CN103887030A - 一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用。所述磁性亲和纳米颗粒包括：四氧化三铁纳米颗粒和包裹于所述四氧化三铁纳米颗粒外部的聚多巴胺涂层，所述聚多巴胺涂层表面螯合有镍离子。本发明采用具有超顺磁特性的四氧化三铁纳米颗粒作为载体，在其表面通过多巴胺自聚形成的聚多巴胺膜进行修饰得到与镍离子高效螯合的磁性亲和纳米颗粒，最终实现对组氨酸标签蛋白的快速、高效、简便的纯化以及对组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化。本发明所提供的磁性亲和纳米颗粒制备过程简单、价廉，该材料用于组氨酸标签蛋白的分离纯化或固定化操作过程简便有效，因此该技术具有广泛的应用前景。

Description

一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

固定金属离子亲和色谱（IMAC）是近30年来发展起来的一种新型高效的蛋白质亲和分离技术，它主要通过材料表面的配基螯合铜、镍、钴或锌离子，利用蛋白质表面的一些氨基酸残基，如组氨酸、色氨酸或半胱氨酸能和这些离子发生较强的配位作用从而实现分离蛋白的目的。和其他蛋白纯化的方法相比，IMAC技术具有配基稳定性高、可重复使用且再生成本低、对目标蛋白选择性好且吸附量大、吸附与洗脱条件温和不影响蛋白活性等优点，尤其对带有6个组氨酸标签融合蛋白的分离纯化具有很好的效果。因此该技术逐渐成为了蛋白质分离纯化领域最有效、应用最广的技术之一。

目前的IMAC多采用传统的柱层析技术，仍然具有以下的缺点：样品需要预处理去除固体颗粒以防堵塞层析柱，分离过程操作繁琐、耗时长、成本高，此外存在扩散阻力导致分离效率下降。近年来快速发展的磁性亲和纳米技术给蛋白的分离纯化带来了革命性的发展，其特有的超顺磁特性简化了固液相分离过程，省去离心、过滤等繁杂的操作。纳米尺寸的粒径提供了极大的比表面积，提升目的蛋白的吸附量。在固定化酶研究领域，磁性亲和纳米材料可以作为载体实现酶的一步纯化固定化，简化了固定化酶制备过程。此外，将酶固定在磁性的材料上，在应用的过程中可以通过磁分离将催化剂从反应液中迅速分离，简化连续操作过程，节省成本。

虽然现有技术中已公开了一种用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性亲和磁珠，但是这种材料的制备过程复杂，需要多步化学的修饰过程，此外，商品化的产品价格较高，导致实际应用并不广泛。

近年来，多巴胺作为一种仿生粘附物质受到了密切的关注。研究发现多巴胺在弱碱性条件下能自聚形成聚多巴胺并包裹在几乎任何材料的表面。此外，在多巴胺自聚的同时，其所含有的邻苯二酚基团能与金属离子形成稳定的络合物。在生物技术领域，组氨酸标签融合蛋白系统的应用更加广泛，而到目前为止都还没出现将多巴胺用于组氨酸标签蛋白纯化的相关研究。并且，在组氨酸标签蛋白的固定化领域，到目前为止也还没有出现一种可实现对组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化的简单的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用，从而解决现有技术中的用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性亲和材料制备过程复杂，产品价格较高的缺陷，以及现有技术中缺少一种简单即可实现对组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒，包括：四氧化三铁纳米颗粒和包裹于所述四氧化三铁纳米颗粒外部的聚多巴胺涂层，所述聚多巴胺涂层表面螯合有镍离子。

所述磁性亲和纳米颗粒的粒径为200-300纳米。其中，四氧化三铁纳米颗粒的粒径大约为150-250纳米，聚多巴胺涂层包裹于四氧化三铁纳米颗粒外部，其厚度在25纳米左右。

根据本发明所提供的磁性亲和纳米颗粒具有较大的比表面积，提高了蛋白的吸附效率和吸附量；利用四氧化三铁纳米颗粒超顺磁的特性可简化蛋白分离纯化以及固定化的流程，同时可简化固定化酶后续使用的流程；利用聚多巴胺富有的邻苯二酚基团螯合镍离子，可实现对组氨酸标签蛋白的特异性结合。

本发明中四氧化三铁纳米颗粒优选的制备方法如下：将氯化铁、柠檬酸三钠、乙酸钠和乙二醇按照摩尔比1：0:17：36.5：89.5混合，搅拌溶解后，加热至200℃，反应12小时，冷却后通过磁分离，并用乙醇和水去清洗得到四氧化三铁纳米颗粒。

