CN103134926A - 一种磁性微球载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性微球载体及其制备方法，该磁性微球载体采用微米或亚微米尺度的磁性微球为母球，在其表面通过化学交联方法组装纳米尺度、表面具有丰富功能基团的子球，得到具有规整拓扑结构的组装磁性微球。本发明的磁性微球载体作为识别、捕获与操控待检目标分子的载体，能实现对目标待检分子的高效捕获与检测。与具有相同表面功能基团的传统光滑球形磁性微球相比，这类具有规整拓扑结构的磁性微球可显著提高体外诊断应用过程的检测灵敏度。并且，其组装过程简单，得到的组装微球的形貌规整，且其拓扑结构的形成大幅提高了微球的表面积，保证了后续体外诊断应用过程中对目标生物探针分子的高效固定。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料载体及其制备和应用，尤其涉及一种提高体外诊断检测灵敏度的磁性微球载体及其制备方法。属于生物材料技术领域。
背景技术
磁性微球作为体外诊断的固相载体，起到识别、捕获、控制与运输目标待检分子的载体作用。由于其在整个反应过程中均是悬浮在待检样本中，与传统的多孔板载体相比，其整个反应基本处于液态或准液态状态，载体与待检物之间发生分子碰撞的几率大大增加。另外，由于磁性微球较大的表面积提高了负载目标待检分子的效率，因而使得其生物反应效率较传统多孔板方式大为提高；一般多孔板上的生物反应需要在1～3小时之间，而基于磁性微球的生物反应仅需十几分钟。另外，由于磁性微球卓越的超顺磁特性，使得采用全自动磁性分离方式与检测可以轻松地实现。
目前，体外诊断领域应用的磁性微球载体主要为粒径在100nm以下的磁性颗粒以及粒径在1μm以上（通常为几微米）的磁性微球两类。粒径在100nm以下的磁性颗粒，由于具有极大的比表面积，可以显著提高识别与捕获待检目标生物分子的反应动力学以及捕获目标生物分子的能力，进而提高体外诊断的检测灵敏度与检测效率。但是，纳米尺度的磁性颗粒对外磁场的响应程度低，不易被磁场操控；且极易发生团聚而在实际应用过程中起不到纳米尺度效应，从而无法在目前主流的全自动体外诊断检测系统中作为高效固相载体使用。另一方面，微米尺度的磁性微球，由于其包含大量的磁性颗粒，虽然可以方便地实现全自动检测，但是微球载体的表面积比纳米磁性颗粒大大降低，从而以其为载体时的检测灵敏度与反应效率也大为降低。
经对现有技术的文献检索发现，Matsunaga等在《Analytica Chimica Acta》第597卷331-339页发表的“基于beads on beads复合物的用于全自动免疫检测的磁性微球检测PSA特异性抗原”（Fully automated immunoassay for detection ofprostate-specific antigen using nano-magnetic beads and micro-polystyrene beadcomposites,'Beads on Beads'”）中报道了利用beads on beads结构，将纳米尺度的磁性颗粒通过生物素结合到表面连接有亲和素的微米尺度的聚苯乙烯微球上，一方面提高了磁性微球的表面积，另一方面又克服了纳米尺度的磁性颗粒对外磁场的弱响应性以及极易团聚等问题。但是该文并没有对这种beads on beads特殊的拓扑结构与光滑的微米尺度微球在体外诊断的检测灵敏度进行对比研究，即没有阐释这种特殊的拓扑结构是否可以提高体外诊断的检测灵敏度。另外，由于该报道所采用的组装技术为链霉亲和素与生物素的亲合作用，因此需要经过高达十余次的多次反复组装才能实现纳米尺度的磁性颗粒在微米尺度上的微球较高密度组装，整个制备过程复杂，且成本昂贵。
