JPS5855759A - 二重抗体接合体 - Google Patents
二重抗体接合体Info
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- JPS5855759A JPS5855759A JP57154076A JP15407682A JPS5855759A JP S5855759 A JPS5855759 A JP S5855759A JP 57154076 A JP57154076 A JP 57154076A JP 15407682 A JP15407682 A JP 15407682A JP S5855759 A JPS5855759 A JP S5855759A
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- antigen
- specific
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- G—PHYSICS
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- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫学的検定の分野に関するものであ′り且つ
更に詳細にはへテロ−2官能性カツプリング剤の使用に
よる異なる特異性の免疫グロブリンの連結によって形成
せしめた免疫学的検定試薬に関するものである〇 細菌性物質による人体の侵襲及びそれによって生じる感
染は、多様なまたFi最低限度の病的作用のために、診
断が困難なことが多い。免疫学、すなわち、人体への異
物の侵入に対する免疫応答の研究は、それ自体、2部類
の高分子に関係する。
更に詳細にはへテロ−2官能性カツプリング剤の使用に
よる異なる特異性の免疫グロブリンの連結によって形成
せしめた免疫学的検定試薬に関するものである〇 細菌性物質による人体の侵襲及びそれによって生じる感
染は、多様なまたFi最低限度の病的作用のために、診
断が困難なことが多い。免疫学、すなわち、人体への異
物の侵入に対する免疫応答の研究は、それ自体、2部類
の高分子に関係する。
これらの部類、抗原及び抗体、は特異的に反応する。侵
入する異物すなわち抗原蝶一般に付随する2性質、免疫
原性、すなわち、相当する抗体の生成を刺激する能力、
及びそれらの抗体と特異的に反応する能力を有している
。抗体自体拡、その特異的抗原との反応のために抗原の
存在に応答して生成する蛋白質である。抗体は免疫グロ
ブリンと呼ばれる特別なグループの血清蛋白質に輌する
。
入する異物すなわち抗原蝶一般に付随する2性質、免疫
原性、すなわち、相当する抗体の生成を刺激する能力、
及びそれらの抗体と特異的に反応する能力を有している
。抗体自体拡、その特異的抗原との反応のために抗原の
存在に応答して生成する蛋白質である。抗体は免疫グロ
ブリンと呼ばれる特別なグループの血清蛋白質に輌する
。
抗体のグループは、抗原と特異的に反応することができ
る限られたグループの蛋白質から成っているけれども、
蛋白質、多くの多糖類、核蛋白質、リボ蛋白質、多くの
合成ポリペプチド並びに蛋白質または合成ポリペプチド
に適尚に結合している場合のその他多くの小さい分子を
包含する0抗原として働らくことができる多樵多様な高
分子が存在する。
る限られたグループの蛋白質から成っているけれども、
蛋白質、多くの多糖類、核蛋白質、リボ蛋白質、多くの
合成ポリペプチド並びに蛋白質または合成ポリペプチド
に適尚に結合している場合のその他多くの小さい分子を
包含する0抗原として働らくことができる多樵多様な高
分子が存在する。
抗体−抗原反応の%異性は、病的状態であるかまたは正
常状態であるかの診断において、且つ更に特定的には、
抗原性決定子、すなわち、抗体−抗原反応の特異性を決
定する抗原分子の限られた部分、の存在の確定において
、利用されている。
常状態であるかの診断において、且つ更に特定的には、
抗原性決定子、すなわち、抗体−抗原反応の特異性を決
定する抗原分子の限られた部分、の存在の確定において
、利用されている。
この分野の熟紳者の知識に従って、抗原−抗体反応は、
高感度t−有する酵素免疫学的検定(EIA)、放射線
免疫学的検定(PIA)また蝶免疫螢光(IF)の各方
法によって明示することができるけれども、しかしなが
ら、これらの方法は複雑であり且つ一般に着るしい熟練
、時間及び複雑な電子装置を必要とする。
高感度t−有する酵素免疫学的検定(EIA)、放射線
免疫学的検定(PIA)また蝶免疫螢光(IF)の各方
法によって明示することができるけれども、しかしなが
ら、これらの方法は複雑であり且つ一般に着るしい熟練
、時間及び複雑な電子装置を必要とする。
典型的には、溶液中に存在する可溶性抗原の検出は、特
異的抗原−抗体反応の実現を可能とするために十分な濃
度においてその抗原に対して特異的な抗体を添加するこ
とによって、達成することができる。抗原と抗体は結合
して大きな不溶性の凝集物を形成し、それは沈殿として
目に見えるようになる。残念なことに、抗原が低濃度水
準で存在するに過ぎない場合には、それによって生じる
弱い抗原−抗体反応は、直接の■視的検出をiiJ能と
するに十分な大きさと質を有する沈殿を形成しない可能
性がある。沈殿の大きさを増大させ、それによってその
検出を助けるためには、抗原とたとえば不活性ラテック
ス粒子の工うな他の粒子に結合した抗体との凝集は、裸
眼によっていっそう明瞭に見ることができる著るしく大
きな沈殿を生成することが見出されている。
異的抗原−抗体反応の実現を可能とするために十分な濃
度においてその抗原に対して特異的な抗体を添加するこ
とによって、達成することができる。抗原と抗体は結合
して大きな不溶性の凝集物を形成し、それは沈殿として
目に見えるようになる。残念なことに、抗原が低濃度水
準で存在するに過ぎない場合には、それによって生じる
弱い抗原−抗体反応は、直接の■視的検出をiiJ能と
するに十分な大きさと質を有する沈殿を形成しない可能
性がある。沈殿の大きさを増大させ、それによってその
検出を助けるためには、抗原とたとえば不活性ラテック
ス粒子の工うな他の粒子に結合した抗体との凝集は、裸
眼によっていっそう明瞭に見ることができる著るしく大
きな沈殿を生成することが見出されている。
ラテックスまたはポリスチレン重合体から成る不活性粒
子を用いる凝集免疫学的検定は別の問題を提供する。ポ
リスチレンラテックス担体粒子は、水性の媒体中のポリ
スチレンラテックス担体粒子への疎水性物質による物理
的な付着性のために、被覆し且つ標準化することが難し
く、その上非特異的な反応によってv4&−った結果を
与えることが多い。別の方法として、赤血球は便利な抗
原の受動的担体であるから、指標粒子として具合良く用
いられている。主として、赤血球は化学的な固定によっ
て保存することができ且つRHCの表面上に存在する大
部分の抗原は特異的な抗体への結合活性を失なうことな
く化学的な処理に耐えることができることから、成功し
た多くの赤血球結合抗原沈降検査または受動的血液凝集
反応検定が存在する。その上、抗原は赤血球に化学的に
結合し、それによって指標粒子への架橋結合とそれに続
く特異的抗体との免疫学的反応を可能とすることが多い
。
子を用いる凝集免疫学的検定は別の問題を提供する。ポ
リスチレンラテックス担体粒子は、水性の媒体中のポリ
スチレンラテックス担体粒子への疎水性物質による物理
的な付着性のために、被覆し且つ標準化することが難し
く、その上非特異的な反応によってv4&−った結果を
与えることが多い。別の方法として、赤血球は便利な抗
原の受動的担体であるから、指標粒子として具合良く用
いられている。主として、赤血球は化学的な固定によっ
て保存することができ且つRHCの表面上に存在する大
部分の抗原は特異的な抗体への結合活性を失なうことな
く化学的な処理に耐えることができることから、成功し
た多くの赤血球結合抗原沈降検査または受動的血液凝集
反応検定が存在する。その上、抗原は赤血球に化学的に
結合し、それによって指標粒子への架橋結合とそれに続
く特異的抗体との免疫学的反応を可能とすることが多い
。
これらの方法と原理は、たとえば、Proc、 Soe
。
。
Exp、 Biol、 M@d、、第99巻、452〜
456頁(1958ン中に、ジョセフS、イングラハム
による1抗体の滴定のための抗原またはハプテンを結合
させたホルマリy処理赤血球の調製と使用”:Jet+
rnaL of Immunologye第97巻
1第6号\791〜796頁(1964)中のH,M、
ジョンソンによる1受動的血液凝固検査におけるカップ
リング試薬としての水溶性カルボジイミドの使用”のよ
うな文献中に記されている。
456頁(1958ン中に、ジョセフS、イングラハム
による1抗体の滴定のための抗原またはハプテンを結合
させたホルマリy処理赤血球の調製と使用”:Jet+
rnaL of Immunologye第97巻
1第6号\791〜796頁(1964)中のH,M、
ジョンソンによる1受動的血液凝固検査におけるカップ
リング試薬としての水溶性カルボジイミドの使用”のよ
うな文献中に記されている。
しかしながら、抗体の結合活性を害することなしに赤血
球のよう表較子に抗体を化学的に結合させることは、は
とんど成功していない。たとえは、B型肝炎の診断のた
めのアルデヒド固定赤血球上のB型肝炎表面抗原(HB
sAg)に対する抗体による逆受動的血液凝集検定(R
PHA)tit米国における肝炎検査の”第三世代”感
度に合致する検査の例であるが、しかし、この検査は、
現行のRIA肝炎検査よりも感度が低いはかりでなく、
生じる血球沈降様式は、この技術に対する経験の浅いも
のには判断がきわめて難しい0その理由の一つは、表面
上の免疫グロブリン分子の場所または配置の何れかの制
御會伴なって化学的に活性化した粒子ま九は細胞上に抗
体を共有結合によって結合することが不可能なためと思
われる。すなわち、抗体分子線担体表面上でランダムな
配置及び多数の付着ft*するものと思われる。かくし
て、抗体の結合活性及び凝集に際して格子構造を形成す
るその能力が着るしく損なわれる。
球のよう表較子に抗体を化学的に結合させることは、は
とんど成功していない。たとえは、B型肝炎の診断のた
めのアルデヒド固定赤血球上のB型肝炎表面抗原(HB
sAg)に対する抗体による逆受動的血液凝集検定(R
PHA)tit米国における肝炎検査の”第三世代”感
度に合致する検査の例であるが、しかし、この検査は、
現行のRIA肝炎検査よりも感度が低いはかりでなく、
生じる血球沈降様式は、この技術に対する経験の浅いも
のには判断がきわめて難しい0その理由の一つは、表面
上の免疫グロブリン分子の場所または配置の何れかの制
御會伴なって化学的に活性化した粒子ま九は細胞上に抗
体を共有結合によって結合することが不可能なためと思
われる。すなわち、抗体分子線担体表面上でランダムな
配置及び多数の付着ft*するものと思われる。かくし
て、抗体の結合活性及び凝集に際して格子構造を形成す
るその能力が着るしく損なわれる。
本発明の一目的は、主として単一の付着によって担体粒
子に結合し九抗体tVし、それによって柔軟な定位と配
座及び別の免疫学的反応に対して解放されている異なる
特異性の他の抗体に対する最低限の影響を提供する、多
重または接合抗体を提供することにある。
子に結合し九抗体tVし、それによって柔軟な定位と配
座及び別の免疫学的反応に対して解放されている異なる
特異性の他の抗体に対する最低限の影響を提供する、多
重または接合抗体を提供することにある。
従来における多重抗体の使用は、実質的に尾−局方式で
抗体を結合する本発明と異なって、本質的K11ii−
尾結合に限られている。たとえば、ニスウエンダーに対
する米国特許第4.04a298号は、抗原性物質また
は配位子を放射性誘導体に変化させ且つ抗体の生産を刺
激するために使用するという、固相二重抗体競合的放射
線免疫検定を目的とする方法金肥している0そののちに
、第一の抗体に対して特異的な第二の抗体を生産する。
抗体を結合する本発明と異なって、本質的K11ii−
尾結合に限られている。たとえば、ニスウエンダーに対
する米国特許第4.04a298号は、抗原性物質また
は配位子を放射性誘導体に変化させ且つ抗体の生産を刺
激するために使用するという、固相二重抗体競合的放射
