JPH04501313A - 新規な生体適合性中間コーティングを有する免疫反応体キャリアー及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な生体適合性中間コーティングを有する免疫反応体キャリアー及びその製造 方法葺歪公団 この発明は一般には、イムノアッセイ用のミクロスフェア又はビーズのような免 疫反応体キャリアーに関し、更に詳しくは、イムノアッセイ用の単一結合対の抗 原又は抗体が接合されるべき新規な中間生体適合性タンパク質又は多糖コーティ ングを有する免疫反応体キャリアー、及びこのキャリアーの製造方法における改 善に関するものである。

ｉ景且歪 イムノアッセイの分野においては、一対の結合要素の抗体又は抗原のような、単 一結合対の要素の一方のためのキャリアーとして、ミクロスフェア又はビーズを 使用することが知られている。通例のイムノアッセイ法においては、アッセイす べき抗原と結合するように選択された特異的標識抗体によってこのキャリアーを コートし、試験すべき体液の試料に対してこのコートしたキャリアーを供給する 。こうして得た、抗体をコートしたキャリアーと結合抗原との複合体を検出し、 既知の手法で測定してこのアッセイの結果を決定する。

他の既知の方法においては、選択した綱の細胞に選択的に結合スるモノクローナ ル抗体でコートされた磁性ミクロスフェアを使用して、選択した綱の血液細胞を 試験血液試料から除去し、モノクローナル抗体と結合細胞との複合体を形成し、 次いで複合化していない細胞を試験試料から除去して結合細胞を分離する。米国 特許第４．７４３，５４３号には、試験試料から赤血球を除去し、この後に残っ た白血球を研究できるようにする方法が記載されている。

免疫反応体要素によってコートされた磁性又は非磁性キャリアーのいずれかを使 用する、これらの方法及びその他の既知の方法は、必要な単一結合対の第二の要 素をキャリアーのコーティングへと適切かつ有効に結合させることを企図してい る。

血清アルブミン、卵白アルブミン、及びラクトアルブミンのような不活性タンパ ク質の固相キャリアー粒子上への吸着と、これに続くコートしたキャリアー粒子 上への抗原又は抗体の吸着は、米国特許第３．５５１．５５５号に記載されてい る。

キャリアー粒子上にタンパク質を保持するために、架橋法もまた使用されてきた ０例えば、米国特許第４．５９０．１７０号の開示によれば、ゼラチンのような タンパク質をその周壁に含有する、水に不溶性のマイクロカプセルが、酸性溶液 中で抗原又は抗体に架橋されている。この方法では、酸性９８で負に荷電された マイクロカプセルを使用しなければならない。

米国特許第４．１２３，３９６号に記載する方法では、タンパク質に共有結合し うる金属含有重合性ミクロスフェアを調製する。このミクロスフェアの安定性と 寸法とを水溶液及び有機溶媒のいずれにおいても維持できるようにするために、 タンパク質とミクロスフェアとを架橋することが好ましい。

米国特許第４．４７８．９４６号の教示では、租らしたガラスピーズのようなキ ャリアーに、膜を形成する「第一層のＪタンパク質をビーズに架橋させ、続いて 「第二層の」抗体又は抗原を共有結合させる。この第一層は、部分的に又は全体 にゼラチンのようなタンパク質からなっていてよい。膜を形成する第一層がゼラ チンのようなタンパク質から部分的に又は全体に構成されている場合には、必要 な抗体又は抗原は少ない。しかし、架橋法では、ビーズ上に第一層を保持しなけ ればならない。

こうした免疫反応ミクロスフェアを準備するのに際して望ましい利益の一つは、 抗体をビーズ表面へと所望の高い割合で結合させることである。

他に望ましい利益は、中間生体適合性コーティングをミクロスフェアに直接に適 用させうることであり、このコーティングは、抗体又は抗原がコーティングへと 直接に接合するのを可能にするであろう。

更に他の望ましい利益は、ここで本発明によって、ミクロスフェア又はビーズに コートされた抗体又は抗原の使用量を減らし、しかも所望のイムノアッセイ測定 を達成できることである。

