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtTGA
将获得的目的片段与载体PMD-18T重组，构建扩增质粒；再用限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切扩增质粒和载体pET-21a，用T4连接酶连接，构建含有多胺标签的脂肪酶表达质粒6His-CalB-10Arg-pET21a。
实施例3：表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中表达
将实施例1和实施例2制得的含不同多胺标签的脂肪酶表达质粒6His-CalB-10Lys-pET21a和6His-CalB-10Arg-pET21a分别转入BL21(DE3)感受态细胞中，LB固体培养基平板、过夜培养，挑取单克隆接种于LB液体培养基，37℃培养至对数期；加入1mM IPTG、16℃、108rpm，培养14h，获得表达菌表达菌BL21DE3(6His-CalB-10Lys-pET21a)和表达菌BL21DE3(6His-CalB-10Arg-pET21a)，诱导表达蛋白，即获得含有多胺标签的脂肪酶。
6His-CalB-10Lys脂肪酶的氨基酸序列为：
MHHHHHHLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTPKKKKKKKKKK
6His-CalB-10Arg脂肪酶的氨基酸序列为：
MHHHHHHLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTPRRRRRRRRRR
实施例4：脂肪酶的表达鉴定
取诱导表达14h的菌体，将菌体破碎，离心后获得上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。蛋白胶制备方法参考《蛋白质技术手册》(汪家政，范明.北京科学出版社，2000：77-91.)。
N末端和C末端同时含有多胺标签的脂肪酶表达质粒6His-CalB-10Lys-pET21a和6His-CalB-10Arg-pET21a转入BL21(DE3)感受态细胞中可表达、分泌较多可溶的脂肪酶；而原基因CalB在BL21(DE3)感受态细胞中无蛋白表达或全部以包涵体形式出现。两种脂肪酶的蛋白表达量见下表：
蛋白 表达量(蛋白/菌液，mg/L)
6His-CalB-10Lys脂肪酶 110mg蛋白/L菌液
6His-CalB-10Arg脂肪酶 105mg蛋白/L菌液
实施例5：含有多胺标签的脂肪酶的酶活测定
以对硝基苯酚辛酸酯(PNPC)作为酶水解的底物，在1ml 50mMpH8.0Tris-HCL缓冲液中，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度0.1mM(乙腈为溶剂)，实施例3表达得到的含有多胺标签的脂肪酶适量(所测得的曲线斜率小于1)，在40℃条件下，用UV-2500型分光光度计测定420nm的光吸收值变化ΔOD420。1个酶活单位(U)的定义为1分钟内水解底物生成1μmol对硝基苯酚(ε＝0.016μM-1)所需要的酶量。按照如下公式计算酶活力(U/mg)：
其中，V表示测试体积，t表示反应时间，V酶表示加入酶的体积，C酶表示加入酶的浓度，ε表示PNPC在420nm下的摩尔消光系数(0.016mM-1·cm-1)，结果见下表。
蛋白 酶活力(U/mg)
6His-CalB-10Lys脂肪酶 10.45
6His-CalB-10Arg脂肪酶 9.04
实施例6：脂肪酶诱导仿生二氧化硅纳米颗粒的形成及其固定化
将实施例3中培养14h后获得的表达菌BL21DE3(6His-CalB-10Lys-pET21a)和表达菌BL21DE3(6His-CalB-10Arg-pET21a)，用缓冲液100mM PBS(PH9.0)清洗两次，再加入一定量的100mM PBS(PH9.0)重悬后超声破碎，12000rpm离心后取出上清目的蛋白；用100mM PBS(PH9.0)将蛋白浓度调整至22mg/mL。
配制浓度为0.1mM的HCL。取洁净玻璃管，加入转子；再加入535μL 0.1mM的HCL。
向上述玻璃管中加入93μL TMOS，室温条件下温和搅拌15min；即在酸性条件下发生硅氧烷的水解缩聚反应，形成水解体系。
15min后，上述水解体系仍为溶液状态。将玻璃管转入冰水浴中，继续向上述水解体系中加入628μL前述制备的浓度为22mg/mL的蛋白；冰水浴条件下温和搅拌60min。此时，蛋白上的聚阳离子小肽与硅酸之间发生电荷相互作用，在促进硅粒子形成的同时，也使蛋白自身结合到硅粒子上，形成固定化酶(6His-CalB-10Lys-SPs)和固定化酶(6His-CalB-10Arg-SPs)。
60min后，整个体系为凝胶状。用100mM PBS(PH9.0)将凝胶状样品重悬，清洗3次。离心后的上清用Bradford法测浓度，计算固定化效率(％)；离心后得到的沉淀即为固定化酶，用UV-2550定点取样法测固定化酶的比活力(U/mg)和活力回收(％)。结果见下表：
固定化酶 固定化效率(％) 活力回收(％)
6His-CalB-10Lys-SPs 96.81 83.49
6His-CalB-10Arg-SPs 96.04 77.93
以上实施例为本发明优选后的实验方案。但是，本发明并不局限于上述特定操作方式。在不背离本发明实质内容的情况下，本领域技术人员所作出的任何改进、替换或形式调整均为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 一种引入多胺标签的基因改造方法，可溶表达及脂肪酶的生物仿生固定化方
法
<130> DI16-8254-XC47
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 957
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 脂肪酶CalB的基因序列
<400> 1
atgctacctt ccggttcgga ccctgccttt tcgcagccca agtcggtgct cgatgcgggt 60
ctgacctgcc agggtgcttc gccatcctcg gtctccaaac ccatccttct cgtccccgga 120
