CN107406841A - 对外部环境变化的耐性提高的固定化蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供一种能够用于蛋白质的质谱分析用样品的制备的、对外部环境变化的稳定性优异的高活性的固定化蛋白酶。根据本发明，可提供一种固定化蛋白酶及其制造方法，其特征在于，在纳米颗粒表面固定有粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶。本发明的固定化蛋白酶能够不受外部环境变化的影响地维持高活性，因此例如对供于临床被检体中的蛋白质质谱分析的样品的制备有效。

Description

对外部环境变化的耐性提高的固定化蛋白酶
技术领域
本发明涉及一种能够用于蛋白质的质谱分析用样品的制备的、对外部环境变化的耐性提高的固定化蛋白酶。
背景技术
随着质谱分析技术的发展，对于蛋白质，也在进行应对多检体处理的高通量解析平台的开发，但作为其开发基础的蛋白质解析则落后于基因组解析。其原因在于，就基因组解析而言，存在PCR、质粒扩增等多种用于制备样品的通用性好且定量性的方法，与此相对地，蛋白质解析方面则未能建立再现性高的样品制备技术。第一，蛋白质尚未建立起有效的扩增手段。第二，在质谱分析对象为抗体等巨大蛋白时，由于难以直接进行分析，因此作为其前处理，虽然用蛋白酶来消化蛋白质、进行片段化，但无法充分确保该消化反应的再现性。
作为提高蛋白质消化反应的再现性的尝试，进行了使蛋白酶结合在固相载体上的尝试。截至目前，有多个报道指出，通过使胰蛋白酶等蛋白酶结合在玻璃表面、膜、中空纤维、高分子、凝胶、溶胶、多孔二氧化硅等固相载体上，从而使酶活性、反应速度提高(非专利文献1～5等)。此外还报道了：在通过限制蛋白酶接近底物而选择性地水解蛋白质的方法中，使用固定化有胰蛋白酶的纳米颗粒(非专利文献6)。通过是否能重复使用、是否能用于短时间的消化反应、底物蛋白的肽序列回收率(序列覆盖度：sequence coverage)是否充分之类的指标，评价了这些固定化蛋白酶的性能。但是，现有的任一报道都是定性的评价，而不是基于定量的物理化学性质的评价。此外，关于对温度/pH、固定化蛋白酶的制备/与底物蛋白的反应中使用的各种试剂等的外部环境变化的稳定性，也没有进行任何研究。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Junfeng Ma,et.al.,Organic-Inorganic Hybrid SilicaMonolith Based Immobilized Trypsin Reactor with High Enzymatic Activity,Analytical Chemistry,2008,80,2949
非专利文献2：J.Robert Freije,Et.al.,Chemically Modified,ImmobilizedTrypsin Reactor with Improved Digestion Efficiency,Journal of ProteomeResearch,2005,4,1805
非专利文献3：Maria T.Dulay,et.al.,Enhanced Proteolytic Activity ofCovalently Bound Enzymes in Photopolymerized Sol Gel,Analytical Chemistry,2005,77,4604
非专利文献4：Jana Krenkova,et.al.,Highly Efficient Enzyme ReactorsContaining Trypsin and Endoproteinase LysC Immobilized on Porous PolymerMonolith Coupled to MS Suitable for Analysis of Antibodies,AnalyticalChemistry,2009,81,2004
非专利文献5：Yan Li,et.al.,Immobilization of Trypsin onSuperparamagnetic Nanoparticles for Rapid and Effective Proteolysis,Journalof Proteome Research,2007,6,3849