既に列挙した望ましい利益及び明らかにされるであろう他の利益のすべては、こ こで開示した本発明を体現する方法に由来するものである。これに付随する利益 は、イムノアッセイキット及び／又は方法用に、本発明の前記方法によって調製 した、免疫反応体をコートしたミクロスフェアを製造することである。

光亙豊皿示 本発明は、キャリア一本体の表面上に中間結合因子なしに直接保持された生体適 合性コーティング培地と、このコーティング培地へと三官能試薬によって共有結 合された免疫反応体とを有する免疫反応体キャリアーを提供し、このキャリアー を製造する方法を提供する。

本発明の一つは、キャリア一本体の周面を生体適合性タンパク質ゲルで疎水性相 互作用によってコートすることを含む、このキャリアーをコートした後、抗原又 は抗体のような、単一結合対の免疫反応体要素を、このコートしたキャリアーに 共有結合させて免疫反応体キャリアーを形成する。

本発明の提供する他の方法では、キャリアーを生体適合性りンパク質ゲル又は多 糖で共有結合によってコートする。次いで、生体適合性培地でコートしたキャリ アーを、単一結合対の免疫反応体要素へと共有結合させ、免疫反応体キャリアー を形成する。

の　の ここで中間コーティング培地を記述するのに使用した用語「生体適合性」は、体 液試験試料の免疫反応や他の要素と非特異的に相互作用しないと共に阻害せず、 かつこの免疫反応に関与する免疫反応体に悪影響を与えないような培地を意味す るものである。

ここで使用した用語「免疫反応体」は、抗原又は抗体複合体の形成におけるよう に、単一結合対の反応要素の一つでありうる物質を意味するものである。

本発明の実施に使用する試薬を以下のように描記する。

跋１夏１記 によ　てミクロスフェア　コー　るための亙立±ヱ遣丘 ゼラチン粉末（シグマケミカル社から入手可能）又は、ゼラチンカプセル（エリ 　リリイアンド社：　Ｅｌｆ　Ｌｉ１ｌｙ　＆Ｃｏ、から入手可能）： ｐＨ７，３で０．１％のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ） に１０＋ｗｇ／ｍｌ溶解。

」ｔ３１１Ｋ］互Ｊこ　々　ロ　コー　・　゛−゛且丘 塩化ナトリウム　０．２　Ｍ ＥＤＡＣ（０，２Ｍ　ＮａＣｔ中に２　ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジ メチルアミノプロピル〕カルボジイミド　ヒドロクロリド）ゼラチン粉末（シグ マケミカル社から入手可能）：又はゼラチンカプセル（エリ　リリイアンド社か ら入手可能）：ｐＨ７，３で０．１のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中に２ ０ｍｇ／ｓｌ溶解。

グリシン（１−１の水中に２０ｍｇ） 水（０，１％のアジ化ナトリウムを含有する）笈金方迭人 リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　ｐＨ７，３０，１％のアジ化ナトリウムを含有する 。