accggcacca caggtccaca gtcgttcgac tcgaactgga tccccctctc aacgcagttg 180
ggttacacac cctgctggat ctcacccccg ccgttcatgc tcaacgacac ccaggtcaac 240
acggagtaca tggtcaacgc catcaccgcg ctctacgctg gttcgggcaa caacaagctt 300
cccgtgctta cctggtccca gggtggtctg gttgcacagt ggggtctgac cttcttcccc 360
agtatcaggt ccaaggtcga tcgacttatg gcctttgcgc ccgactacaa gggcaccgtc 420
ctcgccggcc ctctcgatgc actcgcggtt agtgcaccct ccgtatggca gcaaaccacc 480
ggttcggcac tcaccaccgc actccgaaac gcaggtggtc tgacccagat cgtgcccacc 540
accaacctct actcggcgac cgacgagatc gttcagcctc aggtgtccaa ctcgccactc 600
gactcatcct acctcttcaa cggaaagaac gtccaggcac aggccgtgtg tgggccgctg 660
ttcgtcatcg accatgcagg ctcgctcacc tcgcagttct cctacgtcgt cggtcgatcc 720
gccctgcgct ccaccacggg ccaggctcgt agtgcagact atggcattac ggactgcaac 780
cctcttcccg ccaatgatct gactcccgag caaaaggtcg ccgcggctgc gctcctggcg 840
ccggcagctg cagccatcgt ggcgggtcca aagcagaact gcgagcccga cctcatgccc 900
tacgcccgcc cctttgcagt aggcaaaagg acctgctccg gcatcgtcac cccctga 957
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR合成脂肪酶基因6His-CalB-10Lys时的上游引物H6-CalB(F)序列
<400> 2
atatatcata tgcaccacca ccaccaccac ctaccttccg gttcggaccc tgc 53
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR合成脂肪酶基因6His-CalB-10Lys时的下游引物CalB-K10(R)序列
<400> 3
aatcgcctcg agtcattttt tctttttctt ttttttcttt ttcttggggg tgacgatgcc 60
g 61
<210> 4
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 脂肪酶基因片段6His-CalB-10Lys的基因序列
<400> 4
atgcaccacc accaccacca cctaccttcc ggttcggacc ctgccttttc gcagcccaag 60
tcggtgctcg atgcgggtct gacctgccag ggtgcttcgc catcctcggt ctccaaaccc 120
atccttctcg tccccggaac cggcaccaca ggtccacagt cgttcgactc gaactggatc 180
cccctctcaa cgcagttggg ttacacaccc tgctggatct cacccccgcc gttcatgctc 240
aacgacaccc aggtcaacac ggagtacatg gtcaacgcca tcaccgcgct ctacgctggt 300
tcgggcaaca acaagcttcc cgtgcttacc tggtcccagg gtggtctggt tgcacagtgg 360
ggtctgacct tcttccccag tatcaggtcc aaggtcgatc gacttatggc ctttgcgccc 420
gactacaagg gcaccgtcct cgccggccct ctcgatgcac tcgcggttag tgcaccctcc 480
gtatggcagc aaaccaccgg ttcggcactc accaccgcac tccgaaacgc aggtggtctg 540
acccagatcg tgcccaccac caacctctac tcggcgaccg acgagatcgt tcagcctcag 600
gtgtccaact cgccactcga ctcatcctac ctcttcaacg gaaagaacgt ccaggcacag 660
gccgtgtgtg ggccgctgtt cgtcatcgac catgcaggct cgctcacctc gcagttctcc 720
tacgtcgtcg gtcgatccgc cctgcgctcc accacgggcc aggctcgtag tgcagactat 780
ggcattacgg actgcaaccc tcttcccgcc aatgatctga ctcccgagca aaaggtcgcc 840
gcggctgcgc tcctggcgcc ggcagctgca gccatcgtgg cgggtccaaa gcagaactgc 900
gagcccgacc tcatgcccta cgcccgcccc tttgcagtag gcaaaaggac ctgctccggc 960
atcgtcaccc ccaagaaaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa aatga 1005
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR合成脂肪酶基因6His-CalB-10Arg时的上游引物H6-CalB(F)序列
<400> 5
atatatcata tgcaccacca ccaccaccac ctaccttccg gttcggaccc tgc 53