線免疫検定を目的とする方法金肥している0そののちに
、第一の抗体に対して特異的な第二の抗体を生産する。
第二の抗体は水に不溶性の有機重合体物質または重合体
性を有する物質上に固定することができる。
性を有する物質上に固定することができる。
第二の抗体Fi第一の抗体−抗原複合体と反応してすべ
ての付着した物質を不溶性の形態に変換させることがで
きる。第二の抗体の活性は、共有結合または物理的な吸
着による付着は非特異性でおって多くの付着サイトで生
じ、その結果として抗体分子の立体配座と柔軟性のゆが
みを生じさせるために、恐らくは低下するものと考えら
れる。その上、放射性同位元素の使用は避けることが好
ましい問題を提供する。特に、これらの問題は、a)r
@を放射する同位元素(たとえば1”!)の比較的短か
い寿命、b)同位元素のγ線による免疫学的反応性と特
異性の低下、C)連邦基準に準拠し且つ厳密な安全管理
が必要な手順の使用を必要とする危険な放射性同位元素
の使用にか、かわる衛生上の危険、及びd)たとえばシ
ンチレーション計数器のような高価で複雑な装置の使用
を包含する。
ての付着した物質を不溶性の形態に変換させることがで
きる。第二の抗体の活性は、共有結合または物理的な吸
着による付着は非特異性でおって多くの付着サイトで生
じ、その結果として抗体分子の立体配座と柔軟性のゆが
みを生じさせるために、恐らくは低下するものと考えら
れる。その上、放射性同位元素の使用は避けることが好
ましい問題を提供する。特に、これらの問題は、a)r
@を放射する同位元素(たとえば1”!)の比較的短か
い寿命、b)同位元素のγ線による免疫学的反応性と特
異性の低下、C)連邦基準に準拠し且つ厳密な安全管理
が必要な手順の使用を必要とする危険な放射性同位元素
の使用にか、かわる衛生上の危険、及びd)たとえばシ
ンチレーション計数器のような高価で複雑な装置の使用
を包含する。
本発明は、その−目的として、類似の感度を達成するた
めに、試薬、検査手順の複線性の低下及び放射性同位元
素の好ましい回避を達成する。
めに、試薬、検査手順の複線性の低下及び放射性同位元
素の好ましい回避を達成する。
従来の方法は、前記のように、放射性同位元素、及び螢
光並びに酵素指標及び混成抗体を使用して、感度の向上
管試みていた。
光並びに酵素指標及び混成抗体を使用して、感度の向上
管試みていた。
多価混成抗体社従来から生産されているが、その典型的
な方法社ゲーテイー及びモータによって1多価混成抗体
”と趙する論文として、MolecularImmtI
mology* 第17巻、595〜401頁(19
80)中に配されている。この文献は黄色葡萄状球11
(8taphylecoeug aur@um )
(5pA)の蛋白貴人を使用する2重特異性を有する多
価混成抗体の生成金肥している。混成は、Fe部分によ
ってIgG分子を結合することができるSpAによる免
疫グロブリン(IgG)反応によって行なわれる0たと
えば、抗−人及び抗−B抗体tspAと反応させて、(
IgG抗−A/SpA/IgG/抗−Bhと記される分
子組成含有する多価混成抗体全形成させる。しかしなが
ら、この試薬は、巣−柚の抗原の存在において混成の多
価抗体によって生じる可能性のある非特異的な凝集のた
めに、凝集検査または指標粒子への付着には適当でない
。本発明は非特異的な凝集を避けるために、担体粒子へ
の付着に対する、たとえば、IgGのFab’ フラグ
メントのような1価の抗体の使用を教えている。
な方法社ゲーテイー及びモータによって1多価混成抗体
”と趙する論文として、MolecularImmtI
mology* 第17巻、595〜401頁(19
80)中に配されている。この文献は黄色葡萄状球11
(8taphylecoeug aur@um )
(5pA)の蛋白貴人を使用する2重特異性を有する多
価混成抗体の生成金肥している。混成は、Fe部分によ
ってIgG分子を結合することができるSpAによる免
疫グロブリン(IgG)反応によって行なわれる0たと
えば、抗−人及び抗−B抗体tspAと反応させて、(
IgG抗−A/SpA/IgG/抗−Bhと記される分
子組成含有する多価混成抗体全形成させる。しかしなが
ら、この試薬は、巣−柚の抗原の存在において混成の多
価抗体によって生じる可能性のある非特異的な凝集のた
めに、凝集検査または指標粒子への付着には適当でない
。本発明は非特異的な凝集を避けるために、担体粒子へ
の付着に対する、たとえば、IgGのFab’ フラグ
メントのような1価の抗体の使用を教えている。
これは、8pAとの反応は免疫グロブリンのFc部分の
存在を必要とするが、その部分は1価のFab’フラグ
メント中には存在しないことに、工つて、ゲーテイー及
びモータの系によって不可能である。
存在を必要とするが、その部分は1価のFab’フラグ
メント中には存在しないことに、工つて、ゲーテイー及
びモータの系によって不可能である。
グーチー及びモータが引用しているAreh1マ@1o
f Biochemistry and Bioph
ysies第93巻、460〜462頁(1961)中
のニソノフとリバースの論文は、抗−A (Fab’)
雪と抗−B(Fab’)1の還元からの両Fab’フラ
グメントの組変えによる2重特異性t−Wする1価の混
成抗体分子の製造を記している。この方法に伴なう問題
は、ランダムな組合わせ並びに不必要な抗−A/抗−A
及び抗−B/抗−B組変えによる妨害を包含する。本発
明の目的は2種の異なる特異性の免疫グロブリンを接合
することができるヘテロ−2官能性カツプリング試薬の
使用によるこれらの問題の回避を包含する。ヘテロ−2
官能性カップリすグ剤社、以下の文献に記されている:
J6カールツソンらs B1o*に@m1gtry J
ournal*第173巻、723〜737頁(197
8) ; G、インヵヮら、Enzym@ Lab@l
ed Immunoamsay ofH@rn@s
@s and gnzymese S、B、パル
編、43′〜57頁(1978);T、キタガヮ及びT
、アイカワ、Journal of Bioch@m1
stry 第79巻翫233〜235頁(1976)
;J、N、メリットら% J*trrnal of
Immunology M@tk・ds* 第2
8巻、25〜32頁(1979];Ie、S、L/クタ
1ら、J@tIrmal of Immunolo
gy M@thodss第24巻、321〜536頁
(1978);及びS、Nシタケら、Europ@an
Journal of Bio−ehsmistry
−第101巻、595〜599頁(1979)。
f Biochemistry and Bioph
ysies第93巻、460〜462頁(1961)中
のニソノフとリバースの論文は、抗−A (Fab’)
雪と抗−B(Fab’)1の還元からの両Fab’フラ
グメントの組変えによる2重特異性t−Wする1価の混
成抗体分子の製造を記している。この方法に伴なう問題
は、ランダムな組合わせ並びに不必要な抗−A/抗−A
及び抗−B/抗−B組変えによる妨害を包含する。本発
明の目的は2種の異なる特異性の免疫グロブリンを接合
することができるヘテロ−2官能性カツプリング試薬の
使用によるこれらの問題の回避を包含する。ヘテロ−2
官能性カップリすグ剤社、以下の文献に記されている:
J6カールツソンらs B1o*に@m1gtry J
ournal*第173巻、723〜737頁(197
8) ; G、インヵヮら、Enzym@ Lab@l
ed Immunoamsay ofH@rn@s
@s and gnzymese S、B、パル
編、43′〜57頁(1978);T、キタガヮ及びT
、アイカワ、Journal of Bioch@m1
stry 第79巻翫233〜235頁(1976)
;J、N、メリットら% J*trrnal of
Immunology M@tk・ds* 第2
8巻、25〜32頁(1979];Ie、S、L/クタ
1ら、J@tIrmal of Immunolo
gy M@thodss第24巻、321〜536頁
(1978);及びS、Nシタケら、Europ@an
Journal of Bio−ehsmistry
−第101巻、595〜599頁(1979)。
J@urnal of Immmnologica
l M@thodss第59巻、1〜13頁(198
0)におけるJ、 L。
l M@thodss第59巻、1〜13頁(198
0)におけるJ、 L。
ゲストン及びS、アブ2ヌス′にょる“レクチン免疫検
査″は、標識として新鮮な赤血球t−使用する抗原検出
のための更に他の可能な方法を記している。この文献は
、標識物質を結合するためにレクチン上に存在する結合
サイトを用いるコンカバリンム抗体接合体の使用を開示
している。この提案した方法及び試薬は、いくつかの不
利な点、なかでも連結のためのグルタルアルデヒドの使
用及びそれに基づくこのような非選択的な連結方法の共
M結合性による接合体の組成の複雑化、t−提供する。
査″は、標識として新鮮な赤血球t−使用する抗原検出
のための更に他の可能な方法を記している。この文献は
、標識物質を結合するためにレクチン上に存在する結合
サイトを用いるコンカバリンム抗体接合体の使用を開示
している。この提案した方法及び試薬は、いくつかの不
利な点、なかでも連結のためのグルタルアルデヒドの使
用及びそれに基づくこのような非選択的な連結方法の共
M結合性による接合体の組成の複雑化、t−提供する。
更に、レクチン抗体接合体は直接的な受動性赤血球凝集
検査には不適当であって、固相免疫吸着検査に対しての
み限定される。コンカナバリンAが引き起す非特異的な
赤血球凝集反応は、Cの検査方法の適用性と感度を限定
する。
検査には不適当であって、固相免疫吸着検査に対しての
み限定される。コンカナバリンAが引き起す非特異的な
赤血球凝集反応は、Cの検査方法の適用性と感度を限定
する。
肝炎抗原の存在の決定のために考案された、免疫学的検
定標i1mまたは指標として新鮮な赤血球を使用する別
の方式は、VO! Saug、 第20巻、178〜
181頁(1971)中におけるM、マユミらによる免
疫性付着赤血球凝集検査中に記されている。ここに提案
された方法は、抗原−抗体−補体複合体が赤血球に付着
し、かくして肝炎抗原に対する赤血球凝集検査を提供す
るという原理を利用している。この方式の欠点は、補体
固定検査線一般にきわめて安定とはいえず、可逆的であ
り且つその遂行に大きな技術的熟IIIt−要するとい
うことである。
定標i1mまたは指標として新鮮な赤血球を使用する別
の方式は、VO! Saug、 第20巻、178〜
181頁(1971)中におけるM、マユミらによる免
疫性付着赤血球凝集検査中に記されている。ここに提案
された方法は、抗原−抗体−補体複合体が赤血球に付着
し、かくして肝炎抗原に対する赤血球凝集検査を提供す
るという原理を利用している。この方式の欠点は、補体
固定検査線一般にきわめて安定とはいえず、可逆的であ
り且つその遂行に大きな技術的熟IIIt−要するとい
うことである。
前記のようなアルデヒド処理によって抗体が受ける損傷
に加えて、他の問題は、細胞間の接触を僅かな点に限定
し、それによって凝集マトリックスを保持すべき力を弱
いものとするこのような固定した細胞の硬さを包含する
。それに対して1本発明において使用する新鮮な細胞は
、柔軟な膜のために多くの区域における多くの細胞間接
触t−有し、その結果としてマトリックスパターンのよ
り優れた保持を示す0かくして、指標物質としての新鮮
な赤血球と共に2重抗体接合体を使用する本発明におい
ては、より高い感度に到達することができる。アルデヒ
ド処理した細胞において遭遇する別の問題は、その細胞
が次第に疎水性となり、一方、それが自動的な凝集、す
なわち非特異的な凝集を生じさせるということである。
に加えて、他の問題は、細胞間の接触を僅かな点に限定
し、それによって凝集マトリックスを保持すべき力を弱
いものとするこのような固定した細胞の硬さを包含する
。それに対して1本発明において使用する新鮮な細胞は
、柔軟な膜のために多くの区域における多くの細胞間接
触t−有し、その結果としてマトリックスパターンのよ
り優れた保持を示す0かくして、指標物質としての新鮮
な赤血球と共に2重抗体接合体を使用する本発明におい
ては、より高い感度に到達することができる。アルデヒ
ド処理した細胞において遭遇する別の問題は、その細胞