进一步检索发现，Tan等在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICALCHEMISTRY》第383卷738–746页发表的“球状生物功能核壳纳米颗粒微结构层在蛋白阵列上提高反应表面积”（Microstructured layers of spherical biofunctionalcore-shell nanoparticles provide enlarged reactive surfaces for protein microarrays）中报道了在平板基片上通过组装纳米尺度的微球，再以此作为固相载体，开展对模式蛋白的检测，结果发现检测灵敏度得到较大提升。但是，由于采用的固相载体为平板基片，其与待检分子间的反应完全通过分子的扩散来实现，使得反应动力学较微球大为降低。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种制备方法简单、可提高体外诊断检测灵敏度的磁性微球载体。
为实现上述目的，本发明提供了一种提高体外诊断检测灵敏度的磁性微球载体及其制备方法。
本发明采用微米或亚微米尺度的磁性微球为母球，在其表面通过化学交联方法组装表面具有丰富功能基团的纳米尺度子球，从而得到具有规整拓扑结构的组装磁性微球。将得到的具有规整拓扑结构的组装磁性微球作为识别、捕获与操控待检目标分子的载体，从而实现对目标待检分子的高效捕获与检测。与具有相同表面功能基团的传统光滑球形磁性微球相比，本发明的具有规整拓扑结构的磁性微球可显著提高体外诊断应用过程的检测灵敏度。本发明的制备方法通过一次化学交联反应实现了纳米尺度的子球在微米尺度母球上的高密度组装，其组装过程简单，得到的组装微球的形貌规整；并且拓扑结构的形成极大地提高了微球的表面积，保证了后续体外诊断应用过程中对目标生物探针分子（核酸或蛋白）的高效固定与探测。
本发明是通过以下技术方案来解决上述技术问题的：
一方面，本发明提供了一种可显著提高体外诊断检测灵敏度的磁性微球载体。具体地，本发明的磁性微球载体的组分及含量/物理化学特征为：以具有微米或亚微米尺度的母球为核，粒径为纳米尺度的子球为壳，子球与母球之间通过化学共价键紧密连接，且母球与子球的表面均带有活性功能基团。其中，母球为磁性微球或者非磁性微球，母球的粒径为500nm～20μm。子球为磁性纳米微球或者非磁性纳米微球，子球的粒径为30nm～200纳米。
优选地，所述活性功能基团为氨基、羧基、巯基、或羟基等活性功能基团。
在本发明的较佳实施方式中，所述表面带有活性功能基团的母球或子球是指具有单分散粒径，且表面接枝有氨基、羧基、巯基、或羟基等活性功能基团的母球或子球。
在本发明的具体实施方式中，磁性母微球由四氧化三铁纳米颗粒与聚合物或者氧化硅微球组成，非磁性母微球为聚合物或者氧化硅微球。磁性纳米子微球由四氧化三铁纳米颗粒与聚合物或者氧化硅微球组成，非磁性纳米子微球为聚合物或者氧化硅微球。
在本发明的另一较佳实施方式中，所述的磁性母微球是指：具有单分散粒径、表面接枝有氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团、且内部含有四氧化三铁纳米磁性颗粒的聚苯乙烯、聚苯乙烯与聚（甲基）丙烯酸共聚物、或氧化硅磁性微球。
所述的非磁性母球是指：具有单分散粒径、表面接枝有氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团的聚苯乙烯、聚苯乙烯与聚（甲基）丙烯酸共聚物、或者氧化硅微球。
所述的非磁性纳米子球是指：具有单分散粒径、表面接枝有氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团的聚苯乙烯、聚苯乙烯与聚（甲基）丙烯酸共聚物、或者氧化硅微球。
所述的磁性纳米子球是指：具有单分散粒径、表面接枝有氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团、且内部含有四氧化三铁纳米磁性颗粒的的聚苯乙烯、聚苯乙烯与聚（甲基）丙烯酸共聚物、或者氧化硅纳米磁性微球。
