CN114160106B - 一种氨基磁性纳米微粒的包被方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种氨基磁性纳米微粒的包被方法及其应用，包被方法包括以下步骤：将氨基磁性纳米微粒清洗后去除上清液，加入聚丙烯酸溶液和EDC溶液，震荡，得到含聚丙烯酸修饰的默克氨基磁性微粒的溶液；对所述含聚丙烯酸修饰的默克氨基磁性微粒的溶液磁吸后加入包被液和包被活材，再次震荡进行偶联反应，再次磁吸，采用封保液去除上清，再用封保液保存，得到包被的氨基磁性纳米微粒。本发明采用聚丙烯酸修饰至表面修饰为氨基的磁性纳米微粒，能够改善包被过程中的凝集及磁吸载机凝集，同时也可提高包被后的稳定性；还能提升体外诊断试剂盒的质量，提高客户的使用体验感。
Description
技术领域
本发明属于功能高分子改性技术领域，尤其涉及一种氨基磁性纳米微粒的包被方法及其应用。
背景技术
磁性纳米微粒是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料。因其具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性。因为其独有的特性使其在生物医学领域有广泛的应用，例如用作磁靶向药物、细胞或DNA分离和免疫诊断、磁共振成像等。其中在免疫诊断方面，磁性纳米微粒作为活材载体是体外诊断试剂中不可或缺的一部分。常见的磁性纳米微粒表面的功能基团主要包括羧基、氨基、羟基及甲苯磺酰基，其中表面修饰为羧基及氨基的磁性纳米微粒应用最为广泛；在包被效价方面，一些项目使用表面修饰为羧基的磁性纳米微粒包被效价会明显低于使用表面修饰为氨基的磁性纳米微粒，而使用表面修饰为氨基的磁性纳米微粒进行包被过程中，经常会出现包被过程中凝集，磁吸载机凝集等问题，通过研究发现，表面修饰为氨基的磁性纳米微粒使用戊二醛作为活化剂进行包被时，戊二醛本身会发生自聚反应导致磁性纳米微粒凝集；另外，活化清洗后残余的戊二醛同样会串联包被活材，使磁性纳米微粒表面的活材出现多层叠加的情况，导致磁吸载机凝集。
现有报道的文献或专利中，表面修饰为氨基的磁性纳米微粒进行包被，暂未发现有可以替代戊二醛的活化剂，或是可以兼容包被效价及凝集方面比较有效的修饰。常规的聚丙烯酸磁性纳米微粒包被效价较低，暂不满足在体外诊断领域中对效价的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种氨基磁性纳米微粒的包被方法及其应用，该方法能够明显改善磁性纳米微粒包被过程中的凝集和磁吸载机凝集现象。
本发明提供了一种氨基磁性纳米微粒的包被方法，包括以下步骤：
将氨基磁性纳米微粒清洗后去除上清液，加入聚丙烯酸溶液和EDC溶液，震荡，得到含聚丙烯酸修饰的默克氨基磁性微粒的溶液；
对所述含聚丙烯酸修饰的默克氨基磁性微粒的溶液磁吸后加入包被液和包被活材，再次震荡进行偶联反应，再次磁吸，采用封保液去除上清，再用封保液保存，得到包被的氨基磁性纳米微粒。
在本发明中，所述默克氨基磁性纳米微粒的氨基含量为30～70μmol/g，粒径为0.8～1.2μm；
所述聚丙烯酸的分子量为1800～5000g/mol。
在本发明中，所述包被液选自PBS缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和醋酸缓冲液；
所述包被活材选自糖类抗原199或人附睾蛋白4。
在本发明中，所述偶联反应的时间为1～3h；具体实施例中，偶联反应的时间优选为2h。
在本发明中，所述聚丙烯酸溶液和EDC溶液的质量比为1～8～12；
所述默克氨基磁性纳米微粒和聚丙烯酸溶液中聚丙烯酸的质量比为7～9：1。
在本发明中，所述封保液包括比为1000mL:(9.8～10.2)g:(0.98～1.02)mL:(0.98～1.02)mL的磷酸缓冲液、牛血清白蛋白、吐温-20和叠氮化钠；具体实施例中，所述封保液包括比为1000mL:10g:1mL:1mL的磷酸缓冲液、牛血清白蛋白、吐温-20和叠氮化钠。
所述聚丙烯酸溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml；
所述EDC溶液的浓度为5mg/ml～20mg/ml。
在本发明中，所述将氨基磁性纳米微粒采用PBS缓冲液清洗4～6次后去除上清液；采用封保液清洗4～6次去除上清。具体实施例中，所述氨基磁性纳米微粒采用PBS缓冲液清洗5次后去除上清液；采用封保液清洗5次去除上清。
本发明采用聚丙烯酸修饰至表面修饰为氨基的磁性纳米微粒，一方面改善了磁性纳米微粒表面的亲水性，另一方面将表面的氨基转化为大量的羧基可有效改变磁性纳米微粒表面的电势，同时在磁性纳米微粒与包被活材之间引入了一个桥梁，减少非特异性吸附，总体来说能够改善包被过程中的凝集及磁吸载机凝集，同时也可提高包被后的稳定性。
本发明提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述包被方法包被的氨基磁性纳米微粒。
上述方法采用聚丙烯酸对氨基磁性纳米微粒进行修饰，可显著改善氨基磁性纳米微粒在包被过程中的凝集及磁吸载机凝集，进而可提升体外诊断试剂盒的质量，提高客户的使用体验感。
附图说明
图1为戊二醛包被工艺和本发明包被工艺制备的改性磁微粒的磁吸载机分散性的对比图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种氨基磁性纳米微粒的包被方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：包被磁微粒HE4(人附睾蛋白4)的过程：