本发明中的磁性亲和纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：1）提供Tris-HCl缓冲液配置多巴胺溶液，加入四氧化三铁纳米颗粒，搅拌，通过磁分离得到聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；2）提供镍离子溶液，将步骤1）中制备得到的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒分散在所述镍离子溶液中，搅拌，通过磁分离获得所述磁性亲和纳米颗粒。

优选地，步骤1）中所述多巴胺溶液的浓度为0.1-5mg/mL，加入所述四氧化三铁纳米颗粒的浓度为0.5-5mg/mL（优选1mg/mL），反应时间为6-12小时，步骤2）中所述镍离子溶液的镍离子浓度20-200mM（优选100mM），加入聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒浓度为0.5-5mg/mL（优选1mg/mL），搅拌时间为1-6h。

本发明还提供了一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒的应用，包括用于组氨酸标签蛋白的纯化，以及用于组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化。

本发明所述的用于组氨酸标签蛋白的纯化的应用包括以下步骤：（1）将得到的螯合有镍离子的磁性亲和纳米颗粒悬浮液进行磁分离后除上清，加入平衡缓冲液平衡后磁分离除去上清；（2）加入细胞裂解上清液，振荡孵育，磁分离收集上清液标记为穿出液，再平衡缓冲液洗涤两次，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗涤液和洗脱液。用SDS-PAGE电泳检测纯化纯度。其中，所述的细胞裂解液为重组大肠杆菌裂解液，重组表达带有组氨酸标签的红色荧光蛋白。优选地，平衡缓冲液是指含有500mMNaCl的Tris-HCl缓冲液（pH7.5，50mM），洗脱缓冲液是指在所述的平衡缓冲液中添加300mM咪唑。

本发明所述的用于组氨酸标签蛋白的纯化的应用，所述的材料可重复使用，连续用于纯化4批次之后，其纯化效果没有显著下降。

本发明所述的用于组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化中的应用包括以下步骤：1）提供如上所述的磁性亲和纳米颗粒，加入平衡缓冲液平衡后磁分离除去上清；2）向步骤1）中平衡后的磁性亲和纳米颗粒中加入细胞裂解上清液，振荡孵育，磁分离收集所述磁性亲和纳米颗粒，获得固定化酶；其中，所述细胞裂解上清液含有组氨酸标签蛋白，所述组氨酸标签蛋白通过所述磁性亲和纳米颗粒得到了一步纯化固定化。

优选地，所述细胞裂解上清液为重组大肠杆菌裂解上清液。

所述重组大肠杆菌重组表达带有组氨酸标签的转氨酶。

优选地，平衡缓冲液是指含有500mMNaCl的Tris-HCl缓冲液（pH7.5，50mM）。

所述固定化酶的比活相对所述细胞裂解上清液的比活提高了两倍。

所述固定化酶具有良好的热稳定性和酸碱耐受度，并且具有良好的重复使用性，反复使用10批次之后，其活力仍保留在79%以上。

本发明提供了一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用。所提供的磁性亲和纳米颗粒的粒径为200-300纳米，具有较大的比表面积，提高了蛋白的吸附效率和吸附量；采用具有超顺磁特性的四氧化三铁纳米颗粒作为载体，在其表面通过多巴胺自聚形成的聚多巴胺膜进行修饰得到可以与镍离子高效螯合的磁性亲和纳米颗粒，最终实现对组氨酸标签蛋白的快速、高效、简便的纯化以及对组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化。并且该磁性纳米亲和颗粒制备过程简单，成本低，采用该材料用于纯化组氨酸标签蛋白操作流程简便，特异性高，采用该材料用于组氨酸标签蛋白的固定化选择性好，吸附量高，固定化酶稳定性好，便于重复使用。因此本发明要求保护的技术方案具有广泛的应用前景。

此外，本发明通过如此简单的方法对载体进行修饰，进而实现了组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化，在生物催化领域具有重要的应用价值，为实现酶的固定化开拓了一种新思路。

附图说明

图1是将本发明的磁性亲和纳米颗粒用于分离纯化组氨酸标签融合红色荧光蛋白的电泳图结果，其中，M：蛋白质分子量标准；1：细胞裂解液；2：穿出液；3：洗脱液；

图2是将本发明的磁性亲和纳米颗粒用于多批次分离纯化组氨酸标签融合红色荧光蛋白的电泳图结果，其中，M：蛋白质分子量标准；1：细胞裂解液；2：穿出液；3：第一批洗脱液；4：第二批洗脱液；5：第三批洗脱液；6：第四批洗脱液；7：第五批洗脱液；

图3是将本发明的磁性亲和纳米颗粒用于一步纯化固定化组氨酸标签融合转氨酶蛋白的电泳图结果，其中，M：蛋白质分子量标准；1：细胞裂解液；2：固定化上清液；3：固定化酶；