另一方面，本发明还提供了一种制备上述可显著提高体外诊断检测灵敏度的磁性微球载体的方法，包括以下步骤：
第一步、首先，对磁性或非磁性的亚微米或微米尺度母球表面的功能基团进行活化处理；然后加入过量的纳米尺度非磁性或磁性纳米子球，搅拌反应2小时以上，将得到的微球通过磁场或者离心方式去除未反应的子球，最终得到表面组装有纳米尺度，且具有规整拓扑结构的磁性微球。
第二步、首先，将得到的具有规整拓扑结构的组装磁性微球表面的功能基团活化，然后加入探针生物分子，反应2小时以上，洗涤去除未反应的探针生物分子，得到表面连接有探针生物分子的磁性组装微球载体。该磁性组装微球载体具有生物活性，可特异性识别一些目标待检生物分子。
第三步、将上述具有生物活性的磁性组装微球载体加入到含有不同浓度梯度的目标生物分子样本体系中，进行生物亲和反应或杂交反应；计算、检测灵敏度。
在本发明的较佳实施方式中，步骤一中，当母球表面为羧基时，采用EDC/NHS试剂活化；当母球表面为氨基时，采用NHS-PEGn-NHS双功能活化剂活化；当母球表面为羟基时，采用CDI试剂活化；当母球表面为巯基时，采用马来酰亚胺试剂活化。优选地，所述活化剂NHS-PEGn-NHS中PEG重复单元n为2～20。但本发明的制备方法中对母球表面功能基团的活化方法并不限于以上方式，且EDC/NHS、NHS-PEGn-NHS、CDI、或马来酰亚胺等活化剂的具体活化方法为本领域众所周知的方法，本发明对此没有特别限制。并且，步骤二中对组装磁性微球表面的功能基团进行活化的方法与步骤一所述的活化方法相同。
在本发明中，所述的探针生物分子是本领域常用的以下几种试剂，但并不限于此：抗体、链霉亲和素、寡核苷酸探针、或蛋白配基等。
另一方面，本发明还提供了根据以上制备方法得到的磁性微球载体在检测生物分子中的用途。尤其是在检测一些目标生物分子中的应用。
优选地，所述的目标生物分子是指待检测的抗原、生物素标记的生物待检分子、待检目标核酸、或待检受体分子等，但并不限于此。
在本发明的具体实施方式中，步骤三中计算、检测灵敏度的方法参照国际标准EP-17A；并将计算得到的灵敏度与表面具有相同组成与功能基团结构的光滑球形磁性微球采用相同生物反应并进行检测灵敏度对比分析，比较发现，本发明的磁性微球载体比光滑球形磁性微球具有更高的生物活性和检测灵敏度。
本发明采用具有规整拓扑结构的组装磁性微球为载体，一方面，由于采用纳米尺度的小微球组装到微米尺度的大微球表面，显著提高了微米尺度微球的表面积，使得其固定可特异性识别目标待检分子的探针生物分子能力大为提高，从而显著提高体外诊断的检测灵敏度。另一方面，由于组装微球采用简单的化学交联方法，其制备条件温和、简单；且组装微球的结构规整、可控，保证了体外诊断的检测稳定性。另外，与传统多孔板固相载体相比，本发明的微球载体具有较高的反应动力学，是一种新型的高性能体外诊断用微球载体。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的实施例1的所得到的磁性组装微球的SEM照片；
图2是本发明的实施例1的所得到的组装磁性微球为载体应用于化学发光免疫检测的化学发光强度对HbsAg浓度曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