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR合成脂肪酶基因6His-CalB-10Arg时的下游引物CalB-R10(R)序列
<400> 6
aatcgcctcg agtcaacgac gacgacgacg acgacgacga cgacgggggg tgacgatgcc 60
g 61
<210> 7
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 脂肪酶基因片段6His-CalB-10Arg的基因序列
<400> 7
atgcaccacc accaccacca cctaccttcc ggttcggacc ctgccttttc gcagcccaag 60
tcggtgctcg atgcgggtct gacctgccag ggtgcttcgc catcctcggt ctccaaaccc 120
atccttctcg tccccggaac cggcaccaca ggtccacagt cgttcgactc gaactggatc 180
cccctctcaa cgcagttggg ttacacaccc tgctggatct cacccccgcc gttcatgctc 240
aacgacaccc aggtcaacac ggagtacatg gtcaacgcca tcaccgcgct ctacgctggt 300
tcgggcaaca acaagcttcc cgtgcttacc tggtcccagg gtggtctggt tgcacagtgg 360
ggtctgacct tcttccccag tatcaggtcc aaggtcgatc gacttatggc ctttgcgccc 420
gactacaagg gcaccgtcct cgccggccct ctcgatgcac tcgcggttag tgcaccctcc 480
gtatggcagc aaaccaccgg ttcggcactc accaccgcac tccgaaacgc aggtggtctg 540
acccagatcg tgcccaccac caacctctac tcggcgaccg acgagatcgt tcagcctcag 600
gtgtccaact cgccactcga ctcatcctac ctcttcaacg gaaagaacgt ccaggcacag 660
gccgtgtgtg ggccgctgtt cgtcatcgac catgcaggct cgctcacctc gcagttctcc 720
tacgtcgtcg gtcgatccgc cctgcgctcc accacgggcc aggctcgtag tgcagactat 780
ggcattacgg actgcaaccc tcttcccgcc aatgatctga ctcccgagca aaaggtcgcc 840
gcggctgcgc tcctggcgcc ggcagctgca gccatcgtgg cgggtccaaa gcagaactgc 900
gagcccgacc tcatgcccta cgcccgcccc tttgcagtag gcaaaaggac ctgctccggc 960
atcgtcaccc cccgtcgtcg tcgtcgtcgt cgtcgtcgtc gttga 1005
<210> 8
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 6His- CalB- 10Lys脂肪酶的氨基酸序列
<400> 8
Met His His His His His His Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala
20 25 30
Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly
35 40 45
Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr
50 55 60
Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala
85 90 95
Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
100 105 110
Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile
115 120 125
Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly
130 135 140
Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser
145 150 155 160
Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala
180 185 190
Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser
195 200 205
Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly
210 215 220
Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser
225 230 235 240
Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp
260 265 270
Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala
275 280 285
Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu
290 295 300
Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly
305 310 315 320
Ile Val Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
325 330
<210> 9
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 6His-CalB-10Arg脂肪酶的氨基酸序列