が次第に疎水性となり、一方、それが自動的な凝集、す
なわち非特異的な凝集を生じさせるということである。
このような問題についての考察は、Proes Sac
、 Exp、 Biol。
、 Exp、 Biol。
M@d、、 第99巻、452〜456頁(1958
)中にT、 S、イングラムによって論じられている。
)中にT、 S、イングラムによって論じられている。
赤血球は本発明において凝集剤として大きなM用件を有
しているけれども、本発明蝶赤血球の代りとして他の標
識物質を使用しうるという融通性と可能性′t″有して
いる。そのような物質としては酵素、放射性同位元素、
螢光色素、電子不透過性物質及び螢光性または非螢光性
染料物質を混入させることができる重合体の微小球体を
包含する。
しているけれども、本発明蝶赤血球の代りとして他の標
識物質を使用しうるという融通性と可能性′t″有して
いる。そのような物質としては酵素、放射性同位元素、
螢光色素、電子不透過性物質及び螢光性または非螢光性
染料物質を混入させることができる重合体の微小球体を
包含する。
第一の免疫グロブリンは、直接にこれらの標識物質への
親和性または標識物質に対して結合した他の物質への親
和性に関して選択することができる。酵素、放射性同位
元素また紘電子不透過性物質の使用は、赤血球によって
必要なものよりも複雑な手順と装置を必要とするが、そ
れにもかかわらず、特別な情況においては臨床医によっ
て望まれている。
親和性または標識物質に対して結合した他の物質への親
和性に関して選択することができる。酵素、放射性同位
元素また紘電子不透過性物質の使用は、赤血球によって
必要なものよりも複雑な手順と装置を必要とするが、そ
れにもかかわらず、特別な情況においては臨床医によっ
て望まれている。
上述の目的に加えて、可溶性抗原の検出のために有用な
直接的な凝集剤として二重抗体接合体を使用する診断的
に有用な試薬を提供すること窒もまた本発明の目的であ
る。本発明のもう一つの目的は、最高の感度をもって凝
集させることができる試薬の形成を可能とする最大の抗
体結合活性を有する試薬を提供することにある0高度に
熟練した取扱い技術または複雑且つ高価な装置を必要と
しない方法及び材料を提供することは、本発明の他の目
的である0肝炎検査のための第三世代感度に対する要望
に合致する材料と方法を提供することは本発明のさらに
他の目的である。螢光色素、酵素、赤血球、電子不透過
性物質、放射性同位元素、及び重合体微小球体と共に使
用することができる試薬を提供することは本発明の更に
別の目的である。使用者から取得されるかまたは凝集剤
と組合わせて供給される新鮮な赤血球を使用することが
できる凝集剤を提供することは別の目的である。水溶性
または水性の試料中の特別な抗原の存在を検出するため
の方法を提供すること鉱本発明のもう一つの目的である
。
直接的な凝集剤として二重抗体接合体を使用する診断的
に有用な試薬を提供すること窒もまた本発明の目的であ
る。本発明のもう一つの目的は、最高の感度をもって凝
集させることができる試薬の形成を可能とする最大の抗
体結合活性を有する試薬を提供することにある0高度に
熟練した取扱い技術または複雑且つ高価な装置を必要と
しない方法及び材料を提供することは、本発明の他の目
的である0肝炎検査のための第三世代感度に対する要望
に合致する材料と方法を提供することは本発明のさらに
他の目的である。螢光色素、酵素、赤血球、電子不透過
性物質、放射性同位元素、及び重合体微小球体と共に使
用することができる試薬を提供することは本発明の更に
別の目的である。使用者から取得されるかまたは凝集剤
と組合わせて供給される新鮮な赤血球を使用することが
できる凝集剤を提供することは別の目的である。水溶性
または水性の試料中の特別な抗原の存在を検出するため
の方法を提供すること鉱本発明のもう一つの目的である
。
本発明の目的に従って、凝集検査のための異なる血清学
的決定子に対して特異的な抗体の選択的接合から成る診
断上有用な試薬並びにその使用方法を提供する。更に詳
細には、本発明は規定した特異性tWする第一の免疫グ
ロブリン、第一の免疫グロブリンとは異なる特異性をM
し且つ検出すぺき抗原に対して特異的な第二の免疫グロ
ブリン及び該第−の免疫グUプリンを該第二の免疫グロ
ブリンに対して選択的に連結するヘテロ−2官能性カツ
プリング剤を含有して成る抗原を検出するための免疫学
的検定試薬に関するものでめる0第一の免疫グープリン
の規定した特異性拡、試薬と抗原の組合わせを固定また
は検出するために有用となるように選ぶことが好ましい
0そのために社、基質すなわち粒子の表面上に現われる
抗原に対して特異的であるか、また社標繊あるいは指標
物質に対して特異的であればよい〇 本明細書において用いる場合の1選択的連結2トハ、ヘ
テロ−2官能性カツプリング剤が抗体をカップリング剤
に結合させるための官能基の選択と有効性の順序に基づ
いて、異なる特異性の他の免疫グロブリンLりも1免疫
グロブリンを識別してそれに結合することができること
を意味し;好適な結合の選択性は部分的に異なる結合系
数に工って支配される。
的決定子に対して特異的な抗体の選択的接合から成る診
断上有用な試薬並びにその使用方法を提供する。更に詳
細には、本発明は規定した特異性tWする第一の免疫グ
ロブリン、第一の免疫グロブリンとは異なる特異性をM
し且つ検出すぺき抗原に対して特異的な第二の免疫グロ
ブリン及び該第−の免疫グUプリンを該第二の免疫グロ
ブリンに対して選択的に連結するヘテロ−2官能性カツ
プリング剤を含有して成る抗原を検出するための免疫学
的検定試薬に関するものでめる0第一の免疫グープリン
の規定した特異性拡、試薬と抗原の組合わせを固定また
は検出するために有用となるように選ぶことが好ましい
0そのために社、基質すなわち粒子の表面上に現われる
抗原に対して特異的であるか、また社標繊あるいは指標
物質に対して特異的であればよい〇 本明細書において用いる場合の1選択的連結2トハ、ヘ
テロ−2官能性カツプリング剤が抗体をカップリング剤
に結合させるための官能基の選択と有効性の順序に基づ
いて、異なる特異性の他の免疫グロブリンLりも1免疫
グロブリンを識別してそれに結合することができること
を意味し;好適な結合の選択性は部分的に異なる結合系
数に工って支配される。
本発明は更に、指標物質を使用して抗原を検出するため
に用いる免疫学的検定試薬を提供するが、この試薬は、
該指標物質に対して自然にまたは人為的に結合した抗原
に対して特異的な第一の免疫グロブリン;検出すべき抗
原に対して特異的な第二の免疫グロブリン−及びスルフ
ヒドリル反応性官能基とアミン反応性官能基を提供し且
つ該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリンに
対して選択的に連結することができるヘテロ−2官能性
カップリング剤t−tWしている。更に詳細には、この
免疫学的検定試薬はチオール結合の生成によって該第−
の免疫グロブリンに対して共有結合的に結合し且つアミ
ド結合の形成によって鈑第二の免疫グロブリンに対して
共有結合的VC,結合するヘテロ−2官能性カツプリン
グ剤tNしている0好適実施形態においては、ヘテロ−
2官能性カツプリング剤は水と混和する溶剤中に可溶で
あり且つ該第−及び第二の免疫グロブリンの結合活性の
実質的な損失を生じることがない。
に用いる免疫学的検定試薬を提供するが、この試薬は、
該指標物質に対して自然にまたは人為的に結合した抗原
に対して特異的な第一の免疫グロブリン;検出すべき抗
原に対して特異的な第二の免疫グロブリン−及びスルフ
ヒドリル反応性官能基とアミン反応性官能基を提供し且
つ該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリンに
対して選択的に連結することができるヘテロ−2官能性
カップリング剤t−tWしている。更に詳細には、この
免疫学的検定試薬はチオール結合の生成によって該第−
の免疫グロブリンに対して共有結合的に結合し且つアミ
ド結合の形成によって鈑第二の免疫グロブリンに対して
共有結合的VC,結合するヘテロ−2官能性カツプリン
グ剤tNしている0好適実施形態においては、ヘテロ−
2官能性カツプリング剤は水と混和する溶剤中に可溶で
あり且つ該第−及び第二の免疫グロブリンの結合活性の
実質的な損失を生じることがない。
本発明の免疫学的検定試薬の追加的な実施形態紘、次の
ものを包含する:該第−の免疫グロブリンがペプシン消
化とジチオトレイトール還元に続(IgGのFmb’
1価フラグメント(このようなフラグメントは、2価の
免疫グロブリンでは非特異的な凝集を生じさせるために
、凝集系において必要である)である場合のもの:指標
物質が赤血球であり且つ該第−の免疫グロブリンは該赤
血球の表面上に自然に存在する該連合する抗原に対して
特異的である場合のもの:指標物質が人為的に表面に植
付けた会合する抗原f:有する固定した赤血球であり且
つ該第−の免疫グロブリンが該会合した抗原に対して特
異的である場合のもの;及びヘテロ−2官能性カツプリ
ング剤がN−ヒドロキシスクシンイミドエステル、p−
ニトロフエ/ −ルエステル及び1−ヒドロキシベンゾ
トリアゾールエステルより成る群から選択されるアミン
反応性官能基、とマレイミド、ヨードアシル及び2−ピ
リジルジチオより成る群から選択されるスルフヒドリル
反応性官能基tNしている架橋結合試薬である場合のも
の0 本発明における免疫学的検定試薬の好適実施形態におい
ては、第二の免疫グロブリンは、多クローン性または単
クローン性起源の何れかの人または動物の抗−B型肝炎
表面抗原免疫グロブリンであり:且つ指標物質は赤血球
、酵素、放射性同位元素、螢光色素、電子不透過性物質
及び重合体微小球体より成る群から選択される。
ものを包含する:該第−の免疫グロブリンがペプシン消
化とジチオトレイトール還元に続(IgGのFmb’
1価フラグメント(このようなフラグメントは、2価の
免疫グロブリンでは非特異的な凝集を生じさせるために
、凝集系において必要である)である場合のもの:指標
物質が赤血球であり且つ該第−の免疫グロブリンは該赤
血球の表面上に自然に存在する該連合する抗原に対して
特異的である場合のもの:指標物質が人為的に表面に植
付けた会合する抗原f:有する固定した赤血球であり且
つ該第−の免疫グロブリンが該会合した抗原に対して特
異的である場合のもの;及びヘテロ−2官能性カツプリ
ング剤がN−ヒドロキシスクシンイミドエステル、p−
ニトロフエ/ −ルエステル及び1−ヒドロキシベンゾ
トリアゾールエステルより成る群から選択されるアミン
反応性官能基、とマレイミド、ヨードアシル及び2−ピ
リジルジチオより成る群から選択されるスルフヒドリル
反応性官能基tNしている架橋結合試薬である場合のも
の0 本発明における免疫学的検定試薬の好適実施形態におい
ては、第二の免疫グロブリンは、多クローン性または単
クローン性起源の何れかの人または動物の抗−B型肝炎
表面抗原免疫グロブリンであり:且つ指標物質は赤血球
、酵素、放射性同位元素、螢光色素、電子不透過性物質
及び重合体微小球体より成る群から選択される。
本発明は更に、会合した抗原を肩する指標物質、該会合
した抗原に対して特異的な第一の免疫グロブリン、検出
すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリン、及
び該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリンに
対して選択的に連結するヘテロ−2官能性カツプリング
剤管含有して成る抗原を検出する夷めの免疫学的検定試
薬を提供する。
した抗原に対して特異的な第一の免疫グロブリン、検出
すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリン、及
び該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリンに
対して選択的に連結するヘテロ−2官能性カツプリング
剤管含有して成る抗原を検出する夷めの免疫学的検定試
薬を提供する。
更に本発明は:水性の試料1 m) 会合した抗原t
Wする指標物質を使用して抗原を検出するための:該会
合し九抗原に対して特異的な第一の免疫グロブリン、検
出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリン、