三官能試薬、例えばスルホ−５ＭＣＣ（ＰＢＳ中に２　ｓａｇ／ｍｌのスルホス クシンイミジル−４−〔Ｎ−マレイン酸イミドメチル〕シクロヘキサン−１−カ ルボキシレート）、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ＋５ｉｃａｌ　Ｃ ｏ、　）から入手可能２−イミノチオラン　ヒドロクロリド（ＰＢＳ中に２　ｍ ｇ／■ｌ）；ピアスケミカル社から入手可能 免疫反応体　＞１０ｍｇ／ｍ１ Ｌ−システィン（ＰＢＳ中に５　ｍｇ／ｍｌ）ヨードアセトアミド（ＰＢＳ中に ３０ｍｇ／■ｌ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　（０，１％アジ化ナトリウム を含有するＰＢＳ中）　１％ １Ｍホウ酸塩　ｐ）！　９．８ 接金去抜旦 ２−イミノチオラン　ヒドロクロリド（ＰＢＳ中に２　＋ｗｇ／ｍｌ）三官能試 薬、例えば スルホ−５ＭＣＣＣＰＢＳ中に１　ｍｇ／ｓｌのスルホスクシンイミジル−カル ボキシレート）、ピアスケミカル社から入手可能免疫反応体　＞１（ｌａｇ／ｍ ｌ Ｌ−システィン（ＰＢＳ中に５−ｇ／■ｌ）ヨードアセトアミド（ＰＢＳ中に２ ０ｍｇ／ｍｌ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（　０．１％アジ化ナトリウムを 含有するＰＢＳ中）　１％ １Ｍホウ酸塩　ｐＨ　９．８ 炙薯箪丘■貞製 デキストラン　Ｔ−４０（分子量４０．０００ドルトン）、又はデキストラン　 Ｔ−１１０　（分子量１１０．０００　ドルトン）、又はデキストラン　Ｔ−５ ００　（分子量５００，０００　ドルトン）、又はデキスト−７７７−２Ｍ（分 子量２，０００．０００　ドルトン）　、　フル力　ファルマシア（Ｆｌｕｋａ 　Ｐｈａｒｍａｃｅａ　）がら入手可能；又は、フィコール（分子量７０．００ ０ドルトン）、シグマケミカル社から入手可能　５ｇ 酢酸カリウムｐＨ　６．５　５０ｓ＋Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム（６．２５ｍｌ　 ＜７）水中ニ０．５３５ｇ）　８５．６１１ｇ／ｍ１１、３−ジアミノプロパン （５−１の水中に５−１．氷酢酸によってｐＨ８．７に調製した）　〜１７ー１ 水素化ホウ素ナトリウム（２．５ｍｌのＯ．ｂｓＭ水酸化ナトリウム中に０．　 ２ｇ）　、アルドリッチ　ケミカル社から入手可能　８ｏＩｍｇ／ｍｌ のミ　ロス　エアへの丑　Ａ 塩化ナトリウム　２００ｍＭ アミノ誘導体化多糖　３．７５−ｇ７’＝ｉ１１！ＤＡＣ（１−エチル−３−〔 ３−ジメチルアミノプロピル〕カルボジイミド　ヒドロクロリド、　０．２　Ｍ ＮａＣｌ中に１抛ｇ／ｍｌ）水（０．１％アジ化ナトリウムを含有する）−豐々 　ロ　ヘ　ム アミノ多糖でコートしたビーズは、三官能試薬を用いること試薬を幾つか例示す る。

グルタルアルデヒド ビス（スクシンイミジル）スペリン酸 ５ｐｐｏ　＜スクシンイミジル３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオネート） ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−〔Ｎ−マレイン酸イミドメチル〕シクロヘキ サン−１−カルボキシレート）ＳＩＡＢ　（スクシンイミジル〔４−ヨードアセ チルコアミノベンゾエート） ＳＭＰＢ　（スクシンイミジル４−（１−マレイン酸イミドフェニル）ブチレー ト） 生体適合性中間コーティング培地は、タンパク質又は多糖であってよい。一つの 好適例においては、この中間コーティング培地は、ゼラチンのようなタンパク質 である。商業的に入手可能なゼラチンは、それらの粘度及びそれらの水溶液のゲ ル強度（又はブルームレベル）に従って等線分けされている。ブルームレベルが ６０〜３００の間にある、種々の商業的に入手可能なブタ及びウシゼラチンを、 予備実験において試験した。ゼラチンカプセルも試験した。ゼラチンのブルーム レベルを上昇させると、ミクロスフェアのコーティングを高品質にできることが 判明した。また、ウシゼラチンの方がブタゼラチンよりも好ましいように見えた 。カプセルからのゼラチンが、試験したすべてのゼラチンのうちで好ましいゼラ チンであった。

また、生体適合性中間コーティング培地も多糖であってよい。

試験した多糖には、デキストランＴ−４０（分子量４０．０００　ドルトン）、 テキＸ　）　ラフＴ−１１０（分子量１１０．０００ドルトン）、テキストラン Ｔ−５００（分子量５００，０００ドルトン）、デキストランＴ−２Ｍ（分子量 ２．０００．０００ドルトン）、フル力（Ｐｌｕｋａ）　、ファルマシアＣＰｈ ａｒｍａｃｅａ）　、及びフィコール（分子量７０．０００　ドルトン）、シグ マケミカル社を含む。