取默克氨基磁性纳米微粒(100mg/ml，40μl)，清洗5次(0.1MPBS 400μl×5次)去除上清，加入50μl(1mg/ml，MES缓冲液溶解)的聚丙烯酸溶液和50μl(20mg/ml，MES(即2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液溶解)的EDC溶液，快速混匀器震荡均匀后放置振荡器上震荡2h；
使用磁铁磁吸后去除上清，加入包被液85μlMES缓冲液和15ulHE4包被活材，快速混匀器震荡均匀后放置振荡器上震荡2h；
使用HE4封保液清洗5次(400μl×5次)，封保定容至3mL；所述封保液包括0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.4)1000mL中加入10g BSA、1mL的吐温20(表面活性剂)及1mL的叠氮化钠(防腐剂)。
实施例2：包被磁微粒CA199的过程：
取默克氨基磁性纳米微粒(100mg/ml，40μl)，清洗5次(0.1M PBS 400μl×5次)去除上清，加入50ul(1mg/ml，PBS溶解)的聚丙烯酸溶液和50μl(10mg/ml，0.1M PBS溶解)的EDC溶液，快速混匀器震荡均匀后放置振荡器上震荡2h；
使用磁铁磁吸后去除上清，加入包被液85μl 0.1M PBS缓冲液和15μlCA199(糖类抗原199)包被活材，快速混匀器震荡均匀后放置振荡器上震荡2h；
使用CA199封保液清洗5次(400μl×5次)，封保定容至3mL；所述封保液包括0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.4)1000mL中加入10gBSA、1mL的吐温20(表面活性剂)及1mL的叠氮化钠(防腐剂)。
本发明采用安图生物A2000Plus型号的检测仪器对实施例1和实施例2制备的试剂盒进行包被效价对比，均分别采用戊二醛包被工艺和本发明的包被工艺包被两份，一份进行磁吸过夜并载机，一份进行上机验证：
表1两种包被工艺包被微粒后上机发光值和聚丙烯酸纳米微粒包被效价
从表1可以看出：实施例1和实施例2制备的磁微粒HE4和磁微粒CA199的包被效价均不低于使用戊二醛包被的效价；CA199使用本发明提供的包被工艺后的信号值明显高于直接使用聚丙烯酸磁性纳米微粒(EDC/NHS活化)包被工艺的信号值，在体外诊断应用领域，本发明工艺更具有可应用性。
图1为戊二醛包被工艺和本发明包被工艺制备的改性磁微粒的磁吸载机分散性的对比图；从图1可以看出：采用本发明提供的包被工艺制备的改性磁性粒子磁吸过夜载机30min后分散性明显优于使用戊二醛工艺包被的。
由以上实施例可知，本发明提供了一种氨基磁性纳米微粒的包被方法，包括以下步骤：将氨基磁性纳米微粒清洗后去除上清液，加入聚丙烯酸溶液和EDC溶液，震荡，得到含聚丙烯酸修饰的默克氨基磁性微粒的溶液；对所述含聚丙烯酸修饰的默克氨基磁性微粒的溶液磁吸后加入包被液和包被活材，再次震荡进行偶联反应，再次磁吸，采用封保液去除上清，再用封保液保存，得到包被的氨基磁性纳米微粒。本发明采用聚丙烯酸修饰至表面修饰为氨基的磁性纳米微粒，一方面改善了磁性纳米微粒表面的亲水性，另一方面将表面的氨基转化为大量的羧基可有效改变磁性纳米微粒表面的电势，同时在磁性纳米微粒与包被活材之间引入了一个桥梁，减少非特异性吸附，总体来说能够改善包被过程中的凝集及磁吸载机凝集，同时也可提高包被后的稳定性；还能提升体外诊断试剂盒的质量，提高客户的使用体验感。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种氨基磁性纳米微粒的包被方法，包括以下步骤：
将氨基磁性纳米微粒清洗后去除上清液，加入聚丙烯酸溶液和EDC溶液，震荡，得到含聚丙烯酸修饰的氨基磁性纳米微粒的溶液；
对所述含聚丙烯酸修饰的氨基磁性纳米微粒的溶液磁吸后加入包被液和包被活材，再次震荡进行偶联反应，再次磁吸，采用封保液去除上清，再用封保液保存，得到包被的氨基磁性纳米微粒；
所述氨基磁性纳米微粒的氨基含量为30~70µmol/g，粒径为0.8~1.2µm；所述聚丙烯酸的分子量为1800~5000g/mol；
所述聚丙烯酸溶液和EDC溶液的质量比为1:8~12；所述聚丙烯酸溶液的浓度为0.5~1.5mg/ml；所述EDC溶液的浓度为5mg/ml~20mg/ml；
所述氨基磁性纳米微粒和聚丙烯酸溶液中聚丙烯酸的质量比为7~9：1；
所述包被液选自PBS缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和醋酸缓冲液；
所述包被活材选自糖类抗原199或人附睾蛋白4；
所述封保液包括比为1000mL:(9.8~10.2)g: (0.98~1.02)mL: (0.98~1.02)mL的磷酸缓冲液、牛血清白蛋白、吐温-20和叠氮化钠。
2.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述偶联反应的时间为1~3h。
3.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，将氨基磁性纳米微粒采用PBS缓冲液清洗4~6次后去除上清液；
采用封保液清洗4~6次去除上清。
4.一种试剂盒，包括权利要求1~3任一项所述方法制备的氨基磁性纳米微粒。
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