及び該第−の免疫グロブリンを#第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結するヘテロ−2官能性カツプリン
グ剤管含有して成る免疫学的検定試薬、及びb)該指標
物質と一緒にして混合物を形成させ;該混合物管攪拌し
:該混合物を動揺させずに沈降させ:且っ該混合物を指
標物質について観察し、それによって検するための方法
を提供する。別法として、試薬を試料と混合する前に、
指標物質を試薬に対して添加しておいてもよい。好適実
施形態においては、指標物貴社赤血球と微小球体より成
る群から選択され且つ沈降させる段階は凝集反応の存在
についての該混合物の観察を包含しそれによって検出す
べき抗原の存在を指示する。水性の試料中の特定の抗原
の存在を検出するための別の好適実施形態においては、
該指標物質が赤血球であり、検出すべき該抗原か人の絨
毛性性腺刺激ホルモン及びB型肝炎表面抗原より成る群
から選択される場合;あるいは該第二の免疫グロブリン
を抗−人の絨毛性性腺刺激ホルモン免疫グロブリン及び
抗−B型肝炎表面抗原免疫グロブリン(何れの免疫グロ
ブリンも多クローン性または単クローン性起源のもので
ある)の群から選択される場合に、本発明の方法管使用
する。
Wする指標物質を使用して抗原を検出するための:該会
合し九抗原に対して特異的な第一の免疫グロブリン、検
出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリン、
及び該第−の免疫グロブリンを#第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結するヘテロ−2官能性カツプリン
グ剤管含有して成る免疫学的検定試薬、及びb)該指標
物質と一緒にして混合物を形成させ;該混合物管攪拌し
:該混合物を動揺させずに沈降させ:且っ該混合物を指
標物質について観察し、それによって検するための方法
を提供する。別法として、試薬を試料と混合する前に、
指標物質を試薬に対して添加しておいてもよい。好適実
施形態においては、指標物貴社赤血球と微小球体より成
る群から選択され且つ沈降させる段階は凝集反応の存在
についての該混合物の観察を包含しそれによって検出す
べき抗原の存在を指示する。水性の試料中の特定の抗原
の存在を検出するための別の好適実施形態においては、
該指標物質が赤血球であり、検出すべき該抗原か人の絨
毛性性腺刺激ホルモン及びB型肝炎表面抗原より成る群
から選択される場合;あるいは該第二の免疫グロブリン
を抗−人の絨毛性性腺刺激ホルモン免疫グロブリン及び
抗−B型肝炎表面抗原免疫グロブリン(何れの免疫グロ
ブリンも多クローン性または単クローン性起源のもので
ある)の群から選択される場合に、本発明の方法管使用
する。
更に本発明Fi二 指標物質の使
用下に、指標物質に対して特異的な第一の1価の免疫グ
ロブリン、検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫
グロブリン、及びスルフリル反応性官能基及びアミン反
応性官能基を提供し且つ該第−の免疫グロブリンな骸第
二の免疫グロブリンに選択的に連結させることができる
ヘテロ−2官能性カップリング剤t−有して成る抗原を
検出するための免疫学的検定試薬を表面と接触させ;更
に核表面を赤血球、酵素、放射性同位元素、螢光色素、
電子不透明物質、及び重合体微小球体より成る鮮から選
択される指標物質と接触させ;骸試薬と該指標物質を反
応させ:未反応の試薬と指標物質を除去し;且つ該表面
を骸指標粒子の存在について調べ、それによって該特定
抗原を決定することができるという諸段階を含有して成
る、該表面上に存在する該特定抗原の存在を検出するた
めの方法を提供する0 更に本発明は:表面を、会合した抗原tVt−る指標粒
子(ここで指標物質は赤血球、酵素、放射性同位元素、
螢光色素及び重合体微小球体から成るグループから選択
する):該会合した抗原に対して特異的な第一の免疫グ
ロブリン、検出すべき特定の抗原に対して特異的な第二
の免疫グロブリン、及び該第−の免疫グロブリンを該第
二の免役グロブリンに対して選択的に連結するヘテロ−
2官能性カツプリング剤を含有して成る抗原を検出する
ための免疫学的検定試薬と接触さぜ;該試薬を該表面と
反応させ;未反応の試薬と指標粒子を除去し;且つ該表
面を該指標粒子の存在について調べそれによって該抗原
の存在を決定することができるという諸段階から成る、
表面上に存在する特定の抗原の存在を検出するための方
法を提供するO 特定の抗原の存在を検出するための方法のその他の実施
形態は、第一の免疫グロブリンt1価の免疫グロブリン
として指定し:または検出すべき抗原を組織上の存在と
してまたは固相基質上に固定したものとして指定する〇 本発明のいっそうの理解ならびにそのはかの目的は、図
面の説明によって明白となるであろう0第1図は、指標
または担体粒子及び検出すべき抗原に付着した本発明の
二重−抗体接合体を模式的に示す図である0特に第1図
は、表面上に、人為的または自然に鋳発した、抗体2が
それに対して特異的である抗原を有している指標粒子ま
九は担体物質1を示している。抗体2絋、非特異的凝集
反応を低減するようにベグシン消化及びジチオトレイト
ール還元を行表うた、たとえばFab’フラグメントの
ように1価であることが好ましい。ヘテロ−2官能性カ
ツプリング試薬3を用いて、免疫グロブリン2′t−1
検出すべき抗原5に対して特異的な免疫グロブリン4と
、共有結合によって結合する。従来は、たとえば免疫グ
ロブリンのような蛋白質を、たとえばグルタルアルデヒ
ド、ジイミデート、ジイソシアネート、ジフェニルアジ
ド及ヒジマレイミドびょうな同種2官能性試薬の使用に
よって、共有結合的に結合していたが、しかしながら、
これらの試薬は、蛋白質上の同一の2官能基、たとえば
アミノ、フェノール及びチオール基、の反応に限定され
る0その結果、これらの非選択的カップリング試薬は、
分子内架橋、自己縮合、重合及びその結果生じる抗体結
合活性の低下のために、免疫学的検定手順における限ら
れた成功を招くにすぎなかった。
用下に、指標物質に対して特異的な第一の1価の免疫グ
ロブリン、検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫
グロブリン、及びスルフリル反応性官能基及びアミン反
応性官能基を提供し且つ該第−の免疫グロブリンな骸第
二の免疫グロブリンに選択的に連結させることができる
ヘテロ−2官能性カップリング剤t−有して成る抗原を
検出するための免疫学的検定試薬を表面と接触させ;更
に核表面を赤血球、酵素、放射性同位元素、螢光色素、
電子不透明物質、及び重合体微小球体より成る鮮から選
択される指標物質と接触させ;骸試薬と該指標物質を反
応させ:未反応の試薬と指標物質を除去し;且つ該表面
を骸指標粒子の存在について調べ、それによって該特定
抗原を決定することができるという諸段階を含有して成
る、該表面上に存在する該特定抗原の存在を検出するた
めの方法を提供する0 更に本発明は:表面を、会合した抗原tVt−る指標粒
子(ここで指標物質は赤血球、酵素、放射性同位元素、
螢光色素及び重合体微小球体から成るグループから選択
する):該会合した抗原に対して特異的な第一の免疫グ
ロブリン、検出すべき特定の抗原に対して特異的な第二
の免疫グロブリン、及び該第−の免疫グロブリンを該第
二の免役グロブリンに対して選択的に連結するヘテロ−
2官能性カツプリング剤を含有して成る抗原を検出する
ための免疫学的検定試薬と接触さぜ;該試薬を該表面と
反応させ;未反応の試薬と指標粒子を除去し;且つ該表
面を該指標粒子の存在について調べそれによって該抗原
の存在を決定することができるという諸段階から成る、
表面上に存在する特定の抗原の存在を検出するための方
法を提供するO 特定の抗原の存在を検出するための方法のその他の実施
形態は、第一の免疫グロブリンt1価の免疫グロブリン
として指定し:または検出すべき抗原を組織上の存在と
してまたは固相基質上に固定したものとして指定する〇 本発明のいっそうの理解ならびにそのはかの目的は、図
面の説明によって明白となるであろう0第1図は、指標
または担体粒子及び検出すべき抗原に付着した本発明の
二重−抗体接合体を模式的に示す図である0特に第1図
は、表面上に、人為的または自然に鋳発した、抗体2が
それに対して特異的である抗原を有している指標粒子ま
九は担体物質1を示している。抗体2絋、非特異的凝集
反応を低減するようにベグシン消化及びジチオトレイト
ール還元を行表うた、たとえばFab’フラグメントの
ように1価であることが好ましい。ヘテロ−2官能性カ
ツプリング試薬3を用いて、免疫グロブリン2′t−1
検出すべき抗原5に対して特異的な免疫グロブリン4と
、共有結合によって結合する。従来は、たとえば免疫グ
ロブリンのような蛋白質を、たとえばグルタルアルデヒ
ド、ジイミデート、ジイソシアネート、ジフェニルアジ
ド及ヒジマレイミドびょうな同種2官能性試薬の使用に
よって、共有結合的に結合していたが、しかしながら、
これらの試薬は、蛋白質上の同一の2官能基、たとえば
アミノ、フェノール及びチオール基、の反応に限定され
る0その結果、これらの非選択的カップリング試薬は、
分子内架橋、自己縮合、重合及びその結果生じる抗体結
合活性の低下のために、免疫学的検定手順における限ら
れた成功を招くにすぎなかった。
本発明は、蛋白質上の真なる基と選択的に反応するヘテ
ロ−2官能性カツプリング剤3の使用によって、これら
のやっかいな局面を回避する。ヘテロ−2官能性カツプ
リング剤の選択的な連結の局面は、試薬の一端における
アミド結合と他の末端におけるチオール結合の生成によ
って、自己縮合生成物の形成を回避する0これらの異な
る各結合線、それぞれ異なる抗体の結合または接合のた
めに用いることができる。更に、免疫グロブリン蝶、大
または動物源と何れかから単離した、もとのまま、また
はフラグメントとした抗体とすることができる。これら
の抗体は多クローン性の起源のものまた蝶たとえば抗−
HBsムg単りp−ン性抗体を生じるマウスハイブリド
ーマ細胞系のようなモノクローン性起源のものとするこ
とができる。
ロ−2官能性カツプリング剤3の使用によって、これら
のやっかいな局面を回避する。ヘテロ−2官能性カツプ
リング剤の選択的な連結の局面は、試薬の一端における
アミド結合と他の末端におけるチオール結合の生成によ
って、自己縮合生成物の形成を回避する0これらの異な
る各結合線、それぞれ異なる抗体の結合または接合のた
めに用いることができる。更に、免疫グロブリン蝶、大
または動物源と何れかから単離した、もとのまま、また
はフラグメントとした抗体とすることができる。これら
の抗体は多クローン性の起源のものまた蝶たとえば抗−
HBsムg単りp−ン性抗体を生じるマウスハイブリド
ーマ細胞系のようなモノクローン性起源のものとするこ
とができる。
いうまでもなく、純度と結合活性の点で抗体の品質が高
いほど、生じる試薬の特異性と感度が大きい0 さらに第1図を参照すると、理想的には、粒子すなわち
担体に対して特異的な免疫グロブリン2は、ヘゲC1−
2官能性カップリング架橋3によって、1価、2価また
はIgMにおけるような5価の何れかとすることができ
る他の免疫グロブリン4と結合した、1価の免疫グロブ
リンまたはそのFab’ 7ラグメント(Fab’はI
gG (Bulletinof World Heal
th Organization+ 第50巻、4
47負、1964年中に定義された免疫グロブリン)の
ペプシン消化及びジチオトレイトール(DTT)還元に
よる1価の7ラグメントである〕である。指標すなわち
担体物質に対して特異的な免疫グロブリン2は、早期の
粒子間格子の形成による非特異的凝集反応を回避し且つ
また粒子表面上における接合した高分子の最大量の回転
または振動を可能とするために二重抗体接合体による指
標物質上への単一の付着が存在するように、1価である
ことが好ましい。かくして、問題とする抗原4に対する
特異性によって選択する免疫グロブリン4#′i、結局
、実質的に免疫グロブリン2の尾の部分でチオール結合
により免疫グロブリン2に結合し、その結果、再配置し
且つ問題としでいる特定の抗原と反応するべきその能力
の点で、全く柔軟性である。