試験した商業的に入手可能なミクロスフェアには、ジビニル−ベンゼン／ポリス チレン磁性ミクロスフェア（０，７ミクロン、２０％磁性；０．７　ミクロン、 ４２％磁性；及び１．５ミクロン、１３％磁性）、セラーアン（Ｓｅｒａｇｅｎ ）社を含む；また非磁性ミクロスフェアも使用できる。試験したミクロスフェア の直径寸法は０．７〜１．５　ミクロンの範囲に亘るけれども、これらの試験し た直径より大きいか又は小さい直径寸法も採用できる。

免疫反応体は、適用すべきイムノアッセイ系に従って、標識しても標識しなくと もよい、好ましいｍｍとしては、酵素、放射性元素又は染料が挙げられる。

免疫反応体キャリアーの調製は、四つの基本工程を含む。工程Ｉにおいてはキャ リアーを洗浄する。この洗浄剤と方法とは、生体適合性培地と、この生体適合性 培地をキャリアー上に付着させるために用いるコーティング法との双方に依存す る。

工程ＩＩにおいて、生体適合性培地の溶液を調製する。ここでも、試薬と方法と は、いかなるコーティング培地を用いるか、いかなるコーティング法を採用する かによって変更しうる。

工程ＩＩＩにおいては、生体適合性培地の溶液をキャリアー上にコートし、過剰 のコーティング培地を除去する。生体適合性コーティング培地としてゼラチンを 使用する場合は、コーティング法は疎水性相互作用又は共有結合のいずれによっ てもよい。

多糖を使用する場合、このコーティング法は共有結合による。

生体適合性コーティング培地によってコートしたキャリアーは、工程ＩＶに先立 って既知の照射技術によって滅菌できる。

工程ＩＶにおいては、三官能試薬を用いることによって、生体適合性培地でコー トされたキャリアーに免疫反応体を共存結合させる。

・　キャ１アーの　′： 工程Ｉにおいては、０．７　ミクロン、４２％磁性ミクロスフェアを含有する１ ミリリツトル（＃１）の１０％懸濁液を、ＰＢＳ及び０．１％アジ化物によって ４ｍｌに希釈し、０．１％アジ化ナトリウムのような静菌性因子を含有するリン 酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を４ｍｌ用いて３回洗浄し、通例の方法で回収する。

次いで、工程ＩＩでは、ゼラチン溶液を調製する。ゼラチン粉末又はカプセルを 秤量し、次いでＰＢＳと混合してｌｈｇ／＋＋＋１の濃度を得る。このゼラチン 溶液が透明になるまで、この溶液を磁気撹拌板上で約５０℃まで緩やかに加熱す る。このゼラチン溶液を、更に使用するのに先立って、撹拌しながら室温まで冷 却する。

次に、工程ＩＩＩでは、このゼラチン溶液を疎水性相互作用によってミクロスフ ェア上へとコートする。４−１のゼラチン溶液を、洗浄剤のミクロスフェアと混 合し、水浴中室温で１分間音波処理し、３〜１６時間ローラー混合する。この懸 濁液を、各洗浄毎に４ｍｌのＰＢＳと０．１％のアジ化物とを用いて４回通例の 方法で洗浄することによって、過剰のゼラチンを除去する。このミクロスフェア を、容積４ｍｌのＰＢＳ及び０．１％アジ化物に再懸濁し、使用時まで４℃で貯 蔵する。

また、０．７　ミクロン、２０％磁性ミクロスフェア及び１．５ミクロン、１３ ％磁性ミクロスフェアも、この方法で調製した。工程ｎ、免疫反応体への接合方 法Ａ又は方法Ｂによる共有結合のために、ミクロスフェアをこうして調製し、準 備する。

接治Ｊ蒼１Ｎ 疎水性相互作用によってゼラチンでコートされたミクロスフェアの２．５％懸濁 液２＋１を、ＰＢＳ　２ｍｌに再懸濁する。２７マイクロリツトル（μｌ）のス ルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイン酸イミド−メチルコシクロヘキサン −１−カルボキシレート（スルホ−５ＭＣＣ）を、このミクロスフェア懸濁液へ と加え、この混合物を１時間室温でローラー混合する０次いで、この混合物を、 各洗浄毎に２ｍｌのＰＢＳによって通例の方法で４回洗浄し、容積２ｍｌのＰＢ Ｓに再懸濁し、使用時まで４℃で貯蔵する。