非专利文献6：Noriko Iwamoto et al.,Selective detection ofcomplementarity determining regions of monoclonal antibody by limitingprotease access to the substrate：nanosurface and molecular-orientationlimited proteolysis,Analyst,2014,139,576
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种能够用于制备蛋白质的质谱分析用样品的、对外部环境变化的稳定性优异的高活性的蛋白酶。
用于解决问题的方案
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过将胰蛋白酶等蛋白酶固定化在纳米颗粒上，从而即使是未进行还原性二甲基化等的功能强化的低纯度蛋白酶，也可以在相对宽泛的温度和pH下维持高活性，并且也不受有机溶剂、表面活性剂的影响，直至完成了本发明。
即，本发明包含以下的发明。
(1)一种固定化蛋白酶，其特征在于，在纳米颗粒表面固定化有粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解(autolysis)处理的蛋白酶。
(2)根据(1)所述的固定化蛋白酶，其中，纳米颗粒的粒径为100～500nm。
(3)根据(1)或(2)所述的固定化蛋白酶，其中，纳米颗粒为磁性纳米颗粒。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的固定化蛋白酶，其中，蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶、ArgC蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或二肽基肽酶。
(5)根据(1)～(3)中任一项所述的固定化蛋白酶，其中，耐自体分解处理为还原性二甲基化处理。
(6)根据(5)所述的固定化蛋白酶，其中，蛋白酶为胰蛋白酶或赖氨酰肽链内切酶。
(7)一种固定化蛋白酶的制备方法，其包含如下工序：在纳米颗粒表面固定化粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶。
(8)一种对蛋白酶赋予对外部环境变化的耐性的方法，其在纳米颗粒表面固定化粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶，从而对蛋白酶赋予对外部环境变化的耐性。
(9)根据(7)或(8)所述的方法，其中，蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶、ArgC蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或二肽基肽酶。
(10)根据(7)或(8)所述的方法，其中，耐自体分解处理为还原性二甲基化处理。
(11)根据(10)所述的方法，其中，蛋白酶为胰蛋白酶或赖氨酰肽链内切酶。
本申请基于2015年3月9日提出的日本专利申请2015-046380主张优先权，包含了该专利申请说明书中所记载的内容。
发明的效果
本发明的在纳米颗粒表面固定化有蛋白酶的固定化蛋白酶不受温度/pH、添加物等外部环境变化的影响，可以维持高活性，稳定性优异。因此，通过在供于利用质谱分析法进行的蛋白质的定量或鉴定的肽片段的样品制备中使用本发明的固定化蛋白酶，从而能够提高通过质谱分析得到的数据的可靠性和再现性。本发明的固定化蛋白酶不论固定在纳米颗粒上的蛋白酶的种类、纯度如何，都能够发挥质谱分析级别的优异性能。因此，将本发明的固定化蛋白酶作为利用质谱分析法进行的蛋白质的定量用或鉴定用试剂盒的附带试剂使用时更为经济，能提高试剂的性价比。
附图说明