いほど、生じる試薬の特異性と感度が大きい0 さらに第1図を参照すると、理想的には、粒子すなわち
担体に対して特異的な免疫グロブリン2は、ヘゲC1−
2官能性カップリング架橋3によって、1価、2価また
はIgMにおけるような5価の何れかとすることができ
る他の免疫グロブリン4と結合した、1価の免疫グロブ
リンまたはそのFab’ 7ラグメント(Fab’はI
gG (Bulletinof World Heal
th Organization+ 第50巻、4
47負、1964年中に定義された免疫グロブリン)の
ペプシン消化及びジチオトレイトール(DTT)還元に
よる1価の7ラグメントである〕である。指標すなわち
担体物質に対して特異的な免疫グロブリン2は、早期の
粒子間格子の形成による非特異的凝集反応を回避し且つ
また粒子表面上における接合した高分子の最大量の回転
または振動を可能とするために二重抗体接合体による指
標物質上への単一の付着が存在するように、1価である
ことが好ましい。かくして、問題とする抗原4に対する
特異性によって選択する免疫グロブリン4#′i、結局
、実質的に免疫グロブリン2の尾の部分でチオール結合
により免疫グロブリン2に結合し、その結果、再配置し
且つ問題としでいる特定の抗原と反応するべきその能力
の点で、全く柔軟性である。
実質的に、尾−カツブリング剤−尾の配置は、粒子表面
1の密接な接触によって生じる立体障害のための免疫グ
ロブリン4の何らかの立体配座変化が最低限であると予
想される故に、いっそう有利でめる◎抗体4の結合サイ
トは、抗体2とカップリング剤5の広がりのために、化
学的に付着した抗体につ諭ての従来の技術の特徴である
ような、粒子表面上でのぐらつきや障害がなくて、いっ
そう露出していると思われるので、子側される2重抗体
接合体被覆した粒子は、それらの特異的抗原と容易に反
応して、直接的な凝集反応における格子の生成を保つ。
1の密接な接触によって生じる立体障害のための免疫グ
ロブリン4の何らかの立体配座変化が最低限であると予
想される故に、いっそう有利でめる◎抗体4の結合サイ
トは、抗体2とカップリング剤5の広がりのために、化
学的に付着した抗体につ諭ての従来の技術の特徴である
ような、粒子表面上でのぐらつきや障害がなくて、いっ
そう露出していると思われるので、子側される2重抗体
接合体被覆した粒子は、それらの特異的抗原と容易に反
応して、直接的な凝集反応における格子の生成を保つ。
接合体結合凝集検査に対する4標として理想的に適した
粒子は天然産の表面抗原〔たとえば赤血球(RBCs)
)i有する粒子並びに人為的に植え付けた抗原を肩する
粒子を包含する。血液型免疫反応によって生じる赤血球
凝集反応を回避するためには、Rh陰性0型赤血球を使
用することが好ましい。
粒子は天然産の表面抗原〔たとえば赤血球(RBCs)
)i有する粒子並びに人為的に植え付けた抗原を肩する
粒子を包含する。血液型免疫反応によって生じる赤血球
凝集反応を回避するためには、Rh陰性0型赤血球を使
用することが好ましい。
ヘテロ−2官能性試薬の部類は、スルフリル反応性官能
基、たとえば、マレイミド、ヨードアセチルまたは2−
ピリジルジチオ基、且つ筐だ、たとえばN−ヒドロ中ジ
ースクシンイミドエステル、p−ニトロフェノールエス
テル、1−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルなど
のような活性エステルのアミン反応性官能基tWする薬
品を包含する。これらの両種の反応性基tNL且つ好ま
しくは水と混和性の溶剤、たとえば、ジオキサン、アセ
トンまたはジメチルホルムアミド、中に可溶な化合物が
抗体の接合の丸めに適している。試薬または溶剤は顕著
な変性または結合活性の低下をも良らさないことが好ま
しい。これらの2官能的に反応性の基t−有するカップ
リング試薬は、高温、塩基及び求核性物質の存在を包含
する種々の条件下に不安定であるから、これらの試薬拡
典型的には無水で低温(0℃以下)において頂蔵し且つ
使用直前に適尚な溶剤中に溶解することが望ましい。
基、たとえば、マレイミド、ヨードアセチルまたは2−
ピリジルジチオ基、且つ筐だ、たとえばN−ヒドロ中ジ
ースクシンイミドエステル、p−ニトロフェノールエス
テル、1−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルなど
のような活性エステルのアミン反応性官能基tWする薬
品を包含する。これらの両種の反応性基tNL且つ好ま
しくは水と混和性の溶剤、たとえば、ジオキサン、アセ
トンまたはジメチルホルムアミド、中に可溶な化合物が
抗体の接合の丸めに適している。試薬または溶剤は顕著
な変性または結合活性の低下をも良らさないことが好ま
しい。これらの2官能的に反応性の基t−有するカップ
リング試薬は、高温、塩基及び求核性物質の存在を包含
する種々の条件下に不安定であるから、これらの試薬拡
典型的には無水で低温(0℃以下)において頂蔵し且つ
使用直前に適尚な溶剤中に溶解することが望ましい。
接合は、使用する特定のカップリング剤に依存して、!
LO−asのpHに緩衝した水性の媒体中で行なうこと
が好ましいopHtiマレイミド基を有するものに対し
てはzΩ以下に保たねばならな\ いが、ヨードアセチル(またはヨードアシル)基を含有
するものに対してはa5まで上げてもよい〇九とえば、
リン酸塩緩衝食塩水(PBX)、または免疫グロブリン
上のアミノ基あるいはスルフヒドリル基に対して競合す
る、たとえばアミンまたはメルカプタンのような、求核
性物質を含有しない類以の本位直系のような、常用され
る緩衝系が接合反応に対して理想的である。典型的には
、異なる2抗体、すなわち抗体2と抗体4、の接合は、
2段階プロセスで行なわれる。第一の段階は、少なくと
も1のアミノ基、恐らくはりシンのイプシロンアミノ基
を、アミド結合の生成によって、抗体4の免疫グロブリ
ン分子上の1以上のマレイミドまたはヨードアセチル基
に対して選択的に反応させるためには、pH7において
、モル的に10〜20倍過剰の異種2官能性カツプリン
グ剤を使用することが有利である。過剰のカップリング
剤の除去後に、マレイミドまたはヨードアセチル基結合
抗体4は、抗体2上のスルフヒドリル基による連結に対
する用意が完了している。理想的には、チオール基は、
連鎖内−のジスルフィドの還元に工つて、あるいは、−
一アセチルメルカプト無水コハク酸を用いて高分子上に
導入したチオール−アセチル基の除去によって、生成さ
せることができる。すべての過剰の試薬は、反応段階間
のゲルf過まえは透析によって除去することが好ましい
。
LO−asのpHに緩衝した水性の媒体中で行なうこと
が好ましいopHtiマレイミド基を有するものに対し
てはzΩ以下に保たねばならな\ いが、ヨードアセチル(またはヨードアシル)基を含有
するものに対してはa5まで上げてもよい〇九とえば、
リン酸塩緩衝食塩水(PBX)、または免疫グロブリン
上のアミノ基あるいはスルフヒドリル基に対して競合す
る、たとえばアミンまたはメルカプタンのような、求核
性物質を含有しない類以の本位直系のような、常用され
る緩衝系が接合反応に対して理想的である。典型的には
、異なる2抗体、すなわち抗体2と抗体4、の接合は、
2段階プロセスで行なわれる。第一の段階は、少なくと
も1のアミノ基、恐らくはりシンのイプシロンアミノ基
を、アミド結合の生成によって、抗体4の免疫グロブリ
ン分子上の1以上のマレイミドまたはヨードアセチル基
に対して選択的に反応させるためには、pH7において
、モル的に10〜20倍過剰の異種2官能性カツプリン
グ剤を使用することが有利である。過剰のカップリング
剤の除去後に、マレイミドまたはヨードアセチル基結合
抗体4は、抗体2上のスルフヒドリル基による連結に対
する用意が完了している。理想的には、チオール基は、
連鎖内−のジスルフィドの還元に工つて、あるいは、−
一アセチルメルカプト無水コハク酸を用いて高分子上に
導入したチオール−アセチル基の除去によって、生成さ
せることができる。すべての過剰の試薬は、反応段階間
のゲルf過まえは透析によって除去することが好ましい
。
第1段階、すなわち、試薬の抗体4への連結は、0℃で
開始して、典型的には、室温で2時間以内に完了する0
第二の段階、すなわち、活性化した抗体4のチオール化
抗体2への連結は、一般に低温(4℃)において20時
間を超える反応時間を要する。望ましい1:1の比率の
二重抗体接合体、すなわち、抗体2−抗体4の収率を最
高とする喪めには、連結条件の注意深い計算と最適な取
り扱いが存在しなければならない。たとえばIgMのよ
うな多価抗体の還元は避けることが好ましく、且つこの
ような免疫グロブリンはアミド結合によって結合するこ
とが理想的である0゜ みツブリング剤に対するFab’フラグメント(抗体2
)筐たはIgG (抗体4)の有利なモル比は1.1
: 1乃至1.5:1の範囲である6 Fmb’スルフ
ヒドリル基のジスルフィドへの酸化による自己縮合は、
IgG上のマレイミドまたはヨードアセチル結合に対す
るアルキル化反応と競合するという理由で、更にまた、
典型的には、抗体は多クローン性の起源のものであるか
ら望ましい特異的抗体が存在する全免疫グロブリンの中
の一部の量として存在しているに過ぎないという理由に
よって、高い連結効率を保証するためには接合の開始に
おいて過剰のFab’成分を使用することが好ましい。
開始して、典型的には、室温で2時間以内に完了する0
第二の段階、すなわち、活性化した抗体4のチオール化
抗体2への連結は、一般に低温(4℃)において20時
間を超える反応時間を要する。望ましい1:1の比率の
二重抗体接合体、すなわち、抗体2−抗体4の収率を最
高とする喪めには、連結条件の注意深い計算と最適な取
り扱いが存在しなければならない。たとえばIgMのよ
うな多価抗体の還元は避けることが好ましく、且つこの
ような免疫グロブリンはアミド結合によって結合するこ
とが理想的である0゜ みツブリング剤に対するFab’フラグメント(抗体2
)筐たはIgG (抗体4)の有利なモル比は1.1
: 1乃至1.5:1の範囲である6 Fmb’スルフ
ヒドリル基のジスルフィドへの酸化による自己縮合は、
IgG上のマレイミドまたはヨードアセチル結合に対す
るアルキル化反応と競合するという理由で、更にまた、
典型的には、抗体は多クローン性の起源のものであるか
ら望ましい特異的抗体が存在する全免疫グロブリンの中
の一部の量として存在しているに過ぎないという理由に
よって、高い連結効率を保証するためには接合の開始に
おいて過剰のFab’成分を使用することが好ましい。
競合を回避して最高の感度を達成するためには未結合の
抗体を除去(ゲル1過による分別)することが好ましい
。
抗体を除去(ゲル1過による分別)することが好ましい
。
分別しまたは分別しない形態の接合体による指標粒子の
被接は、一般に1096充填細胞懸濁液t接合抗体溶液
と共に37℃または室温において15〜30分間保温し
たのち、リン蒙塩緩衝塩水(pBs)t−用いて3回洗
浄することによって達成される。赤血球上に負わせる接
合体の量は、大きな感度tVするがしかし抗原標準によ
って検査するときに誤まった陽性の結果を示すことがな
い最適の密度を達成するためには、接合体の各バッチに
対して滴定することが理想的である。蛋白質またd I
gGによって高過ぎる密度で被覆された粒子は、過度の
付着性と最後的に非特異的な凝集tもたらす。かくして
、免疫学的検定試薬は、接合体の負荷の量によって調節
することができる、可変の感度tVしている。
被接は、一般に1096充填細胞懸濁液t接合抗体溶液
と共に37℃または室温において15〜30分間保温し
たのち、リン蒙塩緩衝塩水(pBs)t−用いて3回洗
浄することによって達成される。赤血球上に負わせる接
合体の量は、大きな感度tVするがしかし抗原標準によ
って検査するときに誤まった陽性の結果を示すことがな
い最適の密度を達成するためには、接合体の各バッチに
対して滴定することが理想的である。蛋白質またd I
gGによって高過ぎる密度で被覆された粒子は、過度の
付着性と最後的に非特異的な凝集tもたらす。かくして
、免疫学的検定試薬は、接合体の負荷の量によって調節
することができる、可変の感度tVしている。
感度の調節は、たとえば、人の絨毛性性腺刺激ホルモン
(HCG)及びさもなければ妨害する密接に関連するゴ
