CN104610912A - 可光降解磁性纳米材料和纳米生物探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可光降解磁性纳米材料和纳米生物探针及其制备方法。通过磁性纳米材料和链霉亲和素偶联，得到链霉亲和素修饰的磁性纳米材料；通过将光敏分子与生物素偶联构建生物素化的光敏分子；通过链霉亲和素与生物素之间的亲和作用，制得可光降解的磁性纳米材料。将生物分子与生物素化的光敏分子偶联，然后和接有链霉亲和素的磁性纳米材料孵育得到可光降解的磁性纳米生物探针。纳米生物探针通过生物分子和光照实现生物靶向分子的捕获和释放。本发明的可光降解磁性纳米材料和磁性纳米生物探针制备方法简单易行，可操作性强，重复性好。
Description
技术领域
本发明属于生物、化学及材料科学领域，涉及一种可光降解磁性纳米材料和纳米生物探针及其制备方法。
背景技术
磁性纳米材料具有磁可操控性功能，在其表面修饰特异性的功能化分子可以用于肿瘤标志物的检测、DNA分析、肿瘤细胞的识别、分选和成像等领域。但是，目前的磁性纳米生物探针只能用来特异性地识别靶标，不能实现靶标的捕获和释放，因此限制了其在生物医学领域的应用。
光释放体系由于其具有非侵入性，以及通过调节光强、波长、光照时间、光斑大小做到时间空间可控，被广泛应用于核酸、蛋白、药物等生物活性分子的释放。
循环肿瘤细胞是进入外周血的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临床筛药、耐药性的检测、肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。循环肿瘤细胞的无损伤分离、捕获和再培养可以为循环肿瘤细胞的基因和蛋白质分析提供研究基础。当前，针对于循环肿瘤细胞的研究多集中于血液中循环肿瘤细胞个数多少的检测，较少有研究报道循环肿瘤细胞的无损分离及体外培养。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可光降解磁性纳米材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述制备方法得到的可光降解磁性纳米材料。
本发明的再一目的在于提供一种可光降解磁性纳米生物探针的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种通过上述制备方法得到的可光降解磁性纳米生物探针。
本发明的目的通过下述技术方案实现。
一种可光降解的磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
（1）将1～50mg/mL的磁性纳米材料分散液与0.1～10mg/mL的链霉亲和素溶液按照体积比1:1～10混合，孵育1～6小时后，经过磁力架分离1～20分钟，提取共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料；
（2）黑暗条件下，将1～50mg/mL的光敏分子与1～200mg/mL生物素按照体积比1:1～10混合，孵育1～6小时后，分离出修饰有生物素的光敏分子；
（3）将1～100mg/mL共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料与1～100mg/mL修饰有生物素的光敏分子溶液按照体积比1：0.1～10混合，孵育1～4小时后，经过磁力架分离1～20分钟，提取经光敏分子修饰的磁性纳米材料，即得到可光降解的磁性纳米材料。
步骤（1）中所述的磁性纳米材料为在表面功能化氨基、羧基、巯基、羟基等活性基团聚合物纳米微球内部包埋γ-Fe2O3或Fe3O4的磁性纳米材料。
步骤（2）中所述光敏分子优选为功能化氨基、羧基、巯基等活性基团的领硝基苄基类或香豆素类化合物。
优选地，所述的磁性纳米材料为羧基化Fe2O3磁球，所述的磁性纳米材料分散液的溶剂为超纯水，所述的光敏分子为7-氨基香豆素分子。
一种可光降解的磁性纳米材料，通过上述方法制备得到。