第一步、首先采用粒径为700nm的磁性聚合物微球为母球，该母球内部弥散分布有50wt%的纳米四氧化三铁颗粒，磁性微球基质为聚苯乙烯，表面为聚苯乙烯与聚丙烯酸共聚物。取此表面含有羧基的磁性微球80mg，分散到装有20mL浓度为10mM的MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）溶液中（溶液中含有0.05wt%的吐温20）的三口烧瓶中，搅拌下，加入EDC/NHS活化剂，使其两者的终浓度为50mg/mL。搅拌反应15min，在磁场帮助下洗涤未反应的EDC与NHS，得到活化后的磁性母球。然后将活化后的磁性母球分散到20mL磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20）。其次，将活化后的磁性母球分散液逐滴加入到80mL预先制备好的分散有表面带氨基、粒径为80nm的氧化硅微球悬浮溶液（氧化硅颗粒分散到所述缓冲溶液中形成的悬浮液）中，搅拌反应3小时后，在磁场帮助下用去离子水、无水乙醇各洗涤3次，去除未组装到磁性母球表面的氧化硅子球。将得到的表面具有规整拓扑结构的磁性组装微球保存在无水乙醇中备用。所得到的磁性组装微球的SEM照片如图1所示，由图1可知，纳米尺度的氨基氧化硅微球规整高密度组装到亚微米尺度的磁性微球表面。
第二步、取2mg上述磁性组装微球在无水乙醇体系中用3微克NHS-PEG4-NHS进行活化2小时，然后将活化后的组装磁性微球分散到400微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20），洗涤三次。再在该组装磁性微球体系中加入200微克链霉亲和素，37℃混匀旋转反应2小时，在磁场帮助下用封闭试剂（含有惰性蛋白）洗涤3次后，在4℃下封闭过夜，得到表面连接有链霉亲和素的、可与生物素化生物分子特异性反应的链霉亲和素磁性组装微球。将此链霉亲和素磁性组装微球保存在200微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20，0.1wt%BSA）备用。
第三步、以乙肝表面抗原的化学发光检测作为评估磁性组装微球载体检测灵敏度的方法。将生物素化抗乙肝表面抗原抗体与不同浓度梯度的乙肝表面抗原以及辣根过氧化物酶标记的另一个抗乙肝表面抗原抗体在37℃孵育反应20分钟，形成免疫复合物。然后在每个浓度梯度样品中加入10微克由步骤二得到的表面连接有链霉亲和素的组装磁性微球，再在37℃下孵育反应10min，在磁场帮助下洗涤未被组装磁性微球捕获的免疫复合物与过量的酶标抗体，在体系中加入化学发光底物，测试每个浓度梯度下的化学发光强度信号值。然后绘制组装磁性微球为载体应用于化学发光免疫检测的化学发光强度对HbsAg浓度的标准曲线图，如图2所示，其中RMMBs为制得的组装磁性微球的标准曲线，CMMBs是对比光滑微球的标准曲线。根据国际标准EP-17A文件要求，由图2计算检出所制得的组装磁性微球对乙肝表面抗原的检出限为0.90ng/mL。而采用相同母球，表面包被相同厚度的氨基氧化硅壳层的光滑微球为载体，采用与第三步同样的试剂并经过相同的检测过程，其对乙肝表面抗原的检出限为2.6ng/mL。
实施例2
本实施例中第一步与第二步除母球粒径为5μm的羧基磁性微球，子球为200纳米的氨基聚苯乙烯微球外，其余操作方法与实施例1相同。
第三步中，除每个浓度梯度加入15微克组装磁性微球外，其余步骤相同。经检测计算得到的对乙肝表面抗原的检测检出限为1.2ng/mL，相同母球包被的表面氨基氧化硅壳层的光滑磁性微球其检出限为3.1ng/mL。
实施例3
本实施例中第一步与第二步除母球粒径为10μm的羧基磁性微球，子球为200nm的氨基聚苯乙烯微球外，其余操作方法与实施例1相同。
第三步中，除每个浓度梯度加入30微克组装磁性微球外，其余步骤相同。经检测计算得到的对乙肝表面抗原的检测检出限为1.5ng/mL，相同母球包被的表面氨基氧化硅壳层的光滑磁性微球其检出限为3.8ng/mL。
实施例4
本实施例中除了选用的母球粒径为20μm的氧化硅羧基微球，子微球选用100nm的磁性氨基微球，同时洗涤去除未在微米羧基母球上组装上的子球采用1000转离心方法去除上清外，其余均与实施例1相同。