图1：图1示出在温度25℃、各pH下(pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、添加物(尿素、OTG、MeCN)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图2：图2示出在温度37℃、各pH下(pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、添加物(尿素、OTG、MeCN)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图3：图3示出在温度45℃、各pH下(pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、添加物(尿素、OTG、MeCN)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图4：图4示出在温度50℃、各pH下(pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、添加物(尿素、OTG、MeCN)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图5：图5示出在温度60℃、各pH下(pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、添加物(尿素、OTG、MeCN)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图6：图6示出在温度70℃、各pH下(pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、添加物(尿素、OTG、MeCN)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图7：图7示出在温度37℃、pH8.0、添加物(DTT、TCEP、CHAPS、SDS、Tween 20、TritonX-100、NP-40)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图8：图8示出在温度37℃、pH8.0、添加物(NaCl、AS、IAA、海藻糖、甘油、EDTA)存在下的胰蛋白酶的酶活性(上图：固定化胰蛋白酶(FG-Gold、FG-TPCK)、下图：未固定胰蛋白酶(Gold、TPCK))。
图9：图9示出在温度37℃、各pH下(pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)的胰蛋白酶的酶活性(FG-Gold、FG-TPCK：纳米颗粒固定化胰蛋白酶、CR-TPCK、AR-TPCK：细颗粒固定化胰蛋白酶)。
图10：图10示出在温度37℃、pH8.0、添加物(尿素、NaCl、AS、IAA、EDTA)存在下的胰蛋白酶的酶活性(FG-Gold、FG-TPCK：纳米颗粒固定化胰蛋白酶、CR-TPCK、AR-TPCK：细颗粒固定化胰蛋白酶)。
图11：图11示出在温度37℃、pH8.0、添加物(海藻糖、甘油)存在下的胰蛋白酶的酶活性(FG-Gold、FG-TPCK：纳米颗粒固定化胰蛋白酶、CR-TPCK、AR-TPCK：细颗粒固定化胰蛋白酶)。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明的固定化蛋白酶的特征在于，其是使用纳米颗粒作为固相载体并在该载体表面固定化蛋白酶而成的。本发明的固定化蛋白酶通过将蛋白酶固定化在纳米颗粒上，从而即使是粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶，也能够不受外部环境变化的影响地维持高活性。
本发明中使用的纳米颗粒只要是能够在其表面多点结合有蛋白酶，则对其大小没有限定，由于胰蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶等蛋白酶的分子直径为5nm左右，因此其粒径优选为100～500nm，更优选150～400nm，进一步优选200～300nm。粒径大时(例如微米级水平)，需要考虑在添加剂等的影响下颗粒的收缩，而为纳米颗粒且在颗粒表面进行固定化时在不需要考虑该收缩，能够制作更具有稳定性的酶。这里，“粒径”是指颗粒分布中出现频度最高的粒径，即众数径。
对纳米颗粒进行固定化的蛋白酶量根据纳米颗粒的粒径、蛋白酶种类/纯度等而不同，相对于纳米颗粒1重量％，通常为1～10重量％、优选2～5重量％。