一种可光降解的纳米生物探针的制备方法，包括如下步骤：将1～100mg/mL修饰有生物素的光敏分子与1～500mg/mL生物分子按照体积比1：0.1～10混合，孵育0.5～10小时后，与1～100mg/mL共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料分散液按照体积比1：0.1～10混合，孵育1～4小时后，经过磁力架分离1～20分钟，提取生物分子修饰的磁性纳米生物探针，即得到可光降解的磁性纳米生物探针。
所述的生物分子优选为用于特异性识别和捕获的蛋白和核酸，如抗体、凝集素、生长因子、核酸适配体或蛋白等。
所述的生物分子-生物素化光敏分子偶联物的制备方法包括如下步骤：
1）将1～100mg生物素化光敏分子材料溶解于5mL水与乙醇的混合溶剂（体积比为1：0.1～1）中，加入10～1000mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺活化10～30min；
2）加入1～100mg生物分子于上述EDC/NHS活化的生物素化的光敏分子溶液中孵育1～4h。
可光降解的纳米生物探针的制备方法的机理为：生物分子可以通过与修饰有生物素的光敏分子偶联形成复合物，然后利用链霉亲和素与生物素的亲和作用，将光敏分子修饰的生物探针连接到共价修饰有链霉亲和素的磁性材料表面得到可光降解的磁性纳米生物探针。
一种可光降解的磁性纳米生物探针，通过上述方法制备得到。
将生物分子加入可光降解的磁性纳米生物探针中，室温下孵育1小时，生物分子固定于可光降解的磁性纳米材料的表面。
将1～100mg/mL可光降解的磁性纳米生物探针在365nm或者800nm光照条件下照射1～120分钟，使光敏分子发生断键分解，破坏生物分子与纳米生物探针的连接。
本发明将磁性纳米材料表面组装链霉亲和素制得链霉亲和素化的磁性纳米材料。随后，生物靶向分子经共价修饰后与生物素化的光敏分子偶联，通过链霉亲和素与生物素的亲和作用得到生物靶向分子功能化的可光降解的磁性纳米材料。
本发明具有如下优点和效果：
本发明制备的可光降解的磁性纳米材料和纳米生物探针具有优异的磁响应性和生物靶向性。将生物靶向分子修饰的纳米生物探针进行光照，光敏分子发生分解，切断生物靶向分子与磁性纳米材料的连接，从而实现生物靶向分子与磁性纳米材料剥离，实现对待测物的捕获和释放。本发明操作简便易行、成本低、重复性好，在一般化学及生物化学实验室均能完成。
附图说明
图1为实施例1中光敏分子合成线路图；试剂与反应条件：(a) ICH2CH3/K2CO3， DMF，100oC，2小时；(b) CH3COCH2COOEt/BiCl3, 75 oC, 3天; (c) BrCH2COOC(CH3)3/K2CO3/KI/TBAB, DMF, 回流, 4天, 85%; (d) SeO2, p-xylene, 回流, 24小时; (e) NaBH4, MeOH, 室温, 3小时; (f) biotin/EDC/DMAP, CH2Cl2,室温黑暗条件下, 6小时; (g) TFA, CH2Cl2,室温黑暗条件下，反应2小时。
图2为实施例2用荧光素标记的生物素表征的链霉亲和素修饰的磁性纳米材料。
图3为实施例4中用荧光素标记的二抗表征生物分子上皮细胞粘附分子抗体成功修饰到磁性纳米材料表面。
图4为实施例5制备的上皮细胞粘附分子抗体修饰的可光降解的磁性纳米生物探针捕获和释放循环肿瘤模型细胞MCF-7的结果图；图4（A）为被捕获的MCF-7细胞，图4（B）为被释放的MCF-7细胞。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：生物素化的光敏分子的制备
（1） 将3氨基苯酚(10g, 92.5mmol)、K2CO3(12.5g, 92.5mmol)加入到20mL DMF中，室温下搅拌5min，加入碘乙烷(14g, 92.5mmol), 然后加热到100℃，反应2小时，得到化合物1。
（2） 将化合物1(3.1g, 22.6mmol)、乙酰乙酸乙酯(3.2mL, 24.9mmol)、BiCl3 (0.72g, 2.3mmol)在75℃下搅拌反应3天，得到化合物2。
（3） 将化合物2(1g, 5mmol)、K2CO3 (2g, 15mmol)、KI(90mg)、四丁基溴化铵(160mg)、溴乙酸叔丁酯(1.3mL)在10mL DMF中82℃下搅拌反应4天，得到化合物3。