ナドトロピン黄体形成ホルモン(LH)の検出において
、交差反応性の場合に望ましいことがある。HCGに関
しては、試薬がα5 IU/−を超える感度を有してい
る場合に、誤まった陽性の反応を伴なうことが一般的で
ある。
(HCG)及びさもなければ妨害する密接に関連するゴ
ナドトロピン黄体形成ホルモン(LH)の検出において
、交差反応性の場合に望ましいことがある。HCGに関
しては、試薬がα5 IU/−を超える感度を有してい
る場合に、誤まった陽性の反応を伴なうことが一般的で
ある。
感度を低下させることによって、HCGよりはむしろL
Hの検出において起りがちな、このような誤まった陽性
反応を具合良く排除することができる。
Hの検出において起りがちな、このような誤まった陽性
反応を具合良く排除することができる。
検査血清試料は、赤血球凝集検査を妨害するおそれのあ
る、存在する補体を破壊するために、熱不活性化(56
℃で30分)しなければならない。
る、存在する補体を破壊するために、熱不活性化(56
℃で30分)しなければならない。
艷に、良好な特異性と感度のためには、たとえば5μt
またはその荀希釈というような、少量の試験血清を用い
ることが好ましい。リューマチス性及び異極親和性反応
の排除または最小限度化のため並びに特異性凝集反応の
促進のためには、検定系中に正常なウサギの血清(約0
.5 % )と牛のアルブミン(約1チ)を含有させる
ことが好ましいといりことも認められている0その上、
すべてのカップリング溶液または検査溶液中に、一般的
な防腐剤としてナトリウムアジド(CL02〜[11%
)を使用することもまた有利である。
またはその荀希釈というような、少量の試験血清を用い
ることが好ましい。リューマチス性及び異極親和性反応
の排除または最小限度化のため並びに特異性凝集反応の
促進のためには、検定系中に正常なウサギの血清(約0
.5 % )と牛のアルブミン(約1チ)を含有させる
ことが好ましいといりことも認められている0その上、
すべてのカップリング溶液または検査溶液中に、一般的
な防腐剤としてナトリウムアジド(CL02〜[11%
)を使用することもまた有利である。
免疫学的検定検査は、約(LO5−の二重抗体接合体被
覆RBCs(α5〜1gbの細胞)の1滴を1滴の検査
血清及び数滴(α1〜a2−)の希釈剤と混合すること
によって行なうことが理想的である。スライドガラス上
で混合物を凝集させると抗原の存在の迅速(約10〜1
5分)な決定が可能であるが、しかしこの方法り感度が
低いO試験管!えはミクロ滴定板中で溶液を沈降させる
方法は、約2時間という比較的長い時間t−要するけれ
ども、このような条件下でより高い感度が達成されるの
で、このような方法が好適である0陽性の反応は典型的
にはスライド上の細胞凝集物あるいは試験管ま九はミク
ロ滴定板の底におけるマット及びリングによって示され
、一方、陰性の反応は、スライド試験において目に見え
る凝集物が全くないこと、または沈降管あるいはミクロ
滴定板中のボタン状物の存在によって、示される。
覆RBCs(α5〜1gbの細胞)の1滴を1滴の検査
血清及び数滴(α1〜a2−)の希釈剤と混合すること
によって行なうことが理想的である。スライドガラス上
で混合物を凝集させると抗原の存在の迅速(約10〜1
5分)な決定が可能であるが、しかしこの方法り感度が
低いO試験管!えはミクロ滴定板中で溶液を沈降させる
方法は、約2時間という比較的長い時間t−要するけれ
ども、このような条件下でより高い感度が達成されるの
で、このような方法が好適である0陽性の反応は典型的
にはスライド上の細胞凝集物あるいは試験管ま九はミク
ロ滴定板の底におけるマット及びリングによって示され
、一方、陰性の反応は、スライド試験において目に見え
る凝集物が全くないこと、または沈降管あるいはミクロ
滴定板中のボタン状物の存在によって、示される。
時によっては、B型肝炎表面抗原(HBsAg)陰性血
清を用いる免疫学的検定は、2時間の沈降の間に小さな
リングを与えるolfまった陽性を避けるために、沈降
時間を更に2時間処長しなければならず、それによって
陰性の試料からの小さなリングは一般にボタン状に収縮
し、一方、弱い陽性は取り巻いているマットの影と共に
リング状に保たれる。
清を用いる免疫学的検定は、2時間の沈降の間に小さな
リングを与えるolfまった陽性を避けるために、沈降
時間を更に2時間処長しなければならず、それによって
陰性の試料からの小さなリングは一般にボタン状に収縮
し、一方、弱い陽性は取り巻いているマットの影と共に
リング状に保たれる。
きわめて重要且つ有利なこととして、B型肝炎表面抗原
の検出に関しては、本発明は米国生物学局の規定による
第三世代B型肝炎検査の要求を超える1 nf HB
mAg/−血清よりも高い感度’iwしている。この免
疫学的検定系において使用する二重抗体接合体の好適実
施形態は、人の赤血球細胞に対して特異的であり且つそ
れに付着させたウサギの抗−人界血球断片に対して異種
2官能的に連結させたチンパンジー抗Bw肝炎表面抗原
免疫グpプリン、たとえば人のRBCで被覆し友(Cp
X HBsAg)−IgG(RxhRBC)Fab’、
である。このような肝炎検査の有利な点は明らかに、簡
単で感度が高く、容易に判断することができ、僅かな試
料を必要とするのみで且つ誤まった陽性の結果を避ける
ことができる方法によって、可溶性の抗原を検出しうる
能力を包含する。
の検出に関しては、本発明は米国生物学局の規定による
第三世代B型肝炎検査の要求を超える1 nf HB
mAg/−血清よりも高い感度’iwしている。この免
疫学的検定系において使用する二重抗体接合体の好適実
施形態は、人の赤血球細胞に対して特異的であり且つそ
れに付着させたウサギの抗−人界血球断片に対して異種
2官能的に連結させたチンパンジー抗Bw肝炎表面抗原
免疫グpプリン、たとえば人のRBCで被覆し友(Cp
X HBsAg)−IgG(RxhRBC)Fab’、
である。このような肝炎検査の有利な点は明らかに、簡
単で感度が高く、容易に判断することができ、僅かな試
料を必要とするのみで且つ誤まった陽性の結果を避ける
ことができる方法によって、可溶性の抗原を検出しうる
能力を包含する。
本発明が有利な効果を実証するもう一つの重要な領域は
、妊娠t11I認するための診断試薬としての使用であ
る。人の絨毛性性腺刺激ホルモンの存在は、1滴のPB
S中の人の、Orr細胞を、1滴の尿または血清試料及
び(RxHCG)IgG−(Rx hRBC) F a
b’接合体(ここでRxHCG。
、妊娠t11I認するための診断試薬としての使用であ
る。人の絨毛性性腺刺激ホルモンの存在は、1滴のPB
S中の人の、Orr細胞を、1滴の尿または血清試料及
び(RxHCG)IgG−(Rx hRBC) F a
b’接合体(ここでRxHCG。
はウサギの抗−人絨毛性性腺刺激ホルモンである)と混
合することによって、決定する。細胞に負荷させた接合
体の密度社、前記のように、黄体形成ホルモン(LH)
及び卵胞刺激ホルモン(FSH)による妨害を避けるた
めには尿1−当りα51UHCGの感度水準に調節しな
ければならない。2時間後の沈降試験管中のマットの生
成は、高水準のHCGの存在、従って妊娠に対する陽性
反応の表示である。
合することによって、決定する。細胞に負荷させた接合
体の密度社、前記のように、黄体形成ホルモン(LH)
及び卵胞刺激ホルモン(FSH)による妨害を避けるた
めには尿1−当りα51UHCGの感度水準に調節しな
ければならない。2時間後の沈降試験管中のマットの生
成は、高水準のHCGの存在、従って妊娠に対する陽性
反応の表示である。
別法として、第1図において、免疫グロブリン2Fi、
好ましくは基質上に固定した抗原5に対して特異的とす
ることができ、且つ免疫グロブリン4は2価でおり且つ
非特異的な凝集反応は避けることが好ましいから、赤血
球以外の指標物質に対して特異的とすることができる。
好ましくは基質上に固定した抗原5に対して特異的とす
ることができ、且つ免疫グロブリン4は2価でおり且つ
非特異的な凝集反応は避けることが好ましいから、赤血
球以外の指標物質に対して特異的とすることができる。
第2図は更に固相免疫吸着検査における本発明の使用を
例証するものであるが、この場合に、抗原11を基質1
0上に固定し且つそれに対して問題とする抗原5に対し
てもまた特異的であるヘテロ−特異性接合抗体12を向
ける。固定した抗原11に対して向けた接合抗体12の
部分は回転及び配置能力を最大とするためには1価であ
ることが好ましいが多価であってもよい0次いで、系を
洗浄したのち、第二の接合抗体14の第二のグループで
処理し、それに指標物質1を付着させる0指標物質1の
存在の定量化は検査試料中に存在する抗原5の量の表示
となる。
例証するものであるが、この場合に、抗原11を基質1
0上に固定し且つそれに対して問題とする抗原5に対し
てもまた特異的であるヘテロ−特異性接合抗体12を向
ける。固定した抗原11に対して向けた接合抗体12の
部分は回転及び配置能力を最大とするためには1価であ
ることが好ましいが多価であってもよい0次いで、系を
洗浄したのち、第二の接合抗体14の第二のグループで
処理し、それに指標物質1を付着させる0指標物質1の
存在の定量化は検査試料中に存在する抗原5の量の表示
となる。
第3図を参照すると、ヘテロ−2官能性カツプリング剤
によって尾−尾の関係で連結した異なる2抗体21.2
2から成り且つ指標物質15に対して特異的な抗体21
部分を肩している接合した抗体試薬14に一使用する本
発明の方法は、組繊細1120上に存在する異面抗原の
存在を確認するために用いることができる。腫瘍特異的
表面抗原を有する腫瘍細胞の位置付けと確認において、
本発明の使用を期待することができる。このような状況
において、腫瘍抗原に対して特異的な抗体22は、単ク
ローン性起源のものと予想される。
によって尾−尾の関係で連結した異なる2抗体21.2
2から成り且つ指標物質15に対して特異的な抗体21
部分を肩している接合した抗体試薬14に一使用する本
発明の方法は、組繊細1120上に存在する異面抗原の
存在を確認するために用いることができる。腫瘍特異的
表面抗原を有する腫瘍細胞の位置付けと確認において、
本発明の使用を期待することができる。このような状況
において、腫瘍抗原に対して特異的な抗体22は、単ク
ローン性起源のものと予想される。
第4図は、本発明の好適実施形態として、赤血球凝集検
査における様式化した格子の形成を示している。二重抗
体接合体14は、赤血球指標16に対して特異的なFa
b’フラグメント及び検出すべき抗原5に対して特異的
な多価抗体部分eNしている。抗原5の存在は、赤血球
16に付着した接合体14の多重的な付着金可能とする
0その結果、赤血球は肉眼で明瞭に認めることができる
マット状の堅固な格子の形成中に保六れる0本発明の原
理は以下の実施例によって更に例証することができるが
、本発明は以下の実施例に限定されることはない。
査における様式化した格子の形成を示している。二重抗
体接合体14は、赤血球指標16に対して特異的なFa
b’フラグメント及び検出すべき抗原5に対して特異的
な多価抗体部分eNしている。抗原5の存在は、赤血球
16に付着した接合体14の多重的な付着金可能とする
0その結果、赤血球は肉眼で明瞭に認めることができる
マット状の堅固な格子の形成中に保六れる0本発明の原
理は以下の実施例によって更に例証することができるが
、本発明は以下の実施例に限定されることはない。
実施例 1
pH7のリン液塩緩衝食塩水(PBS)2wAt中に溶
解した2、511Fのアフイニテイーク費マドグラフィ
ーで精製したチンパンジー抗−B型肝炎表面抗原免疫グ
ロブリン(CpzHBsAg IgG)を氷浴中で冷却
し、過酸化物を含まないジオキサン(α1−)中に溶解
した、N−(4−カルボキシシクロヘキシメチル)マレ
イミドのN−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル(5
5μf1モル的に10倍過剰)を、0℃で15分間、次
いで室温で1時間攪拌しながら加えるoJ剰の試薬を、
溶離液として1ミリモル濃度のEDTjl含有する脱気
したpatoのPBS’i使用するセファデックスG−
15(L5X45tx)カラム上のゲルr過によって、
除去する。りpマトグ2フィーは紫外線によってモニタ
ーする。マレイミド−IgGttVする第一のピークの
