CN104634915A - 一种寡核苷酸文库修饰的颗粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种寡核苷酸文库作为配基的材料，及其在蛋白质样品预处理方面的应用。该材料用于蛋白质样品预处理能够有效降低样品中高丰度蛋白质的丰度，减小高丰度蛋白质与低丰度蛋白质之间的丰度差异。相比于传统的蛋白质样品预处理方法，具有方便易行、成本低廉等特点。

Description

一种寡核苷酸文库修饰的颗粒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及蛋白质样品预处理，具体地说是一种寡核苷酸文库修饰的颗粒及其在蛋白质样品预处理中的应用。

背景技术

生物样品内蛋白质的组成极其复杂，而且动态范围比较宽，浓度差异大（丰度差异大），比如血浆样品中前10种高丰度蛋白质含量占到总蛋白质含量的90%，前22种蛋白质占到99%，余下几千种蛋白却仅占到1%，高丰度蛋白质的存在会掩盖低丰度蛋白质，从而干扰对低丰度蛋白质的鉴定，而这些低丰度蛋白质往往存在潜在的生物学意义，在疾病标志物的发现与治疗方面可能会发挥重要生物功能（J.Proteome Res.,2011,10,5–16）。因此在蛋白质样品分析过程中需要降低其中高丰度蛋白质的丰度差别，缩小这种差异以方便用现有的检测技术检测到低丰度蛋白质成为蛋白质样品预处理的核心问题之一。

目前发展的去除高丰度蛋白质的技术方法主要包括染料配体法、超速离心过滤法、免疫去除法及预分级技术。染料配体法是将汽巴蓝F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯颗粒表面，通过染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白(Journal of Chromatography B,2006,832,216-223)。该方法样品的处理量大，但特异性较差。超速离心过滤法主要通过选择具有不同截留分子量的膜实现蛋白质的分离，并去除某些分子量较大的高丰度蛋白质（Molecular &Cellular Proteomics,2003,2,1096–1103）。然而高丰度蛋白质并非都是大分子量的蛋白质，因此会存在对高丰度蛋白质去除不充分，而且可能会同时去除高分子量的低丰度蛋白质等问题。与前两种去除方法相比，免疫去除法的特异性很高(Mol Cell Proteomics2008,7,1963-1973;J Proteome Res2010,9,4982-4991;JProteome Res.,2007,6,947-954)。然而，该方法仍存在很多不足，如，低丰度蛋白质易与部分高丰度蛋白质非特异性结合，产生共去除现象(Electrophoresis2010,31,471-482)；已发现的抗体种类少(20种)；处理样品的体积有限；去除后的样品被稀释；不同蛋白质去除效率有一定差异性等。近期，人们还通过采用液相等电聚焦和多维液相色谱等方法进行样品的预分级，有效地降低了样品的复杂程度(J.ProteomeRes.,2009,8,1143–1155;Electrophoresis,2009,30:249-261;Electrophoresis,2010,31,3580–3585;J.Proteome Res.,2009,8,1143–1155;J.Proteome Res.,2010,9,1902-1912)。但是液相等电聚焦方法只能根据已有的等电点膜将样品按照有限的等电点区间进行分级。因此，高丰度蛋白质所在级分仍存在对低丰度蛋白质的掩盖问题。而多维液相色谱方法不仅操作繁琐、运行时间长，而且也难以避免去除高丰度蛋白质的同时造成低丰度蛋白质的共洗脱。

发明内容

针对以上方法目前存在的不足，本发明提供一种简便高效的蛋白质样品处理方法以降低蛋白质样品中高丰度蛋白质的丰度。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

采用寡核苷酸文库修饰的颗粒处理蛋白质样品，并依次采用氯化钠溶液,甘氨酸溶液，尿素溶液及十二烷基磺酸钠溶液分别对颗粒上的蛋白质进行洗脱，以降低蛋白质样品中高丰度蛋白质的丰度，缩小蛋白质样品内高丰度蛋白质与低丰度蛋白质的丰度差异。

所述寡核苷酸文库修饰的颗粒的制备与蛋白质样品处理的具体步骤如下，

（1）寡核苷酸文库的修饰：

a.磁性基质颗粒：将寡核苷酸文库溶液与磁性颗粒以0.2-10nmol/mg的比例在三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（Tris-HCl）中室温条件下反应0.5-12h。

b.聚丙烯酸酯基质材料：将寡核苷酸文库溶液与功能化的聚丙烯酸酯基质材料以0.5-250nmol/mg的比例在磷酸缓冲溶液中室温条件下反应6-24h。

c.金颗粒：将寡核苷酸文库溶液与金颗粒以摩尔数为50:1的比例在水溶液中室温条件下反应6-24h。

（2）蛋白质样品的处理：采用（1）制备的颗粒与蛋白质样品在1-10℃条件下孵育0.5-10h。

（3）蛋白质洗脱：将颗粒去除上清液后，采用Tris-HCl缓冲溶液洗涤，去除上清液。顺序采用氯化钠溶液(NaCl),甘氨酸溶液(Gly-HCl)，尿素溶液（含有乙二胺四乙酸钠）和十二烷基磺酸钠溶液（含有二硫苏糖醇）分别洗涤，并收集洗涤后的溶液。