次いで、「アール、ジュー等（Ｒ，Ｊｕｅ　ｅｔ　ａｌ）、バイオケミストリー （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１７　：　５３９９．１９７８年」の方法に従 って、この免疫反応体を２−イミノ−チオラン　ヒドロクロリドを用いてチオー ル化する。この方法では、１０ｍｇ／ａｉ１を超える濃度の免疫反応体（２Ｂ） を、１３μｍの２−イミノチオラン　ヒドロクロリドと１時間２２°Ｃで反応さ せる。このチオール化免疫反応体をゲル濾過によって分離し、そのタンパク質濃 度を分光光度計において２８０ナノメートル（ｎ−）での吸収によって測定する 。次イテ、ｌＩＩｇノチオール化免疫反応体を、スルホ−３ＭＣＣで活性化した ミクロスフェア２ｍｌに加え、２時間室温で反応させる。２４０〃ｌのシスティ ンをこの懸濁液へと１５分間加え、続いて２４０μｌのヨードアセトアミドで処 理し、続いて２４０ｕ１の１Ｍホウ酸塩緩衝液で処理することによって、この反 応をクエンチする。次いで、１時間後、このミクロスフェアを少なくとも１時間 １％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、通例の方法で各洗浄毎に１％ ＢＳＡ　４　ｍｌを用いて４回洗浄し、容積２１（７）１％ＢＳＡに再懸濁し、 ２．５％懸濁液を得る。

■金方抜旦 また、コートしたミクロスフェアの２．５％懸濁液４ｍｌを、４０μｍの２−イ ミノチオラン　ヒドロクロリドによって室温で１時間処理し、各洗浄毎に４−１ のＰＢＳを用いて通例の方法で４回洗浄し、３．８ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、使 用前に４℃で貯蔵した。

次いで、１ｍｇの免疫反応体を、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で４ ０μｌのスルホ−５ＭＣＣによって、１時間室温で処理する。

次いで、この処理済み免疫反応体をＰＢＳでセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ）　Ｇ−５０カラムに通過させ、タンパク質のピークを集め、このタンパク質濃 度をＡ２．。値がら計算する。この修飾した免疫反応体０．４−ｇを、４ｍｌの チオール化したミクロスフェアに加える。この懸濁液を室温で２時間ローラー混 合する。この懸濁液へと反応容量１＋ｍｌ当り１２０ＩＪｌのシスティンを１５ 分間加えることによって、この反応をクエンチする。この懸濁液へと反応容量１ ｍｌ当りそれぞれ１２０μｌのヨードアセトアミドと１Ｍホウ酸塩とを加え、３ ０分間室温でローラー混合することによって、遊離のスルフヒドリル基をキャッ プする。次いで、このミクロスフェアを１％ＢＳＡによって１時間室温でブロッ クし、各洗浄毎に４ｍｌの１％ＢＳＡを用いて４回洗浄し、１％ＢＳＡ　４　ｍ ｌへと再懸濁し、使用時まで４°Ｃで貯蔵した。

また、ゼラチンをミクロスフェア上に共有結合させる。この方法の工程Ｉにおい ては、０．７ミクロン、４２％磁性ミクロスフェアの１０％懸濁液１ｍｌを、３ ｍｌの０．２Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣ１）で希釈し１通例の方法で４ｍ＋１の ０．２Ｍ　ＮａＣ１によって一度洗浄し、容積４ｍｌの０．２Ｍ　ＮａＣ１に懸 濁する。次いで、このミクロスフェアを、１５μｌの１−エチル−３−〔３−ジ メチルアミノプロピル によって１５分間処理する。

この処理時間の間に、ゼラチン溶液を調製する（工程ＩＩ）。

ゼラチン粉末又はカプセルを秤量し、次いでＰＢＳと混合し、２０Ｂ／ｍｌの濃 度とする。このゼラチン溶液が透明になるまで、この溶液を磁気撹拌板上で約５ ０°Ｃまで穏やかに加熱する．このゼラチン溶液を更に使用する前に、撹拌して 室温まで冷却する。