幽分含集めて、ウサギの抗−人界血球(RxhRBC)
のFab’フラグメントとの接合のために4℃に保つ。
解した2、511Fのアフイニテイーク費マドグラフィ
ーで精製したチンパンジー抗−B型肝炎表面抗原免疫グ
ロブリン(CpzHBsAg IgG)を氷浴中で冷却
し、過酸化物を含まないジオキサン(α1−)中に溶解
した、N−(4−カルボキシシクロヘキシメチル)マレ
イミドのN−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル(5
5μf1モル的に10倍過剰)を、0℃で15分間、次
いで室温で1時間攪拌しながら加えるoJ剰の試薬を、
溶離液として1ミリモル濃度のEDTjl含有する脱気
したpatoのPBS’i使用するセファデックスG−
15(L5X45tx)カラム上のゲルr過によって、
除去する。りpマトグ2フィーは紫外線によってモニタ
ーする。マレイミド−IgGttVする第一のピークの
幽分含集めて、ウサギの抗−人界血球(RxhRBC)
のFab’フラグメントとの接合のために4℃に保つ。
α7−のpHaOの(LO1モル濃度のトリス緩衝食塩
水(TBS)中の1岬のRxhRBC(FILb’)x
i”、窒素下にα1−のH,0中のtowIIのジチオ
トレイトール(DTT)を加えながら、攪拌する。室温
における1時間の攪拌後に、過剰のDTTY、脱気した
pH6,0PBS−1ミリモル濃度EDTAを用いるセ
ファデックスG−15(1,OX20on)カラム上で
、除去する。Fib’−8Ht含Mするフラグメントラ
集めて、直ちに窒素下にマレイミドCpzHBgAg
IgGと混合する。 接置myのpHを^め容置の1
モル濃度のpH7,0!Jン酸ナトIJウムで調節し且
つ反応を窒素下に4℃で約20時間続ける0かくして得
た接合体#液をミクロフィルター(α22ミクロン)を
通じて1遇して透明浴液とする。防腐剤としてナトリウ
ムアジドをα1−の濃度まで加える。分別しない接合体
は、肝炎の存在のための検査に対する直接的な凝集試薬
として、人のOrr RBCsの被覆のために適して
いる。接合体のRBCs に対する比は、非特異的な
凝集音生じることなく最高の感度となるように滴定しな
ければならず、それは次第に変化させた陽性と陰性の対
照試料の使用によって達成される。
水(TBS)中の1岬のRxhRBC(FILb’)x
i”、窒素下にα1−のH,0中のtowIIのジチオ
トレイトール(DTT)を加えながら、攪拌する。室温
における1時間の攪拌後に、過剰のDTTY、脱気した
pH6,0PBS−1ミリモル濃度EDTAを用いるセ
ファデックスG−15(1,OX20on)カラム上で
、除去する。Fib’−8Ht含Mするフラグメントラ
集めて、直ちに窒素下にマレイミドCpzHBgAg
IgGと混合する。 接置myのpHを^め容置の1
モル濃度のpH7,0!Jン酸ナトIJウムで調節し且
つ反応を窒素下に4℃で約20時間続ける0かくして得
た接合体#液をミクロフィルター(α22ミクロン)を
通じて1遇して透明浴液とする。防腐剤としてナトリウ
ムアジドをα1−の濃度まで加える。分別しない接合体
は、肝炎の存在のための検査に対する直接的な凝集試薬
として、人のOrr RBCsの被覆のために適して
いる。接合体のRBCs に対する比は、非特異的な
凝集音生じることなく最高の感度となるように滴定しな
ければならず、それは次第に変化させた陽性と陰性の対
照試料の使用によって達成される。
接合体は、2容器t−;’wする診断試薬検査キット中
に詰めることが好ましく、それらの容器の中の一方は緩
衝した接合試薬を含有し且つ他の容器は+1L11J1
1のナトリウムアジドを含有するPBS中の(L51G
の正常なウサギの血清と1%の牛のアルブミンの希釈液
を含有している。接合試薬はPBS(pH7,4、a1
%のナトリウムアジド)当りに約α05qの二重抗体蛋
白質を肩していることが理想的である。10検査に対し
て、この試薬の各1滴(約[105m)@滴下すること
によって11i1i(約(10sd)の10 % Or
r RBCg(1−当り約5×101の細胞)を被傍す
る。市販の貯蔵血液試薬細胞またはHBs Ag vi
l−有していない人からの新鮮(1週以内)なOrr細
胞が、接合体に対する理想的な担体である0検査は次の
ようにして竹なうことが好普しい: 1、細胞感作−0rr細胞金3(ロ)洗浄したのち、P
BSで10%に調節する。1滴の10チ細胞全1滴の接
合体試薬と混合して、37℃で少なくとも15分間保温
する。細胞を6回洗浄したのち、PBS((102%の
ナトリウムアジドを含有) ’t’で、Q、5%の濃度
で懸濁させる。被覆した細胞は4℃の貯蔵においてPB
S中で少なくとも6日間安定である。
に詰めることが好ましく、それらの容器の中の一方は緩
衝した接合試薬を含有し且つ他の容器は+1L11J1
1のナトリウムアジドを含有するPBS中の(L51G
の正常なウサギの血清と1%の牛のアルブミンの希釈液
を含有している。接合試薬はPBS(pH7,4、a1
%のナトリウムアジド)当りに約α05qの二重抗体蛋
白質を肩していることが理想的である。10検査に対し
て、この試薬の各1滴(約[105m)@滴下すること
によって11i1i(約(10sd)の10 % Or
r RBCg(1−当り約5×101の細胞)を被傍す
る。市販の貯蔵血液試薬細胞またはHBs Ag vi
l−有していない人からの新鮮(1週以内)なOrr細
胞が、接合体に対する理想的な担体である0検査は次の
ようにして竹なうことが好普しい: 1、細胞感作−0rr細胞金3(ロ)洗浄したのち、P
BSで10%に調節する。1滴の10チ細胞全1滴の接
合体試薬と混合して、37℃で少なくとも15分間保温
する。細胞を6回洗浄したのち、PBS((102%の
ナトリウムアジドを含有) ’t’で、Q、5%の濃度
で懸濁させる。被覆した細胞は4℃の貯蔵においてPB
S中で少なくとも6日間安定である。
2 細胞沈降−1滴の感作した細胞(約2.5×10@
)細胞)’fr5Ptf)!LA、者の血清と2滴の希
釈剤tWするガラス試験管(1,OX 7.551 )
に入れる。完全な混合は1分間の振とうによって達成さ
れる。試験管中の細胞を2時間にわたり観察鏡上で静か
に保って沈降させる。・マット(陽性)またはリング(
弱い陽性)の形態の凝集は、B型肝炎にかかつている人
からの血清の表示であり、一方、管の底におけるボタン
状の細胞によって示される非凝集は、B型肝炎に陰性な
血清の表示である。
)細胞)’fr5Ptf)!LA、者の血清と2滴の希
釈剤tWするガラス試験管(1,OX 7.551 )
に入れる。完全な混合は1分間の振とうによって達成さ
れる。試験管中の細胞を2時間にわたり観察鏡上で静か
に保って沈降させる。・マット(陽性)またはリング(
弱い陽性)の形態の凝集は、B型肝炎にかかつている人
からの血清の表示であり、一方、管の底におけるボタン
状の細胞によって示される非凝集は、B型肝炎に陰性な
血清の表示である。
実施例 2
水浴中で冷却した10−のpH2OOPBs中の10q
のQAE−セファデックス精製ウサギ抗−人絨毛性性腺
刺激ホルモン(RxbCG)IgGを、0℃で攪拌しな
がら15分間にわたり、過酸化物を含有しないジオキサ
ン(α1−)中に溶解した、N−(4−カルボキシシク
ロヘキシルメチル)マレイミドのN−ヒトルキシスクシ
ンイミドエステル(u4qsモル的に20倍過剰)に加
える。次いでこの混合物を1時間かけて室温にもどした
のち、脱気したpHaOのpBs−1ミリモル濃度ID
TAt−用いてセファデックスG−15(t 5 X
45 cm )カラム上でゲルf遇する。マレイミドI
gG’に含有する両分を集め、4℃に保つと、接合のた
めの用意が児了する。α8−のpHaOのTBS中に懸
濁させた4■のRxhRBC(Fabつ。
のQAE−セファデックス精製ウサギ抗−人絨毛性性腺
刺激ホルモン(RxbCG)IgGを、0℃で攪拌しな
がら15分間にわたり、過酸化物を含有しないジオキサ
ン(α1−)中に溶解した、N−(4−カルボキシシク
ロヘキシルメチル)マレイミドのN−ヒトルキシスクシ
ンイミドエステル(u4qsモル的に20倍過剰)に加
える。次いでこの混合物を1時間かけて室温にもどした
のち、脱気したpHaOのpBs−1ミリモル濃度ID
TAt−用いてセファデックスG−15(t 5 X
45 cm )カラム上でゲルf遇する。マレイミドI
gG’に含有する両分を集め、4℃に保つと、接合のた
めの用意が児了する。α8−のpHaOのTBS中に懸
濁させた4■のRxhRBC(Fabつ。
を、室温において攪拌しながら、その甲に042−のH
z O中のDTT(2ilv)i加える01時間の攪拌
後に、脱気したpHaOのP H8−1ミIJモル濃度
EDTA’を用いるセファデックスG−15(I X
30 cm )カラム上のゲル1過によって、過剰のD
TT’i除去する0還元したFab’を集め、直ちに4
℃における窒素下の攪拌によって、約20時間かけて、
マレイミド−(RxhCG)IgG及び弱の容重のpH
7,0の1モル嬢度のリン酸ナトリウム緩衝液と混合す
る。
z O中のDTT(2ilv)i加える01時間の攪拌
後に、脱気したpHaOのP H8−1ミIJモル濃度
EDTA’を用いるセファデックスG−15(I X
30 cm )カラム上のゲル1過によって、過剰のD
TT’i除去する0還元したFab’を集め、直ちに4
℃における窒素下の攪拌によって、約20時間かけて、
マレイミド−(RxhCG)IgG及び弱の容重のpH
7,0の1モル嬢度のリン酸ナトリウム緩衝液と混合す
る。
このようにして得た接合体混合物をα45ミクロンのP
Mを用いてr過し且つ溶離剤としてpHaOのTB8を
用いてセファクリル8−200(2,6X75m)力2
ム上で分別するO(RxhCG)IgG −(RxhR
BC) Fab’接合体を含有する主ピークの自分を集
める。HCG標準に対する滴定後に、接合体の濃度を1
d当り約α01岬に調節する0 この試薬はα1チのナトリウムアジドtt有するPH3
中の[L5%の牛のアルブミンとα1チの正常なウサギ
の血清を含有する診断試薬キットとして詰めることが有
利である。10WItの試薬は100回の検査に対して
十分である。
Mを用いてr過し且つ溶離剤としてpHaOのTB8を
用いてセファクリル8−200(2,6X75m)力2
ム上で分別するO(RxhCG)IgG −(RxhR
BC) Fab’接合体を含有する主ピークの自分を集
める。HCG標準に対する滴定後に、接合体の濃度を1
d当り約α01岬に調節する0 この試薬はα1チのナトリウムアジドtt有するPH3
中の[L5%の牛のアルブミンとα1チの正常なウサギ
の血清を含有する診断試薬キットとして詰めることが有
利である。10WItの試薬は100回の検査に対して
十分である。
検査は以下のようにして行なう:
市販の貯蔵血液試薬または新しく採取(1週間以内)し
た人のOrr JIB胞を5回洗浄し、PH3中で1L
sに希釈する01滴の希釈した細胞をガラス試験管(1
,OX 7.5 cm )中に入れ、次いで2滴の接合
体試薬と1滴の血清または尿の試料を加えて1〜2分間
の振とうにより完全に混合する。試験管中の細胞を観察
鏡上で静かに2時間沈降させる。次いで結果を観察する
。マットまたは拡散したリング状の凝集は、妊娠の表示
としての尿中の高濃度の人の性腺刺激ホルモンの存在を
示す。ボタンまたは小さなリング状の非凝集は、試料中
の低濃度筐たは正常濃度の性腺刺激ホルモンを表示する
0 上記の説明及び実施例は本発明の好適実施形態を例肚す
るものであるけれども、この技術分野における通常の熟
練者には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく
稽々の変更全行なうことができるということは明白であ
ろう。
た人のOrr JIB胞を5回洗浄し、PH3中で1L
sに希釈する01滴の希釈した細胞をガラス試験管(1
,OX 7.5 cm )中に入れ、次いで2滴の接合
体試薬と1滴の血清または尿の試料を加えて1〜2分間
の振とうにより完全に混合する。試験管中の細胞を観察
鏡上で静かに2時間沈降させる。次いで結果を観察する
。マットまたは拡散したリング状の凝集は、妊娠の表示
としての尿中の高濃度の人の性腺刺激ホルモンの存在を
示す。ボタンまたは小さなリング状の非凝集は、試料中