图4是根据本发明制备得到的固定化转氨酶连续10批次催化反应活力的变化图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1磁性亲和纳米颗粒的制备

称取3.25g FeCl₃和1.0g Na₃Cit·2H₂O加入到100mL乙二醇中，搅拌溶解后加入60g NaAc，搅拌30分钟后置于油浴锅内，加热至200℃，反应12小时。冷却后用磁铁分离黑色固体颗粒除去上清，用乙醇和水洗涤材料数遍后得到四氧化三铁纳米颗粒。

取0.1g上述四氧化三铁纳米颗粒分散在100mL Tris-HCl缓冲液中（10mM，pH8.5），超声分散15分钟，加入0.1g盐酸多巴胺。室温搅拌反应6小时后，通过磁铁分离得到聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒。

配置浓度为100mM的NiSO₄溶液，加入上述的聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒，室温搅拌反应2小时后，磁分离得到镍离子螯合的磁性亲和纳米颗粒。

通过SEM、XPS、FT-IR、EDX等分析方法对材料合成步骤进行了表征分析，结果表明所合成的四氧化三铁纳米颗粒大小在200纳米左右，通过多巴胺修饰后颗粒大小增加至250纳米左右，说明聚多巴胺涂层的厚度在25纳米左右。此外，XPS和EDX的分析结果表明，镍离子能有效的螯合到材料表面。

根据本发明所制备的磁性亲和纳米颗粒粒径实际并不局限于250纳米，理论上粒径越小其吸附能力越大，但是粒径太小又会引起饱和磁强度降低，也就是说通过磁分离的效率低，甚至会因回收不彻底而损失，通过实验摸索，本申请的发明人发现该磁性亲和纳米颗粒的粒径在200-300纳米范围内时其吸附性能和磁强度均较好，其中最优选为250纳米。

实施例2组氨酸标签融合的红色荧光蛋白的分离纯化

本实施例选用产红色荧光蛋白重组大肠杆菌，具体可参见Kaisa Hakkila,Mikael Maksimow,Matti Karp,Marko Virta,Reporter Genes lucFF,luxCDABE,gfp,and dsred Have Different Characteristics in Whole-Cell Bacterial Sensors,Analytical Biochemistry,Volume301,Issue2,Pages235–242。通过发酵技术，诱导表达离心得到重组大肠杆菌菌体，重悬于平衡缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.5，500mMNaCl）中，通过超声破碎后离心收集上清液，得到含有重组红色荧光蛋白的细胞裂解液。通过Bradford法测定上清液中总蛋白浓度，用平衡缓冲液稀释成0.5mg/mL待用。

取10mg实施例1中制备的螯合镍离子的磁性亲和纳米颗粒，通过磁分离除去上清，加入1mL平衡缓冲液平衡盐离子后磁分离去除上清。加入1mL上述制备的细胞裂解液，室温摇床振荡孵育5分钟后收集上清，标记为穿出液。用平衡缓冲液清洗材料2遍后，加入1mL洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.5，500mMNaCl，300mM咪唑）进行洗脱，清洗和洗脱过程可适当进行搅拌或振荡，收集洗脱液。

通过SDS-PAGE对上述纯化过程中的穿出液、洗脱液进行了检测，结果如图1所示。相对于细胞裂解液（泳道1）而言，穿出液（泳道2）中目的蛋白的条带显著减少，而其他的蛋白条带变化不明显，通过洗脱后，得到了目的蛋白的单一条带（泳道3）。上述的结果说明实施例1中制备的磁性亲和纳米颗粒对组氨酸标签蛋白的特异性好，能有效地用于组氨酸标签蛋白的分离纯化。

实施例3磁性亲和纳米颗粒连续重复纯化重组红色荧光蛋白

为了考察所合成的磁性亲和纳米颗粒在纯化组氨酸标签蛋白应用中的稳定性，我们采用实施例1中制备的磁性亲和纳米颗粒连续多批次的分离纯化重组红色荧光蛋白。分离纯化的过程如实施例2所述，在每次纯化完成后，用平衡缓冲液平衡该磁性亲和纳米颗粒三次，用于下一批次的分离纯化过程。将每次收集的洗脱液通过SDS-PAGE进行检测，结果如图2所述。结果表明直至第五批次都能洗脱得到目的蛋白的单一条带，也就是说多批次的使用对该磁性亲和纳米颗粒的特异性没有明显的改变，只是随着重复次数的增加，会略微降低对目的蛋白的吸附量。