次いで、工程ＩＩＩでは、ミクロスフェアを３０秒間浴中で音波処理し、５００ μｍのゼラチン溶液で処理し、再び３０秒間浴中で音波処理し、終夜室温でロー ラー混合する。この被処理ミクロスフェアへと１００μｌのグリシンを３０分間 加えることによって反応を停止させる。次いで、このミクロスフェアを、通例の 方法で各洗浄毎に４ｍｌの水によって４回洗浄し、０．１％のアジ化ナトリウム を含有する容積４ｍｌの水中に再懸濁し、濃度を２．５％として使用時まで４° Ｃで貯蔵する。

工程ＩＶでは、これらのコートしたミクロスフェアを、接合方法Ａによって免疫 反応体と共有結合させる。

また、このキャリアーを多糖でコートすることができる。このコーティング方法 の工程Ｉでは、０．７ミクロン、４２％磁性ミクロスフェアの１０％懸濁液１８ ｍｌを、２００ｓＭ　ＮａＣ１によって７２−１まで希釈し、２００ｍｌの２０ ０＋＊Ｍ　ＮａＣ１によって一度洗浄する。

ついで、工程ＩＩでは、多糖溶液を調製する。Ｔ−４０用のアール・ニス・モル ディ及びエル・エル・モルディ（Ｒ．Ｓ，　ＭｏｌｄａＹａｎｄ　Ｌ．　Ｌ．　 Ｍｏｌｄａｙ）の方法（ＦＥＢＳ　レターズ１７０，　Ｎｏ．２　：　２３２。

１９８４年）をここで記載するようにして適用した．５ｇのデキストランを３７ ．５＋ｗｌの酢酸カリウムに溶解し、過ヨウ素酸ナトリウムの調製溶液で処理し 、２０〜２５°Ｃで１０分間激しく撹拌し、２０〜２５℃で１時間３０分反応さ せる。この溶液を５回、４℃で１〜２時間各聞咎リットルの水に対して徹底的に 透析する。次いで、この溶液を１，３−ジアミノプロパンの調製溶液に対して、 激しく撹拌しながら滴下する。この混合物を、２時間１５分の間室部で磁気撹拌 板上で撹拌し、次いで水素化ホウ素ナトリウムの調製溶液÷１５分間室温で還元 する。この混合物を４°Ｃで水に対して徹底的に透析し、０．２２ミクロンのフ ィルターを通して濾過し、４℃で貯蔵する。

次の多糖のアミノ誘導体をこの方法で調製した：デキストランＴ−４０，デキス トランＴ−１１０，デキストランＴ−５００゜デキストラン−２Ｍ及びフィコー ル。

次に、工程ＩＩＩでは、このアミノ誘導体化多糖を、カルボジイミド試薬を用い てミクロスフェアに共有結合させる。このアミノ誘導体化多糖を３．７５　ｍｇ ／ｍｌで含有する２００Ｉ＋Ｍ　ＮａＣ１７２ｍｌに対し、洗浄済のミクロスフ ェアを再懸濁する０次いで４５０μｌのＨＤＡＣをこの懸濁液へと加え、この懸 濁液を終夜室温でローラー混合する。このミクロスフェアを７２ｍ１の水で３回 洗浄し、０．１％のアジ化ナトリウムを含有する水７２ａｍｌに再懸濁する。

この方法によって多糖でコートした他のミクロスフェアには、１．５　ミクロン 、１３％磁性ミクロスフェア及び０．７ミクロン、２０％磁性ミクロスフェアを 含む。

工程ＩＶでは、この多糖でコートしたミクロスフェアを、接合方法Ａ又は接合方 法Ｂのいずれかによって免疫反応体に共有結合させる。好ましい方法は、接合方 法Ａで既述したように、チオール化免疫反応体とＳＭＣＣ−処理ミクロスフェア とを用いた方法である。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年４月１０日