作为纳米颗粒的种类，优选能够分散或悬浮于水性介质、容易通过磁性分离或磁性沉淀分离从分散液或悬浮液中回收的磁性纳米颗粒。此外，就不易发生聚集这样的观点而言，更优选其表面被有机聚合物包覆的磁性纳米颗粒。作为磁性纳米颗粒的基材，可列举出氧化铁(磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3))、铁氧体(Fe/M)3O4等铁磁性合金。铁氧体(Fe/M)3O4中，M表示可以与铁离子一起使用而形成磁性金属氧化物的金属离子，典型的是使用Co2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+等。此外，作为包覆磁性纳米颗粒的有机聚合物，可列举出聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)、GMA与苯乙烯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酸甲酯(PMA)等。作为被有机聚合物包覆的磁性纳米颗粒的具体例子，可列举出FG珠、SG珠、Adembeads、nanomag等。作为市售品，适宜使用例如多摩川精机株式会社制的FG珠(用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(聚GMA)包覆铁氧体颗粒而成的粒径约200nm的聚合物磁性纳米颗粒)。
为了抑制非特异性蛋白质的吸附和蛋白酶的选择性固定化，上述纳米颗粒优选用能够与蛋白酶结合的间隔分子(spacer molecule)进行了修饰。通过借助间隔分子而对蛋白酶进行固定化，从而可抑制蛋白酶从纳米颗粒表面脱离，可提高蛋白酶消化的区域选择性。此外，通过调节间隔物的分子尺寸，从而还能够使蛋白酶选择性地接近底物蛋白的期望位置，从而提高区域选择性。
间隔物优选能够与蛋白酶结合且不使蛋白酶失活的物质。从对固定化在纳米颗粒表面的蛋白酶的接近范围进行控制的观点出发，间隔物优选分子直径小的物质。间隔物的分子直径优选5nm以下，更优选3nm以下，进一步优选2nm以下。此外，间隔物的分子量优选2000以下，更优选1500以下，进一步优选1000以下。
可以以上述分子直径来固定化蛋白酶的间隔分子优选非蛋白质，优选在末端具有氨基、羧基、酯基、环氧基、甲苯磺酰基、羟基、硫醇基、醛基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、叠氮基、生物素、亲和素、螯合物等官能团的分子。例如，在胰蛋白酶的固定中，优选具有经活化的酯基的间隔分子。此外，在间隔分子中，除了上述官能团以外的间隔物的臂部分可使用：聚乙二醇和其衍生物、聚丙二醇和其衍生物、聚丙烯酰胺和其衍生物、聚乙烯亚胺和其衍生物、聚(环氧乙烷)和其衍生物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)和其衍生物等亲水性分子。
由这样的间隔分子进行了表面修饰的纳米颗粒也有销售，利用这些市售品即可。例如，用具有被N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯基(活性酯基)的间隔分子进行了修饰的纳米颗粒以商品名“FG beads NHS”(多摩川精机株式会社)的形式进行销售。
对在纳米颗粒的表面固定化蛋白酶的方法没有特别限定，可以根据蛋白酶和纳米颗粒(或修饰纳米颗粒表面的间隔分子)的特性等采用适宜的方法，但优选介由上述间隔分子的官能团进行的纳米颗粒与蛋白酶的胺偶联法。例如，可以用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将纳米颗粒表面所修饰的羧基酯化，形成活化酯基，再使蛋白酶的氨基与该酯基结合。该偶联反应可以使1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、双(2,6-二异丙基苯基)碳二亚胺(DIPC)等碳二亚胺在缩合剂存在下进行。此外，还可以使用戊二醛、2官能性琥珀酰亚胺、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3)、磺酰氯、马来酰亚胺、吡啶基二硫化物等的交联剂，使蛋白酶的氨基与纳米颗粒表面所修饰的氨基结合。
介由间隔分子的官能团进行的纳米颗粒与蛋白酶的偶联法可以通过简单的操作来进行，即，在纳米颗粒的悬浮液中添加蛋白酶溶液，在一定的条件下混合搅拌。对反应条件没有特别限定，例如，将添加有蛋白酶的纳米颗粒的悬浮液在温度1～10℃、pH7.0下以50～200rpm搅拌0.5～1小时。
在纳米颗粒表面固定化蛋白酶后，优选对纳米颗粒表面的未结合蛋白酶的活性部分进行惰性化。例如，当纳米颗粒表面存在未固定化蛋白酶的间隔分子时，有时未结合的间隔分子与试样中的杂质等结合而对蛋白酶消化产生不良影响，或者发生由蛋白酶消化所产生的肽片段被固定化在纳米颗粒等的不良情况。在固定化蛋白酶后，对未结合的间隔分子进行封闭，从而可抑制这样的不良情况。作为使未结合蛋白酶的活性部分惰性化的方法，优选化学修饰。例如，活化酯基可以通过与伯胺的反应形成酰胺键，从而使其惰性化。