<400> 9
Met His His His His His His Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala
20 25 30
Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly
35 40 45
Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr
50 55 60
Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala
85 90 95
Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser
100 105 110
Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile
115 120 125
Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly
130 135 140
Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser
145 150 155 160
Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala
180 185 190
Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser
195 200 205
Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly
210 215 220
Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser
225 230 235 240
Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp
260 265 270
Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala
275 280 285
Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu
290 295 300
Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly
305 310 315 320
Ile Val Thr Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
325 330

Claims (10)

1.一种实现其可溶、有活性表达的基因改造方法，其包括如下步骤：
以N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因作为目的基因，在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10，并针对目的基因设计引物；通过PCR获得N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因。
2.一种实现其可溶、有活性表达的基因改造方法，其包括如下步骤：
以N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因作为目的基因，在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10，并针对目的基因设计引物；通过PCR获得N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因mHis-脂肪酶-nArg或mHis-脂肪酶-nLys。
3.根据权利要求1或2所述的基因改造方法，其特征在于：所述脂肪酶为脂肪酶CalB。
4.一种N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因，其结构如下：在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10。
5.一种N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因，其结构如下：在脂肪酶亲本基因序列的N末端添加编码m个组氨酸的核苷酸序列，m＝2～10，同时在脂肪酶亲本基因序列的C末端添加编码n个精氨酸或n个赖氨酸的核苷酸序列，n＝2～10。
6.一种带有多胺标签的脂肪酶，其结构如下：在脂肪酶的N末端连接m个组氨酸、m个精氨酸或m个赖氨酸，m＝2～10，同时在脂肪酶C末端连接n个组氨酸、n个精氨酸或n个赖氨酸，n＝2～10。
7.一种带有多胺标签的脂肪酶，其结构如下：在脂肪酶的N末端连接m个组氨酸，m＝2～10，同时在脂肪酶C末端连接n个精氨酸或n个赖氨酸，n＝2～10。
8.含有权利要求4或5所述的N末端和C末端同时带有多胺标签的脂肪酶基因的重组表达质粒。
9.带有多胺标签的脂肪酶诱导仿生纳米硅的形成及固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求6或7所述的带有多胺标签的脂肪酶用磷酸缓冲液稀释，制成酶液；
(2)正硅酸甲酯与HCL水溶液混溶，室温条件下匀速搅拌，使其充分水解，得到纳米硅(SPs)前体；
(3)将纳米硅前体置于冰水浴中，加入步骤(1)制得的酶液，共固定化后，离心回收固定化样品，并用清洗缓冲液清洗固定化样品；除去未固定上的游离酶，得到的固定化酶mHis或mLys或mArg-脂肪酶-nHis或nArg或nLys-SPs；
优选的，步骤(1)中所述酶液中蛋白浓度为20～24mg/mL；
优选的，步骤(3)中所述酶液和所述纳米硅前体的体积比为1：1；
优选的，步骤(3)中所述共固定化在搅拌下进行，共固定化的时间为60～90min。
10.根据权利要求9所述的方法得到的固定化酶mHis或mLys或mArg-脂肪酶-nHis或nArg或nLys-SPs在催化不对称有机合成反应和手性化合物拆分中的用途。
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