（4） 化合物3(0.6g, 1.9mmol)、SeO2 (0.43g, 2.8mmol)在50mL对二甲苯中回流(120℃) 24小时，然后加入硼氢化钠(0.14 g, 3.8 mmol)，继续搅拌3个小时得到化合物4，即7-氨基香豆素分子。
（5） 在黑暗条件下，化合物4（500mg）、生物素 (284mg, 1.17mmol)、EDC (372mg, 1.94mmol)、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP ）(12mg, 0.097mmol)加入到40mL二氯甲烷中，在室温下反应6小时得到化合物5。
（6）在黑暗条件下，将化合物5(300mg, 0.46mmol)加入到10mL二氯甲烷中，逐滴加入三氟乙酸5mL，室温下反应2小时，得到修饰有生物素的7-氨基香豆素分子，即修饰有生物素的光敏分子。
实施例2：可光降解的磁性纳米材料的制备
（1）采用共价修饰的方法在1 μm羧基化Fe2O3磁球表面修饰链霉亲和素：将1 mg 粒径为1 μm 的羧基化Fe2O3磁球分散在1 mL的超纯水中，得到1mg/mL的磁性纳米材料，先加入100mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC.HCl）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）室温活化30min，再加入0.5mg链霉亲和素于室温下摇床孵育4h，然后用超纯水清洗三次，用磁力架将多余的链霉亲和素分离开，得到共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料。
（2）将1mg共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料加入到1mL 10mg/mL修饰有生物素的7-氨基香豆素分子溶液中（溶剂为体积比为5:1的水和乙醇混合溶液），孵育1～4小时，磁力架分离1～20分钟，即得到7-氨基香豆素修饰的磁性纳米材料，即可光降解的磁性纳米材料。
实施例3：可光降解的磁性纳米生物分子的制备
将实施例2步骤（1）得到的链霉亲和素修饰的磁性纳米材料加入超纯水中配制成浓度为1mg/mL的分散液。
取10mg的修饰有生物素的7-氨基香豆素分子加入到5ml水和乙醇的混合溶剂中（体积比为5：1）加入100mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺活化10～30min；与400μg羊抗小鼠抗体混合室温孵育2小时，再加入1mL 1mg/mL链霉亲和素修饰的磁性纳米材料分散液，孵育2小时，然后用磁力架分离1～20分钟，得到可光降解的磁性纳米生物探针。
实施例4：纳米生物探针的制备
将20μg上皮细胞黏附分子抗体加入到1mg实施例3制备的可光降解的磁性纳米生物探针中，室温下孵育1小时，得到上皮细胞粘附分子抗体修饰的可光降解的磁性纳米材料。其荧光显微镜照片如图4所示，上皮细胞粘附分子抗体修饰的可光降解磁性纳米材料可以被FITC标记的二抗识别显示FITC的荧光，如图3所示，说明上皮细胞粘附分子抗体成功固定于可光降解的磁性纳米材料的表面，表明可光降解的磁性纳米生物探针制备成功。
实施例5：纳米生物探针的应用
（1）将1×105个人乳腺癌MCF-7细胞（循环肿瘤模型细胞）分散于400μL 1×PBS（pH 7.4）中，之后加入100μL 10mg/mL 上述上皮细胞粘附分子抗体修饰的可光降解磁性纳米材料。室温下孵育30min后，经磁力架吸引5min，除去未捕获的细胞，将捕获的细胞于显微镜下观察，见图4（A）。
（2）将捕获的细胞分散于400μL 1×PBS（pH 7.4）中，分别用365nm和800nm光照射15分钟和2小时，室温下孵育10min，之后经磁力下吸引除去磁性纳米颗粒，得到被释放的MCF-7细胞于显微镜下观察，见图4（B）。
如图4（A）所示，光照之前MCF-7细胞上显示上皮细胞粘附分子抗体修饰的可光降解的磁性纳米材料；如图4（B）所示，光照之后后上皮细胞粘附分子抗体修饰的可光降解的磁性纳米材料的结构被破坏，磁性纳米材料从MCF-7细胞上脱离，MCF-7细胞表面几乎看不到磁性纳米材料。以上结果说明本发明的可光降解的磁性纳米生物探针可以用于循环肿瘤细胞的捕获和释放。