在本发明中，在纳米颗粒上固定化的蛋白酶的种类根据作为利用质谱分析进行定量或鉴定的对象的蛋白质种类进行适宜选择即可，不进行限定，例如可列举出：粗纯化的或未进行耐自体分解处理的、胰蛋白酶(在碱性氨基酸残基(Arg和Lys)的C末端侧将肽切断)、糜蛋白酶(在芳香族氨基酸残基(Phe、Tyr和Trp)的C末端侧将肽切断)、赖氨酰肽链内切酶(在Lys残基的C末端侧将肽切断)、V8蛋白酶(在Glu残基的C末端侧将肽切断)、AspN蛋白酶(在Asp残基的N末端侧将肽切断)、ArgC蛋白酶(在Arg残基的C末端侧将肽切断)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二肽基肽酶等。上述蛋白酶之中，本发明中特别优选使用胰蛋白酶。胰蛋白酶的分子直径小且活性位点存在于分子的内部。因此，活性位点能够接近底物蛋白的区域受到限制，从而能够提高蛋白酶消化的区域选择性。特别是底物蛋白为抗体时，优选使用胰蛋白酶作为蛋白酶。
本发明中使用的蛋白酶为粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶，纯度不限。因此，在使用市售的蛋白酶的情况下，不限于质谱分析级、序列确定(序列)级的蛋白酶，也可以是来自生物体的天然的蛋白酶。例如，在为胰蛋白酶的情况下，来自生物体的天然胰蛋白酶通过自体分解而生成显示糜蛋白酶样活性的伪胰蛋白酶，因此用N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)进行处理来降低糜蛋白酶活性、或对胰蛋白酶的赖氨酸残基进行还原性二甲基化处理来提高对于自体分解的抵抗性，经上述处理的处理物作为质谱分析级的胰蛋白酶而销售，但本发明使用的胰蛋白酶也可以是未进行这样的赖氨酸残基的还原性二甲基化处理的胰蛋白酶。
以上述方式而结合在纳米颗粒上的蛋白酶使对外部环境变化的耐性飞跃性提高。在此，外部环境是指温度(热)、pH、有机溶剂、蛋白质变性剂、蛋白质还原/烷基化剂、蛋白质保护/稳定化剂、蛋白质的增溶用表面活性剂、盐析剂、盐类等。作为蛋白质变性剂，例如可列举出：尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇(DTT)、硫醇基乙醇等。作为蛋白质还原/烷基化剂，例如可列举出：三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、碘乙酰胺(IAA)等。作为蛋白质保护/稳定化剂，例如可列举出：EDTA等螯合剂；甘油等多元醇；海藻糖、葡萄糖、蔗糖等糖类等。作为有机溶剂，例如可列举出：乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇等。作为表面活性剂，例如可列举出：聚氧乙烯系非离子表面活性剂(Triton X-100，Tween 20/40/60/80、Nonidet P-40(NP-40)等)、烷基糖苷系非离子表面活性剂(正辛基-β-D-葡萄糖苷(OG)、正辛基-β-D-硫代葡萄糖苷(OTG)、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、正壬基-β-D-麦芽糖苷(NG)等)、两性表面活性剂((3-[3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(CHAPSO)等)、阳离子性表面活性剂(十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等)。作为盐析剂，例如可列举出：硫酸铵(AS)；作为盐类，例如可列举出：氯化钠、氯化钾、乙酸钠、硫酸镁等。
在使用本发明的固定化蛋白酶对底物蛋白进行消化时，对其条件没有特别限定，可以采用与常规的蛋白酶消化同样的条件。例如，优选在调节成蛋白酶的最适pH附近的缓冲溶液中、通常在37℃左右的温度下孵育1小时～20小时左右。此外，对底物蛋白与固定化蛋白酶的混合量比也没有特别限制，以成为与底物蛋白的量相适应的蛋白酶量的方式进行设定即可。需要说明的是，常规的蛋白酶消化条件是底物蛋白：蛋白酶为100：1～10：1(重量比)左右。