第三步中，除每个浓度梯度加入30微克组装磁性微球外，其余步骤相同。经检测计算得到的对乙肝表面抗原的检测检出限为2.1ng/mL，相同母球包被的表面氨基氧化硅壳层的光滑磁性微球其检出限为4.5ng/mL。
实施例5
第一步、首先采用粒径为1000nm的磁性氧化硅微球为母球，母球内部弥散分布有70wt%的纳米四氧化三铁颗粒，磁性微球基质为氧化硅，表面为修饰有氨基功能基团。取此表面含有氨基基团的磁性微球80mg，分散到装有20mL无水乙醇溶液中。搅拌下，将上述母球悬浮液逐滴加入预先制备好的分散有表面氨基、粒径为30纳米氧化硅微球的无水乙醇悬浮溶液（150mL）中。滴加完成后再加入溶解有150微克NHS-PEG20-NHS的无水乙醇溶液，搅拌反应过夜，在磁场帮助下用去离子水、无水乙醇各洗涤3次，去除未组装到磁性母球表面的氧化硅子球。最终将得到的表面具有规整拓扑结构的组装磁性微球保存在无水乙醇中备用。
第二步、取2mg得到的组状微球表面氨基在无水乙醇体系中用3微克NHS-PEG4-NHS进行活化2小时，然后将活化后的组装微球分散到400微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20），洗涤三次。再在上述组装微球体系中加入200微克链霉亲和素，37℃混匀旋转反应2小时，在磁场帮助下用封闭试剂（含有惰性蛋白）洗涤3次后，在4℃下封闭过夜，得到表面连接有链霉亲和素的、可与生物素化生物分子特异性反应的链霉亲和素磁性组装微球。将此链霉亲和素磁性组装微球保存在200微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20，0.1%BSA）备用。
第三步、以乙肝表面抗原的化学发光检测作为评估磁性微球载体检测灵敏度的方法。将生物素化抗乙肝表面抗原抗体与不同浓度梯度的乙肝表面抗原以及辣根过氧化物酶标记的另一个抗乙肝表面抗原抗体在37℃孵育反应20分钟，形成免疫复合物。然后在每个浓度梯度样品中加入10微克由上步得到的表面连接有链霉亲和素的组装磁性微球，再在37℃下孵育反应10min，在磁场帮助下洗涤未被组装磁性微球捕获的免疫复合物与过量的酶标抗体，在体系中加入化学发光底物，测试每个浓度梯度下的化学发光信号值。然后绘制标准曲线，根据国际标准EP-17A文件要求，计算检出限为0.92ng/mL。而采用相同母球，表面包被相同厚度的氨基氧化硅壳层的光滑磁性微球为载体，采用与第三步同样的试剂并经过相同的检测过程，其对乙肝表面抗原的检出限为2.7ng/mL。
实施例6
第一步、首先采用粒径为1000nm的磁性氧化硅微球为母球，母球内部弥散分布有70wt%的纳米四氧化三铁颗粒，磁性微球基质为氧化硅，表面为修饰有氨基功能基团。取此表面含有氨基基团的磁性微球80mg，分散到装有20mL MES（pH=5.0，含有0.05wt%的吐温20）缓冲溶液中。搅拌下，将上述母球悬浮液逐滴加入已提前准备好的150mL分散有表面羧基、粒径为100纳米聚合物微球的MES悬浮溶液中。滴加完成后再加入30mL EDC/NHS的MES缓冲溶液，使EDC/NHS各自浓度为50mg/mL，搅拌反应3小时，在磁场帮助下用去离子水、无水乙醇各洗涤3次，去除未组装到磁性母球表面的纳米聚合物子球。最终将得到的表面具有规整拓扑结构的组装磁性微球，保存在磷酸盐缓冲溶液中备用。
第二步、取2mg得到的表面为羧基的组装微球分散到磷酸盐（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20）缓冲溶液中，体系中用50mg/mL的EDC/NHS进行活化15min，然后将活化后的组装微球分散到400微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20），洗涤三次。再在上述组装微球体系中加入200微克链霉亲和素，37℃混匀旋转反应2小时，在磁场帮助下用封闭试剂（含有惰性蛋白）洗涤3次后，在4℃下封闭过夜，得到表面连接有链霉亲和素的、可与生物素化生物分子特异性反应的链霉亲和素磁性组装微球。将此链霉亲和素磁性组装微球保存在200微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20，0.1wt%BSA）备用。