（4）蛋白质酶解

将上述洗脱液与原始血清蛋白质样品分别进行胰酶酶解。具体过程如下：将样品变性后加入二硫苏糖醇反应1.5h，实现蛋白质的还原过程，再按加入碘乙酰胺溶液，避光条件下反应40min对蛋白质进行烷基化，最后加入与蛋白质质量比为25:1-50:1的胰蛋白酶，37℃进行酶解反应16h。

（5）反相液质联用分析与数据处理

将上述蛋白质酶解产物进行反相液质(RPLC-MS/MS)分析。质谱数据采用Mascot检索。

本发明具有如下优点：

（1）本发明制备的寡核苷酸文库修饰的颗粒与四种洗脱试剂的应用能够有效降低样品中高丰度蛋白质的丰度，从而缩小蛋白质样品内高丰度蛋白质与低丰度蛋白质的丰度差异；（2）制备的颗粒稳定，制备方法与样品处理结果重现性好，；（3）样品处理方法耗费少，操作简便，通过使用磁铁或离心操作便能实现，不需要液相色谱、电泳仪等仪器辅助，且无需使用抗体柱等。

附图说明

图1 寡核苷酸文库键合前后紫外吸收结果；

图2 血浆蛋白质样品中前十种高丰度蛋白质丰度变化结果。前十种高丰度蛋白质分别为：1,白蛋白(Albumin)；2,α-2-巨球蛋白质(Alpha-2-macroglobulin)；3,免疫球蛋白G(IgG)；4，纤维素蛋白原(Fibrinogen)；5，血清补体蛋白C3(Complement C3)；6,转铁蛋白质(Serotransferrin)；7,免疫球蛋白M(IgM)；8,α-1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin)；9,免疫球蛋白A(IgA)；10,触珠蛋白(HPRHaptoglobin)。

具体实施方式

下面采用具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

1.寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒的制备取15mg1.0μm四氧化三铁磁性颗粒，将1.0mL摩尔浓度为10μM的寡核苷酸文库溶液与该磁性颗粒在10mM Tris-HCl缓冲溶液中室温条件孵育反应2h，寡核苷酸文库中寡核苷酸链的碱基长度为60，反应后的溶液采用10mM Tris-HCl溶液洗涤3次。

2.样品处理过程

将蛋白质样品（血浆或组织样品）采用20mM Tris-HCl缓冲溶液稀释（pH=7.4）至10mg/mL，将上述样品(1mL)加入上述制备的寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒中，4度条件下孵育2h。磁铁分离颗粒与上清液后，取出上清液。颗粒采用Tris-HCl缓冲溶液洗涤3后，再分别采用2M NaCl，100mM Gly-HCl，4M尿素溶液（含有10mM EDTA）和4%十二烷基磺酸钠溶液（含有25mM DTT）进行洗涤，每种试剂分别洗涤3次后，磁铁分离颗粒并收集各洗脱液。

3.蛋白质酶解过程

将上述洗脱液与原始血清蛋白质样品分别进行胰酶酶解。具体过程如下：将样品在90℃条件下变性20min，加入适量的二硫苏糖醇（每毫克蛋白质加入8μmol二硫苏糖醇溶液)于56℃反应1.5h，实现蛋白质的还原过程，再按比例加入碘乙酰胺溶液(1μmol二硫苏糖醇加入2.5μmol IAA)，在避光条件下反应30min对蛋白质进行烷基化，最后加入胰蛋白酶（胰蛋白酶与蛋白质的质量比例为1:25），37℃反应16h。

4.反相液质联用分析与数据处理

将上述蛋白质酶解产物进行反相液质(RPLC-MS/MS)分析。采用两种流动相：流动相A为2%乙腈，98%水，0.1%甲酸；流动相B为98%乙腈，2%水，0.1%甲酸。当样品载于RP捕集柱上之后，再采用如下分离梯度进行反相分离，0-5%B,分离5min；5-35%B，分离95min；35-80%B，分离5min，之后采用80%流动相B冲洗10min。LTQ质谱采用正离子扫描模式，碰撞能量为35%。采用Mascot(2.4.0version)检索质谱得到的数据，搜索数据库为IPI_human_v3.8.7(91464sequence)。采用显著性因子P<0.05，ion score>20对检索结果进行处理得到高度可信的蛋白质。