上述实施例表明本发明方法制备得到的可光降解的磁性纳米材料具有较好的分散性能，可用于制备纳米生物探针，应用于生物医学研究领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可光降解的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将1～50mg/mL的磁性纳米材料分散液与0.1～10mg/mL的链霉亲和素溶液按照体积比1:1～10混合，孵育1～6小时后，经过磁力架分离1～20分钟，提取共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料；
（2）黑暗条件下，将1～50mg/mL的光敏分子与1～200mg/mL生物素按照体积比1:1～10混合，孵育1～6小时后，分离出修饰有生物素的光敏分子；
（3）将1～100mg/mL共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料与1～100mg/mL修饰有生物素的光敏分子溶液按照体积比1：0.1～10混合，孵育1～4小时后，经过磁力架分离1～20分钟，提取经光敏分子修饰的磁性纳米材料，即得到可光降解的磁性纳米材料。
2.根据权利要求1所述的可光降解的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的磁性纳米材料为表面功能化活性基团聚合物纳米微球内部包埋γ-Fe2O3或Fe3O4的磁性纳米材料，所述的活性基团为氨基、羧基、巯基、羟基中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的可光降解的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的光敏分子为硝基苯类化合物或氨基香豆素分子。
4.根据权利要求1所述的可光降解的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于：所述的磁性纳米材料为羧基化Fe2O3磁球，所述的磁性纳米材料分散液的溶剂为超纯水，所述的光敏分子为7-氨基香豆素分子。
5.一种可光降解的磁性纳米材料，其特征在于：通过权利要求1～4任一项所述的方法制备得到。
6.一种可光降解的磁性纳米生物探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将1～100mg/mL权利要求1所制备的修饰有生物素的光敏分子与1～500mg/mL生物分子按照体积比1：0.1～10混合，孵育0.5～10小时后，与1～100mg/mL权利要求1所制备的共价修饰有链霉亲和素的磁性纳米材料分散液按照体积比1：0.1～10混合，孵育1～4小时后，经过磁力架分离1～20分钟，提取生物分子修饰的磁性纳米生物探针，即得到可光降解的磁性纳米生物探针。
7.根据权利要求6所述的可光降解的磁性纳米生物探针的制备方法，其特征在于：所述的生物分子为抗体、链霉亲和素、凝集素、生长因子、核酸适配体或蛋白；
所述的生物分子-生物素化光敏分子偶联物的制备方法，包括如下步骤：
1）将1～100mg生物素化光敏分子材料溶解于5mL体积比为1：0.1～1的水/乙醇溶液中，加入10～1000mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺活化10～30min；
2）加入1～100mg生物分子于上述EDC/NHS活化的生物素化光敏分子材料溶液中孵育1～4h。
8.一种可光降解的磁性纳米生物探针，其特征在于：通过权利要求6或7所述的方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的可光降解的磁性纳米生物探针，其特征在于：将生物分子加入权利要求8所述的可光降解的磁性纳米生物探针中，室温下孵育1小时，生物分子固定于可光降解的磁性纳米材料的表面。
10.根据权利要求8所述的可光降解的磁性纳米生物探针，其特征在于：将1～100mg/mL权利要求8所述的可光降解的磁性纳米生物探针在365nm或者800nm光照条件下照射1～120分钟，使光敏分子发生断键分解，破坏生物分子与纳米生物探针的连接。
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