第三步、以乙肝表面抗原的化学发光检测作为评估磁性微球载体检测灵敏度的方法。将生物素化抗乙肝表面抗原抗体与不同浓度梯度的乙肝表面抗原以及辣根过氧化物酶标记的另一个抗乙肝表面抗原抗体在37℃孵育反应20分钟，形成免疫复合物。然后在每个浓度梯度样品中加入10微克由上步得到的表面连接有链霉亲和素的组装磁性微球，再在37℃下孵育反应10min，在磁场帮助下洗涤未被组装磁性微球捕获的免疫复合物与过量的酶标抗体，在体系中加入化学发光底物，测试每个浓度梯度下的化学发光信号值。然后绘制标准曲线，根据国际标准EP-17A文件要求，计算检出限为0.95ng/mL。而采用相同母球，表面包被相同厚度的羧基氧化硅壳层的光滑磁性微球为载体，采用与第三步同样的试剂并经过相同的检测过程，其对乙肝表面抗原的检出限为2.85ng/mL。
实施例7
第一步、首先采用粒径为1000nm的磁性氧化硅微球为母球，母球内部弥散分布有70wt%的纳米四氧化三铁颗粒，磁性微球基质为氧化硅，表面为修饰有巯基功能基团。取此表面含有巯基基团的磁性微球80mg，分散到装有20mL磷酸盐缓冲溶液中。搅拌下，将上述母球悬浮液逐滴加入已提前准备好的150mL分散有表面氨基、粒径为50纳米氧化硅微球的磷酸盐缓冲溶液中。滴加完成后再加入溶解有50mg/mL的sulfo-SMCC的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.6），搅拌反应过夜，在磁场帮助下用去离子水、无水乙醇洗涤3次，去除未组装到磁性母球表面的氧化硅子球。最终将得到的表面具有规整拓扑结构的组装磁性微球保存在无水乙醇中备用。
第二步、取2mg得到的组装磁性微球表面氨基在无水乙醇体系中用3微克NHS-PEG4-NHS进行活化2小时，然后将活化后的组装微球分散到400微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20），洗涤三次。再在上述组装微球体系中加入200微克链霉亲和素，37℃混匀旋转反应2小时，在磁场帮助下用封闭试剂（含有惰性蛋白）洗涤3次后，在4℃下封闭过夜，得到表面连接有链霉亲和素的、可与生物素化生物分子特异性反应的链霉亲和素磁性组装微球。将此链霉亲和素磁性组装微球保存在200微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20，0.1wt%BSA）备用。
第三步、以乙肝表面抗原的化学发光检测作为评估磁性微球载体检测灵敏度的方法。将生物素化抗乙肝表面抗原抗体与不同浓度梯度的乙肝表面抗原以及辣根过氧化物酶标记的另一个抗乙肝表面抗原抗体在37℃孵育反应20分钟，形成免疫复合物。然后在每个浓度梯度样品中加入10微克由上步得到的表面连接有链霉亲和素的组装磁性微球，再在37℃下孵育反应10min，在磁场帮助下洗涤未被组装磁性微球捕获的免疫复合物与过量的酶标抗体，在体系中加入化学发光底物，测试每个浓度梯度下的化学发光信号值。然后绘制标准曲线，根据国际标准EP-17A文件要求，计算检出限为0.85ng/mL。而采用相同母球，表面包被相同厚度的氨基氧化硅壳层的光滑磁性微球为载体，采用与第三步同样的试剂并经过相同的检测过程，其对乙肝表面抗原的检出限为2.5ng/mL。
实施例8