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．キャリアー本体の表面上に中間結合因子なしに直接保持された生体適合性コ ーティング培地と、このコーティング培地に二官能試薬によって共有結合された 免疫反応体とを有する免疫反応体キャリアー。
2. ２．前記コーティング培地が、タンパク質ゲル又は多糖からなる群より選択され ている、請求項１によるキャリアー。
3. ３．前記コーティング培地が実質的にタンパク質ゲルからなる、請求項１による キャリアー。
4. ４．前記コーティング培地が実質的に多糖からなる、請求項１によるキャリアー 。
5. ５．前記多糖がデキストラン又はフィコールである、請求項４によるキャリアー 。
6. ６．前記キャリアー本体が固体である、請求項２によるキャリアー。
7. ７．前記キャリアー本体がミクロスフェア又はビーズである、請求項６によるキ ャリアー。
8. ８．前記キャリアー本体が磁性である、請求項７によるキャリアー。
9. ９．前記キャリアー本体がポリスチレンである、請求項７によるキャリアー。
10. １０．前記免疫反応体が、要素の単一結合対の抗原又は抗体である、請求項１に よるキャリアー。
11. １１．前記免疫反応体が、酵素、放射性元素又は染料からなる群より選ばれた検 出要素によって標識されている、請求項９によるキャリアー。
12. １２．単一結合対の抗原又は抗体のいずれかに対して結合するイムノアッセイ用 免疫反応体キャリアーであって、疎水性相互作用によってキャリアー本体の周面 にタンパク質ゲル又は多糖のいずれかがコートされており、かつ前記結合対の要 素のうちの一方が前記のコーティングに対して共有結合しているキャリアー。
13. １３．前記キャリアー本体が固体ミクロスフェアである、請求項１２によるキャ リアー。
14. １４．前記キャリアー本体の性質が磁性である、請求項１３によるキャリアー。
15. １５．前記キャリアー本体がポリスチレンである、請求項１３によるキャリアー 。
16. １６．前記免疫反応体が、酵素、放射性元素又は染料からなる群の検出要素によ って標識されている、請求項１２による免疫反応体キャリアー。
17. １７．前記多糖がデキストラン又はフィコールである、請求項１２によるキャリ アー。
18. １８．前記多糖がアミノ誘導体化されている、請求項１７によるキャリアー。
19. １９．単一結合対の抗原又は抗体のいずれかに対して結合するイムノアッセイ用 の免疫反応体キャリアーを調製する方法であって、疎水性相互作用によってキャ リアー本体の周面にタンパク質ゲルをコートすることと、前記キャリアー本体の 前記面をコートする前記タンパク質ゲルに対して単一結合対の一方の要素を共有 結合させることとを含む方法。
20. ２０．タンパク質ゲルがコーティング用の溶液中にある、請求項１９による方法 。
21. ２１．前記抗原又は抗体を、二官能試薬によってタンパク質ゲルコーティングに 対して共有結合させる、請求項１９による方法。
22. ２２．タンパク質ゲルとキャリアー本体とを３〜１６時間、環境気温で混合する ことによって、前記タンパク質ゲルをキャリアー本体の周面に結合させる、請求 項１９による方法。
23. ２３．単一結合対の抗原又は抗体のいずれかに対して結合するイムノアッセイ用 免疫反応体キャリアーを調製する方法であって、共有結合によってキャリアー本 体の周面上にタンパク質ゲル又は多糖をコートすることと、前記キャリアー本体 をコートする前記タンパク質ゲル又は多糖に対して単一結合対の一方の要素を共 有結合させることとを含む方法。
24. ２４．前記多糖がデキストラン又はフィコールである、請求項２３による方法。
25. ２５．前記タンパク質ゲル又は多糖が溶液中にある、請求項２３による方法。
26. ２６．前記多糖を、前記キャリアー本体と共有結合させるのに先立ってアミノ誘 導体化する、請求項２３による方法。
27. ２７．単一結合対の抗原又は抗体と共に検出可能な複合体を形成するイムノアッ セイ用免疫反応体キャリアーを調製する方法であって、 Ａ．タンパク質ゲル又は多糖からなる生体適合性培地によって直接にキャリアー の周面をコートすることと、Ｂ．単一結合対の抗原又は抗体のいずれかからなる 免疫反応体に前記培地を共有結合させることとを含む方法。
28. ２８．酸素、放射性元素又は染料からなる群の検出要素によってキャリアーを標 識し、検出可能な複合体を形成する、請求項２７の方法。
29. ２９．前記多糖がデキストラン又はフィコールである、請求項２７の方法。
30. ３０．前記多糖がアミノ誘導体化されている、請求項２９の方法。
31. ３１．タンパク質ゲルからなる前記生体適合性培地を疎水性相互作用によってコ ートする、請求項２７の方法。
32. ３２．前記生体適合性コーティング培地を共有結合によってコートする、請求項 ２７の方法。