の低濃度筐たは正常濃度の性腺刺激ホルモンを表示する
0 上記の説明及び実施例は本発明の好適実施形態を例肚す
るものであるけれども、この技術分野における通常の熟
練者には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく
稽々の変更全行なうことができるということは明白であ
ろう。
第1図は、抗原の存在において担体粒子に付着させたヘ
テロ−2官能性連結した抗体免疫学的検定試薬の簡単化
した図である。 第2図は、固相免疫吸着検査における本発明の使用を示
す。 第3図は、細胞表面抗原の確認のための本発明の使用を
示す。 第4図は、赤血球凝集検査における本発明の使用による
格子構造の生成を様式的に示す。 特許出願人 オーツ・ダイアグノスティック・システ
ムズ・インコーボレーテッド
テロ−2官能性連結した抗体免疫学的検定試薬の簡単化
した図である。 第2図は、固相免疫吸着検査における本発明の使用を示
す。 第3図は、細胞表面抗原の確認のための本発明の使用を
示す。 第4図は、赤血球凝集検査における本発明の使用による
格子構造の生成を様式的に示す。 特許出願人 オーツ・ダイアグノスティック・システ
ムズ・インコーボレーテッド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ta) 第一の免疫グロブリン; b)該第−の免疫グロブリンとは異なる特異性を有し且
つ検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブリ
ン;及び C)該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結する、ヘテロ−2官能性カツプリ
ング剤 を含有して成る、抗原を検出するための免疫学的検定試
薬。 2.1)指標物質に対して特異的な第一の免疫グロブリ
ン; b)検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブ
リン:及び C)スルフヒドリル反応性官能基とアミン反応性官能基
tWしそして該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グ
ロブリンに対して選択的に連結する、ヘテロ−2官能性
カツプリング剤 を含有して成る、指標物質を使用して抗原を検出するた
めの免疫学的検定試薬〇 五 該第−の免疫グロブリンはIgGのFab’ 1価
フラグメントである、特許請求の範囲第2項記載の免疫
学的検定試薬。 亀 ヘテO−2官能性カップリング剤は、a)該第−の
免疫グロブリンに対してチオール結合の形成により共有
結合的に結合されており;且つ b)皺第二の免疫グロブリンに対してアミド結合の形成
により共有結合的に結合されている、特許請求の範囲第
2項記載の免疫学的検定試薬05 へテロ−2官能性カ
ツプリング剤は、水と混和性の溶剤中に可溶であり且つ
該第−及び第二の免液グロブリンの結合活性の実質的な
低下を生じさせない、特許請求の範囲第4項記載の免疫
学的検定試薬。 &a) 会合した抗原含有する指標物質;b)骸会合
した抗原に対して特異的な第一〇′免疫グロブリン: C)検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブ
リン;及び d)該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結する、ヘテロ−2官能性カツプリ
ング剤 を含有して成る、抗原の検出の九めの免疫学的検定試薬
。 l ヘテロ−2官能性試薬は、それぞれチオール結合及
びアミド結合によって該第−の免疫グロブリンt−該第
二の免疫グロブリンに連結する、特許請求の範囲第6項
記載の免疫学的検定試薬Oa 該第−の免疫グロブリン
はIgG q)Fab’ 1価フ2グメントである、特
許請求の範囲第6項記載の免疫学的検定試薬。 9 指標物質は赤血球でありそして該第−の免疫グロブ
リンは、該赤血球の表面上に天然に存在する該会合した
抗原に対して特異的である、特許請求の範囲第7または
8項記載の免疫学的検定試薬。 11指標物質は固定した赤血球でありそして該第−の免
疫グロブリンは骸赤血球の表面上に人為的に植付けられ
た該会合した抗原に対して特異的である、特許請求の範
囲第7または8項記載の免疫学的検定試薬。 1tヘテロ−2官能性カツプリング剤は、N−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル、p−ニトロフェノールエス
テル及び1−ヒドロキシベンツトリアゾールエステルよ
り成る群から選択されるアミン反応性官能基、並びにマ
レイミド、ヨードアシル及び2−ピリジルジチオより成
る群から選択されるスルフヒドリル反応性官能基ヲ有す
る架橋試薬である、特許請求の範囲第7または8項記載
の免疫学的検定試薬。 12、第二の免疫グロブリンは、チンパンジーKB型肝
炎表面抗原免疫グロブリン、マウス単クローン性抗B型
肝炎表面抗原免疫グロブリン、及びウサギ抗−人絨毛性
性腺刺激ホルモン免疫グロブリンより成る群から選択さ
れる免疫グロブリンである、特許請求の範囲第2または
6項記載の免疫学的検定試薬。 仏指標物質は赤血球、酵素、放射性同位元素、螢光色素
、電子不透過性物質、及び重合体微小球体より成る群か
ら選択される、特許請求の範囲第2または6項記載の免
疫学的検定試薬〇14[1)a)会合した抗原を有する
指標物質:b)該会合した抗原に対して特異的な第一の
免疫グロブリン: C)検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グ四プ
リン:及び d)該第−の免疫グロブリンを骸第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結するヘテロ−2官能性カツプリン
グ剤 ttVして成る、抗原を検出するための免疫学的検定試
薬を水性の試料と一緒にし: (i) 該混合物を攪拌し; (2)) 該攪拌した混合物を静かに沈降させ;そして 該混合物を指標物質について観測し、それによって該抗
原の存在を指示せしめる、 という複数の段階金含有して成る、該試料中の特定の抗
原の存在を検出する丸めの方法。 lFk、(l a)会合した抗原に対して特異的な第一
の免疫グロブリン、検出すべき抗原に対して特異的な第
二の免疫グロブリン、及び該第−の免疫グロブリン上肢
第二の免疫グロブリンに対して選択的に連結するヘテロ
−2官能性カツプリング剤を含有して成る、該会合した
抗原を有する指標物質を使用して抗原上検出するための
免疫学的検定試薬;及び b)該指標物質; を、水性の試料と一緒にし; (i) 該混合物を攪拌し; (―) 該攪拌した混合物會静かに沈降させ;且つ該
混合物を指標物質について観測し、それによって検出す
べき抗原の存在を指示せしめるという複数の段階を含有
して成る、該試料中の特定の抗原の存在を検出するため
の方法。 1&指標物質社赤血球及び重合体微小球体より成を群か
ら選択され;そして沈降させる段階社該混合物を凝集反
応の存在について観察することを含み、それによって該
機態の存在を指示せしめる、特許請求の範囲第14また
は15項記載の特定の抗原の存在上検出するための方法
。 17、該指標物質は赤血球であり; 核検出すべき抗原社人の絨毛性性腺刺激ホルモン及びB
II肝炎表面抗原より成る群から選択され;そして 沈降させる段階は該混合物を凝集反応の存在について観
察すること管含み、それによって該抗原の存在を指示せ
しめる、 特許請求の範囲第14またけ15項記載の方法。 1a#検出すべき抗NはnfI!肝炎表面抗原でありそ
して該二の免疫グロブリン社マウス檗りローン性抗−B
、[肝炎表面抗原免疫グロブリン及びチンパンジー抗B
型肝炎表面抗原免疫グロブリンより成る群から選択され
る、特許請求の範囲第17′g4記載の方法。 19、(i)a)指標物質に対して特異的修築−の免疫
グロブリン; b)検出すべき抗原に対して特異的な第二の免疫グロブ
リン;及び C)該第−の免疫グロブリンヲ骸第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結する、スルフヒドリル反応性官能
基とアミン反応性官能基を有する、ヘテロ−2官能性カ
ップリング剤;を含有して成る、指標物質を使用する免
疫学的検定試薬をその上に特定の抗原が存在する表面と
接触させ; (−) 更に該表面を、赤血球、酵素、放射性同位元
素、螢光色素、電子不透過性物質及び重合体微小球体よ
り成る群から選択される指標物質と接触させ; (iiO#試薬と該指標物質を反応させ:(−未反応の
指標物質を除去し:且つ (ψ 該表面t−該指標物質の存在について調べ、それ
によって該特定の抗原の存在を決定せしめ得る、 という複数の段階を含有して成る、骸表面上に存在する
特定の抗原の存在を検出するための方法。 2(L(i)a)会合した抗原を有し、そして赤血球、
酵素、放射性同位元素、螢光色素、電子不透過性物質及
び重合体微小球体より成る群から選択される、指標物質
; b)該会合した抗原に対して特異的な第一の免疫グロブ
リン; C)検出すべ1特定の抗原に対して特異的な第二の免疫
グロブリン:及び d)該第−の免疫グロブリンを該第二の免疫グロブリン
に対して選択的に連結することができるヘテロ−2官能
性カツプリング試薬 を含有して成る、該特定の抗原を検出するための免疫学
的検定試薬を、その上に特定の抗原t−有する表面と接
触させ; (ii) 該試薬を該表面と反応させ;(−) 未
反応の試薬を除去し;そして(1リ 該表面を該指標
物質の存在について調べ、それによって#特定の抗原の
存在を決定することができる という複数の段階を含有して成る、該異面上に存在する
特定の抗原の存在を検出するための方法021、該第−
の免疫グロブリンが1価の免疫グロブリンである、特許
請求の範囲第19または20項記載の方法。 2z検出すべき該特定の抗原が組織上に存在する、特許
請求の範囲第19また1−j20項記載の方法。 2&検出すべき#特定の抗原が同相基質上に固定されて
いる、特許請求の範囲第19ま九は20項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/299,764 US4433059A (en) | 1981-09-08 | 1981-09-08 | Double antibody conjugate |
US299764 | 1994-09-01 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5855759A true JPS5855759A (ja) | 1983-04-02 |
Family
ID=23156196
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57154076A Pending JPS5855759A (ja) | 1981-09-08 | 1982-09-06 | 二重抗体接合体 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4433059A (ja) |
EP (1) | EP0074271A1 (ja) |
JP (1) | JPS5855759A (ja) |
CA (1) | CA1200482A (ja) |
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JPH0617909B2 (ja) * | 1984-04-23 | 1994-03-09 | ボストン バイオメディカル リサーチ インスティテュート,インコーポレイテッド | 双特異性抗体決定子 |
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JP2009516163A (ja) * | 2005-11-12 | 2009-04-16 | プラットフォーム・ダイアグノスティクス・リミテッド | 凝集アッセイ |
JP2018513680A (ja) * | 2015-03-25 | 2018-05-31 | アイジーエム バイオサイエンシズ エー/エス | 多価b型肝炎ウイルス抗原結合分子およびその使用 |
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