基于由通过本发明的固定化蛋白酶进行的底物蛋白的消化所产生的肽片段来进行底物蛋白的鉴定、定量时，质谱分析是适合的。由于质谱分析可确定氨基酸序列，因而能够辨别肽片段是否为来自抗体等的特定蛋白质的肽片段。此外，基于峰强度可以确定试样中的肽片段浓度。对质谱分析中的离子化法没有特别限定，可采用电子电离(EI)法、化学电离(CI)法、电场解吸附(FD)法、快原子轰击(FAB)法、基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)法、电喷雾离子化(ESI)法等。对离子化后的试样的分析方法也没有特别限定，可根据离子化法适宜确定磁偏转型、四极(Q)型、离子阱(IT)型、飞行时间(TOF)型、傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)型等。此外，也可以使用三重四级杆型质谱分析装置等进行MS/MS分析或MS3以上的多级质谱分析。
本发明的固定化蛋白酶在固定化在纳米颗粒表面的状态下能够稳定地保持高活性，因此可以作为供于通过质谱分析法进行的蛋白质的定量或鉴定的肽片段样品的制备用试剂盒的构成要素来提供。本发明的固定化蛋白酶特别适合于抗体的检测、定量，通过对Fab区进行选择性蛋白酶消化、对所得到的肽片段试样进行质谱分析，能够确定包含互补性决定区的氨基酸序列的肽片段的序列和量。本发明的固定化蛋白酶此外还可以用于药代动力学分析、使用了抗原抗体反应的相互作用解析、各种相互作用组解析、免疫沉淀蛋白的鉴定等基础研究、抗体药物等的生物分子药物的序列解析、品质保证、仿制药的等效性确认试验等。
通过以下的实施例对本发明进一步进行具体说明，但本发明不受实施例限定。
以下的实施例中使用的试剂等如无特别记载则由和光纯药工业公司获得。此外，以下的缓冲液用精密pH计调节了pH。
HEPES缓冲液：25mM HEPES-NaOH，pH 7.0
乙醇胺缓冲液：1M ethanolamine-HCl，pH 8.0
Tris缓冲液：25mM Tris-HCl，pH 8.0
(实施例1)固定化蛋白酶的制备
作为蛋白酶固定化用的纳米颗粒，使用用羧基被N-羟基琥珀酰亚胺活化的间隔物(参照下述化学式(L为与纳米颗粒表面的结合位点)、间隔物的长度为1nm)修饰的、平均粒径190nm(分散范围±20nm)的FG珠(多摩川精机、FG beads NHS)。
在4℃下对FG珠1mg的异丙醇悬浮液50μL进行离心分离(15000rpm，5分钟)，使纳米颗粒沉淀，除去上清液之后，用甲醇清洗。将包含50μg蛋白酶的溶液溶解于200μL的HEPES缓冲液中而成的溶液加入至上述纳米颗粒中，使纳米颗粒悬浮。需要说明的是，在进行悬浮时，以不使悬浮液温度上升的方式进行了几秒钟的超声波处理。
在4℃下搅拌该纳米颗粒的悬浮液30分钟，然后在4℃下进行离心分离(15000rpm，5分钟)，使纳米颗粒沉淀，除去上清液。然后加入乙醇胺缓冲液200μL使颗粒悬浮，在4℃下搅拌30分钟，利用乙醇胺对纳米颗粒表面剩余的N-羟基琥珀酰亚胺基进行封闭，得到纳米颗粒固定化蛋白酶(50μg/mg固相)。然后，在4℃下进行离心分离(15000rpm，5分钟)，使纳米颗粒沉淀，除去上清液之后，重复2次利用Tris缓冲液进行的清洗和离心分离，使其悬浮在Tris缓冲液(100μL)中(悬浮液中的蛋白酶浓度：0.5μg/μL)。
(实施例2)酶稳定性试验1(纳米颗粒固定化蛋白酶与未固定蛋白酶的比较)
作为蛋白酶底物，使用N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(MW＝434.9)；作为蛋白酶，使用TrypsinGold，质谱分析级别(Promega Corporation制)(以下记作“Gold”)和Trypsin TPCK由牛胰腺处理而得到，产品号T1426(Sigma Aldrich公司制)(以下记作“TPCK”)这两种胰蛋白酶以及将“Gold”、“TPCK”分别按照实施例1记载的方法固定在纳米颗粒上的“FG-Gold”、“FG-TPCK”，在各种条件下进行酶反应，调查了酶稳定性。“Gold”是除了糜蛋白酶失活处理(TPCK处理)以外还实施了还原性二甲基化处理、从而对自体分解具有抵抗性、不依赖于温度和pH而在宽泛的范围内维持高活性的质谱分析级的蛋白酶。另一方面，“TPCK”虽然进行了糜蛋白酶失活处理，但由于纯化度低而残留来自杂质的糜蛋白酶，不仅未完全抑制糜蛋白酶活性而且也未进行还原性二甲基化等的耐自体分解处理等，因此缺乏耐热性、pH容许范围以及适合缓冲液及其pH都受限的蛋白酶。