第一步、首先采用粒径为1000nm的磁性氧化硅微球为母球，母球内部弥散分布有70wt%的纳米四氧化三铁颗粒，磁性微球基质为氧化硅，表面为硅羟基功能基团。取此磁性微球80mg，分散到装有20mL四氢呋喃溶液中。搅拌下，将上述母球悬浮液逐滴加入已提前准备好的150mL分散有表面氨基、粒径为150纳米氧化硅微球的四氢呋喃悬浮中。滴加完成后再加入溶解有50mg/mL的CDI的四氢呋喃溶液，搅拌反应过夜，在磁场帮助下用四氢呋喃、无水乙醇分别洗涤3次，去除未组装到磁性母球表面的氧化硅子球。最终将得到的表面具有规整拓扑结构的组装磁性微球保存在无水乙醇溶液中备用。
第二步、取2mg得到的组状微球表面氨基在无水乙醇体系中用3微克NHS-PEG4-NHS进行活化2小时，然后将活化后的组装微球分散到400微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20），洗涤三次。再在上述组装微球体系中加入200微克链霉亲和素，37℃混匀旋转反应2小时，在磁场帮助下用封闭试剂洗涤3次后，在4℃下封闭过夜，得到表面连接有链霉亲和素的、可与生物素化生物分子特异性反应的链霉亲和素磁性组装微球。将此链霉亲和素磁性组装微球保存在200微升磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.6，含有0.05wt%的吐温20，0.1wt%BSA）备用。
第三步、以乙肝表面抗原的化学发光检测作为评估磁性微球载体检测灵敏度的方法。将生物素化抗乙肝表面抗原抗体与不同浓度梯度的乙肝表面抗原以及辣根过氧化物酶标记的另一个抗乙肝表面抗原抗体在37℃孵育反应20分钟，形成免疫复合物。然后在每个浓度梯度样品中加入10微克由上步得到的表面连接有链霉亲和素的组装磁性微球，再在37℃下孵育反应10min，在磁场帮助下洗涤未被组装磁性微球捕获的免疫复合物与过量的酶标抗体，在体系中加入化学发光底物，测试每个浓度梯度下的化学发光信号值。然后绘制标准曲线，根据国际标准EP-17A文件要求，计算检出限为0.93ng/mL。而采用相同母球，表面包被相同厚度的氨基氧化硅壳层的光滑磁性微球为载体，采用与第三步同样的试剂并经过相同的检测过程，其对乙肝表面抗原的检出限为2.85ng/mL。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种磁性微球载体，其特征在于，所述磁性微球载体为具有规整拓扑结构的组装磁性微球，以粒径为500nm～20μm的母球为核，粒径为30nm～200nm的子球为壳，所述子球通过化学共价键连接在所述母球表面，且所述母球与子球的表面均带有氨基、羧基、巯基、或羟基功能基团；所述母球、子球为磁性微球或非磁性微球。
2.如权利要求1所述的磁性微球载体，其中，所述磁性微球由四氧化三铁纳米颗粒与聚合物或者氧化硅组成，所述非磁性微球为聚合物或者氧化硅微球。
3.如权利要求2所述的磁性微球载体，其中，所述磁性微球为具有单分散粒径、表面接枝有氨基、羧基、巯基、或羟基功能基团，且内部含有四氧化三铁纳米磁性颗粒的聚苯乙烯、聚苯乙烯与聚（甲基）丙烯酸共聚物、或氧化硅微球。
4.如权利要求2所述的磁性微球载体，其中，所述非磁性微球为具有单分散粒径、表面接枝有氨基、羧基、巯基、或羟基基团的聚苯乙烯、聚苯乙烯与聚（甲基）丙烯酸共聚物、或氧化硅微球。
5.一种制备如权利要求1-4任一项所述磁性微球载体的方法，包括如下步骤：
第一步、首先，对所述母球的表面功能基团进行活化处理；然后加入过量的子球，搅拌反应，通过磁场或离心方式去除未反应的子球，得到具有规整拓扑结构的组装磁性微球；
第二步、将所述具有规整拓扑结构的组装磁性微球进行活化；然后加入探针生物分子，反应后洗涤去除未反应的探针生物分子，得到所述可识别目标待检生物分子的磁性微球载体；
所述探针生物分子为抗体、链霉亲和素、寡核苷酸探针、或蛋白配基。
6.如权利要求5所述的制备方法得到的磁性微球载体在检测生物分子中的用途。
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