对得到的蛋白质列表信息进行统计分析，结果如表1所示。

表1洗脱体系4个组分及原始血浆样品中蛋白质质谱鉴定结果；

经过寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒处理血浆样品后，血浆样品中蛋白质鉴定数目从184增加到225，提高了22%。当质谱中蛋白质样品量相同的条件下，谱图数目的多少可以反映蛋白质含量的高低，比较血浆经过寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒处理前后前十种高丰度蛋白质谱图数目的变化，结果如图1所示。前9种蛋白质谱图数目在处理后都有不同程度的降低，说明该方法能够显著降低高丰度蛋白质的丰度。

实施例2

与实施例1不同之处在于：将100mg粒径为1.0μm的四氧化三铁磁性颗粒与5.0mL摩尔浓度为25μM，碱基长度为60的寡核苷酸文库溶液室温孵育2h，制备寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒，处理蛋白质样品。

实施例3

与实施例1不同之处在于：将100mg粒径为1.0μm的四氧化三铁磁性颗粒与5.0mL摩尔浓度为25μM，碱基长度为20的寡核苷酸文库溶液室温孵育2h，制备寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒，处理蛋白质样品。

实施例4

与实施例1不同之处在于：将100mg粒径为10nm四氧化三铁磁性颗粒与5.0mL摩尔浓度为25μM，碱基长度为40的寡核苷酸文库溶液孵育室温孵育2h，制备寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒，处理蛋白质样品。

实施例5

与实施例1不同之处在于：将100mg粒径为10mm磁性颗粒与5.0mL摩尔浓度为25μM，碱基长度为40的寡核苷酸文库溶液室温孵育2h，制备寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒，处理蛋白质样品。

实施例6

与实施例1不同之处在于：将浓度为500μL摩尔浓度为8nM，粒径为20nm的金颗粒与20μL摩尔浓度为10μM，碱基长度为40的寡核苷酸文库溶液室温孵育2h，制备寡核苷酸文库修饰的金颗粒，处理蛋白质样品。

实施例7

与实施例1不同之处在于：将1mg粒径为300μm的聚丙烯酸乙酯颗粒与1.0mL摩尔浓度为15μM，碱基长度为40的寡核苷酸文库溶液室温孵育12h，制备寡核苷酸文库修饰的聚丙烯酸酯基质颗粒，处理蛋白质样品。

Claims (7)

1.寡核苷酸文库修饰的基质材料，其特征在于：基质材料为磁性颗粒、聚丙烯酸酯类聚合物基质颗粒或金颗粒，寡核苷酸文库是人工合成的随机寡核苷酸文库，寡核苷酸链的序列具有随机性；寡核苷酸链键合于基质材料表面。 

2.按照权利要求1所述的材料，其特征在于：基质材料粒径为1.0nm-50mm，寡核苷酸文库中寡核苷酸链的碱基数目在20-100之间。 

3.按照权利要求1所述的寡核苷酸文库修饰的材料，其特征在于：寡核苷酸文库与基质材料的键合方式为：生物素-亲和素相互作用，羧酸根与氨基反应键合，金与巯基键合，双键与双键反应中的一种或二种以上。 

4.按照权利要求1所述的材料，其特征在于： 

所述磁性颗粒为四氧化三铁磁性颗粒，聚丙烯酸酯类聚合物为聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚丙烯酸丁酯等以丙烯酸酯为单体的聚合物。 

5.一种权利要求1或2所述的寡核苷酸文库修饰的基质材料的制备方法，其制备过程包括以下具体步骤： 

（1）磁性基质颗粒：将寡核苷酸文库溶液与磁性颗粒以0.2-10nmol/mg比例在三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（Tris-HCl）中室温条件下反应0.5-12h，得寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒材料； 

或（2）聚丙烯酸酯基质材料：将寡核苷酸文库溶液与功能化的聚丙烯酸酯基质材料以0.5-250nmol/mg的比例在磷酸缓冲溶液中室温条件下反应3-24h，得寡核苷酸文库修饰的聚丙烯酸酯基质材料； 

或（3）金颗粒：将寡核苷酸文库溶液与金颗粒以摩尔数为50:1的比例在水溶液中室温条件下反应1-6h，得寡核苷酸文库修饰的金颗粒材料。 

6.一种权利要求1-4任一所述的寡核苷酸文库修饰的基质材料的应用，其用于蛋白质样品预处理的过程：修饰寡核苷酸文库的材料采用10-100mM Tris-HCl缓冲液洗涤2-5次后，与蛋白质样品在1-25℃条件下孵育0.5-10h；去除上清；采用20-150mM Tris-HCl缓冲液洗涤材料4-6次，去除上清后，依次采用氯化钠溶液洗涤3-6次、甘氨酸溶液洗涤3-6次、尿素溶液洗涤3-6次和十二烷基磺酸钠溶液洗涤3-6次，并分别收集不同洗脱液洗涤后的溶液，即获得蛋白质样品预处理后的4个组份。 

7.按照权利要求5所述的制备的材料的应用，蛋白质样品包括体液或组织样品中的一种或二种以上。