将蛋白酶底物以终浓度为10mM的方式溶解于DMSO中，作为储备溶液。按照表1的比例混合底物溶液、反应缓冲液、未固定(游离)蛋白酶溶液或固定化蛋白酶悬浮液，从而制备了酶反应液。
[表1]
酶反应液组成 含量
底物溶液 10μL(100nmol)
反应缓冲液(25mM Tris) 500μL
固定化蛋白酶悬浮液(0.5mg/mL) 25μL
未固定蛋白酶溶液(0.5mg/mL) 5μL
使用所制备的酶反应液，设为以下条件来进行酶反应。以达到规定终浓度的方式向反应缓冲液(25mM Tris)中添加(c)的添加剂。
(a)温度
25℃、37℃、45℃、50℃、60℃、70℃
(b)pH
6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0
(c)添加剂(蛋白质变性剂、表面活性剂、有机溶剂等/温度37℃，pH 8.0)
1M、2M尿素(脲)
0.1％正辛基-β-D-硫代葡萄糖苷(OTG)
10％、20％、50％乙腈(MeCN)
5mM、10mM、20mM二硫代苏糖醇(DTT)
1mM、5mM、10mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)
0.1％CHAPS
0.1％SDS
0.1％Tween 20
0.1％Triton X-100
0.1％NP-40
50mM、150mM、500mM NaCl
50mM、150mM、500mM AS
50mM IAA
50mM、500mM海藻糖(Trehalose)
10％甘油(Glycerol)
10mM EDTA
使酶反应按照各条件在涡流搅拌下进行1.5小时。反应结束时，加入2N-HCl或10％硫酸50μL而使酶反应完全停止。用MultiScreen过滤板过滤而除去纳米颗粒，然后分注到透明底培养板中，使用酶标仪(TECAN Infinite M200Pro)测定从底物游离出的对硝基苯胺(p-NA)的吸光度(405nm，吸光系数＝9920M-1/cm-1)，评价酶活性。
将结果示于图1～8。Gold不论pH如何以及添加物存在与否，在25～70℃这一非常宽泛的温度范围内均具有胰蛋白酶活性，与此相对地，TPCK的胰蛋白酶活性弱，特别是60℃以上时显著低(参照图1～6的下图)。与此相对地，固定在FG珠上的TPCK(FG-TPCK)的结果是：不论温度、pH如何，胰蛋白酶活性均飞跃性增加，超过固定在FG珠上的Gold(FG-Gold)或为相同程度(图1～6的上图)。特别是，在作为蛋白组学中常用的蛋白质变性剂的尿素存在下，TPCK在胰蛋白酶的最适pH(pH8)下为等同于失去胰蛋白酶活性的状态，而FG-TPCK则维持了超过FG-Gold的活性(参照图1～6的上图)。在添加其它添加物(蛋白质变性剂、表面活性剂、有机溶剂等)的环境下，FG-TPCK与TPCK相比胰蛋白酶活性也显著增加，FG-TPCK和FG-Gold则显示出几乎相同的行为(参照图7、8)。
(实施例3)酶稳定性试验2(纳米颗粒固定化蛋白酶和通常颗粒固定化蛋白酶的比较)
作为纳米颗粒，使用FG珠(多摩川精机、FG beads NHS)，与实施例1同样地将“Gold”、“TPCK”分别固定化来制备“FG-Gold”、“FG-TPCK”，使其悬浮于Tris缓冲液(100μL)中(悬浮液中的蛋白酶浓度：0.5μg/μL)。作为通常颗粒(细颗粒)固定化蛋白酶，使用市售品的Promega Immobilized胰蛋白酶(纤维素树脂)(以下记作“CR-TPCK”)或PierceImmobilized TPCK胰蛋白酶(4％交联琼脂糖树脂)(以下记作“AR-TPCK”)。颗粒用25mMTris pH8.0清洗5次，然后制成75ml的浆料。
将蛋白酶底物(N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸-p-硝基苯胺盐酸盐)以终浓度为10mM的方式溶解于DMSO中，作为储备溶液。对于反应缓冲液(25mM Tris)500μL加入底物溶液50μL、纳米颗粒固定化蛋白酶悬浮液25μL或通常的颗粒(细颗粒)固定化蛋白酶悬浮液12.5μL，制备酶反应液。
使用所制备的酶反应液，设为以下条件来进行酶反应。以达到规定终浓度的方式向反应缓冲液(25mM Tris)中添加(b)的添加剂。
(a)pH(温度：37℃)
6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0
(b)添加剂(蛋白变性剂等/pH 8.0、温度37℃)