实施例4组氨酸标签融合的转氨酶的一步纯化固定化

本实施例选用产重组转氨酶的重组大肠杆菌，可参见Ni K,Zhou X,ZhaoL,Wang H,Ren Y,et al.(2012)Magnetic Catechol-Chitosan with BioinspiredAdhesive Surface:Preparation and Immobilization ofω-Transaminase.PloS one7:e41101.）。通过发酵技术，诱导表达离心得到重组大肠杆菌菌体，重悬于PBS缓冲液中，通过超声破碎后离心收集上清液，得到含有重组红色荧光蛋白的细胞裂解液。通过Bradford法测定上清液中总蛋白浓度，用平衡缓冲液稀释成0.5mg/mL待用。

取3mg实施例1中制备的螯合镍离子的磁性亲和纳米颗粒，通过磁分离除去上清，加入0.5mLPBS平衡后磁分离去除上清。加入0.5mL上述制备的细胞裂解液，室温振荡孵育30分钟后收集上清，测定上清中的蛋白浓度，通过如下公式计算固定化率为48%。通过SDS-PAGE对固定化上清和固定化酶进行了直接的检测，结果如图3所示，在固定化后的上清液中（泳道2），目的蛋白的条带几乎消失，而在固定化酶的电泳条带中（泳道3），则观察到了单一的蛋白条带。结果说明虽然固定化率只有48%，但是细胞裂解液中带有组氨酸标签的目的蛋白已经全部被固定在材料上，而其他的杂蛋白则没有被固定。

固定化酶的酶活通过测定其催化苯乙胺和丙酮酸生成苯乙酮和丙氨酸的效率来检测，具体的反应体系如下：1mL Tris-HCl缓冲液（pH8.0，100mM）含有10mM苯乙胺、10mM丙酮酸钠、0.1mM PLP和适量的固定化酶或相应游离的酶。在37℃反应10分钟后加入0.1mL1M HCl终止反应。通过HPLC检测产物苯乙酮的生成量计算固定化酶活。结果发现通过该方法制备得到的固定化酶的比活相比较于细胞裂解液而言提高了近2倍，这主要得益于材料对组氨酸标签蛋白的特异性。

实施例5固定化转氨酶的活性评价

在本实施例中考察了实施例4中制备的固定化转氨酶的稳定性和重复使用性。通过将该固定化酶在不同pH的缓冲液中孵育后测定其残余活性，考察其酸碱耐受性。结果表明相对于游离的转氨酶而言，固定化酶在更宽的pH值范围内展现出了更好的稳定性，说明固定化能有效提高酶的酸碱耐受性。同样的，将固定化酶在不同温度下孵育后测定其残余活力的实验结果也反应了固定化酶相对于游离酶而言，具有更好的热稳定性。

固定化酶的重复使用性的考察采用了实施例4所述的反应体系，在每批次反应结束之后，通过磁分离回收固定化酶，用于下一批次的反应。实验结果如图4所述，固定化酶展现出了较好的重复使用性，在反复使用10批次之后，其活力仍保留在70%以上。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒，其特征在于，包括：四氧化三铁纳米颗粒和包裹于所述四氧化三铁纳米颗粒外部的聚多巴胺涂层，所述聚多巴胺涂层表面螯合有镍离子。

2.根据权利要求1所述的磁性亲和纳米颗粒，其特征在于，所述磁性亲和纳米颗粒的粒径为200-300纳米。

3.一种根据权利要求1所述的磁性亲和纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供Tris-HCl缓冲液配置多巴胺溶液，加入四氧化三铁纳米颗粒，搅拌，通过磁分离得到聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒；

2）提供镍离子溶液，将步骤1）中制备得到的聚多巴胺包裹的四氧化三铁纳米颗粒分散在所述镍离子溶液中，搅拌，通过磁分离获得所述磁性亲和纳米颗粒。

4.一种根据权利要求1所述的磁性亲和纳米颗粒在组氨酸标签蛋白的纯化中的应用。

5.一种根据权利要求1所述的磁性亲和纳米颗粒在组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供根据权利要求1所述的磁性亲和纳米颗粒，加入平衡缓冲液平衡后磁分离除去上清；

2）向步骤1）中平衡后的磁性亲和纳米颗粒中加入细胞裂解上清液，振荡孵育，磁分离收集所述磁性亲和纳米颗粒，获得固定化酶；

其中，所述细胞裂解上清液含有组氨酸标签蛋白，所述组氨酸标签蛋白通过所述磁性亲和纳米颗粒得到了一步纯化固定化。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞裂解上清液为重组大肠杆菌裂解上清液。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌重组表达带有组氨酸标签的转氨酶。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固定化酶的比活相对所述细胞裂解上清液的比活提高了两倍。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固定化酶具有良好的热稳定性和酸碱耐受度，并且具有良好的重复使用性。

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