1M、2M尿素(脲)
50mM、150mM、500mM NaCl
50mM、150mM、500mM AS
50mM IAA
10mM EDTA
50mM、500mM海藻糖(Trehalose)
10％甘油(Glycerol)
使酶反应按照各条件在涡流搅拌下进行1.5小时。反应结束时，加入10％硫酸50μL而使酶反应完全停止。用MultiScreen过滤板过滤而除去纳米颗粒，然后分注到透明底培养板中，用酶标仪(TECAN Infinite M200Pro)测定从底物游离出的对硝基苯胺(p-NA)的吸光度(405nm，吸光系数＝9920M-1/cm-1)，评价酶活性。需要说明的是，关于上述市售品的酶活性评价，以将pH8.0的酶活性设为1的相对酶活性来进行比较。
将结果示于图9～11。在中性附近(pH7.0～7.5)时，与细颗粒固定化蛋白酶相比，纳米颗粒固定化蛋白酶的酶活性更高，此外，可以在包括碱性侧在内的宽泛的pH范围内维持活性(图9)。根据该结果，纳米颗粒固定化蛋白酶在例如消化pH7左右的人体液、血液等的样品的情况下是有利的。此外，在添加蛋白质变性剂(尿素)、盐类(NaCl)、盐析剂(AS)、蛋白质还原/烷基化剂(IAA)、蛋白质保护/稳定化剂(EDTA、海藻糖、甘油)的环境下，与细颗粒固定化蛋白酶相比，纳米颗粒固定化蛋白酶显示出更高的酶活性(图10、11)。特别是，细颗粒固定化蛋白酶不具有对NaCl的耐性，因此NaCl是致命的，但纳米颗粒固定化蛋白酶即使在高浓度NaCl存在下也是稳定的。关于细颗粒固定化蛋白酶，确认到在稳定化剂存在时酶活性反倒降低的倾向。与此相对，为纳米颗粒固定化蛋白酶的情况下，即使存在稳定化剂酶活性也不降低，我们认为原因在于，颗粒为纳米尺寸，因此不易发生与溶液的粘性增加相伴随的分散性(与底物的接触概率)的降低。综上，可以说纳米颗粒固定化蛋白酶适合应用于以粗纯化的生物试样中的蛋白质等为分析对象的临床检査试验等。
产业上的可利用性
本发明能够利用在抗体药品、蛋白质制剂等的生物药品的开发时的产品评价和分析试验、用于医疗现场的临床检查的试剂的制造领域。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请作为参考原样纳入本说明书中。

Claims (11)

1.一种固定化蛋白酶，其特征在于，在纳米颗粒表面固定化有粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的固定化蛋白酶，其中，纳米颗粒的粒径为100～500nm。
3.根据权利要求1或2所述的固定化蛋白酶，其中，纳米颗粒为磁性纳米颗粒。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的固定化蛋白酶，其中，蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶、ArgC蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或二肽基肽酶。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的固定化蛋白酶，其中，耐自体分解处理为还原性二甲基化处理。
6.根据权利要求5所述的固定化蛋白酶，其中，蛋白酶为胰蛋白酶或赖氨酰肽链内切酶。
7.一种固定化蛋白酶的制备方法，其包含如下工序：在纳米颗粒表面固定化粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶。
8.一种对蛋白酶赋予对外部环境变化的耐性的方法，其在纳米颗粒表面固定化粗纯化的蛋白酶或未进行耐自体分解处理的蛋白酶，从而对蛋白酶赋予对外部环境变化的耐性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白酶、AspN蛋白酶、ArgC蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或二肽基肽酶。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其中，耐自体分解处理为还原性二甲基化处理。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，蛋白酶为胰蛋白酶或赖氨酰肽链内切酶。
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