JPH0617909B2 - 双特異性抗体決定子 - Google Patents
双特異性抗体決定子Info
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Description
【発明の詳細な説明】
IgG抗体は、それぞれ軽(L)鎖と重(H)鎖とよりなる２つ
の半分子で構成されることが知られている。２つの半分
子よりなるＨ鎖はジスルフイド結合により結合され、こ
れらは選択的還元により破壊することができる。２種の
異なるIgG試料につきこの工程を行なえば、半分子が結
合してハイブリツド抗体を形成することができる。これ
は、完全ウサギグロブリンを用いて行なうことができる
〔ニソノフ(Nisonoff)等、(1964)、サイエンス、第１３
４巻、第３７６−３７９頁〕。さらに、IgA抗体は同一
の半分子まで切断することができる。 また、ハイブリツドは、完全抗体でなくIgG抗体のＦ(a
b′)2断片を用いても形成されている。すなわち、免疫
特異性を与えない分子のＦ(c′）部分は、ハイブリツド
化前に、たとえばペプシンのような適当なプロテアーゼ
での切断によつて除去される。この手法はニソノフ等
（１９６０）、Arch・Biochem.Biophys、第89巻、第230〜
244頁並びにニソノフ及びリバース（１９６０）、Arch・
Biochem・Biophys.、第93巻、第460〜462頁に記載されて
いる。最近の論文〔カレント・コンテンツ（1981年１１
月２日）、第４４巻、第２５頁〕において、ニソノフは
次のように述べている： 「現在まで、この方法は主として抗−フエリチン抗体と
細胞表面抗原に対する抗体とのハイブリツドを用いてフ
エリチンにより細胞表面を染色することによりその用途
が制限されていた。さらに、ハイブリツド抗体の使用
も、薬理剤を所望の組織表面と特異的に接触させる手段
として考えられていた。」 細胞毒性薬剤を供給するためのこの種のハイブリツドの
使用も、ラソ(Raso)及びグリフイン(Griffin)(1978)、Fe
d.Proc・第37巻、第1350頁に示唆されている。 ミルステイン(Milstein)(1981)、Proc.R.Soc.Lond.,第B2
11巻、第393-412頁は「腫瘍の特異的処理に対する毒性
物質のキヤリアとしてモノクローナル抗体」を使用する
可能性を示唆して、「Fab断片は完全抗体よりも良好な
標的剤である」と述べている。 さらにハイブリツド抗体は、それぞれ異なる抗体を生成
しうる２個の細胞を融合させてハイブリツド抗体を産生
しうるハイブリツド細胞を作成することによつても作ら
れている。この種の方法は、ミルステイン・アンド・ク
エロ(Milstein&Cuello)(1983)、ネイチヤー、第３０５
巻、第５３７〜５４０頁に記載されている。異なるモノ
クローナル抗体を産生するマウスハイブリーマ細胞を融
合させ、かつ得られた融合細胞により２種の異なる群の
親の重鎖と軽鎖との全ゆる可能な組み合せで構成される
抗体混合物が産生される。この分子混合物には、親の抗
体分子のそれぞれの半部よりなるハイブリツド抗体があ
り、これはイオン交換クロマトグラフイーにより部分精
製することができた。 他の論文、すなわちラソ等（１９８１）、キヤンサー・
リサーチ、第４１巻、第２０７５−２０７８頁は、ウサ
ギ抗体Ｆ(ab′)2断片の不純な試料の生成を記載してい
る。このウサギ抗体断片は還元により切断され、かつア
ンチリシンＡ鎖Ｆ(ab′)2断片と再結合された。標的薬
剤供給実験には、双特異性のダイマーが使用された。こ
の論文は次のように述べている： 「この研究に使用した２種類の精製抗体は慣用のヘテロ
抗血清から単離した。したがつて、これら２種のものを
融合させると、複雑な親和性と特異性との組み合せが生
ずる筈である。均質なハイブリドーマ由来の抗体の出現
は、ハイブリツド抗体の構成半部の結合親和性に対し完
全な制御を与え、この均一性は供給ベヒクルとしてのそ
の最終的効果を著しく促進する。」 本発明は同一の双特異性(bispecific)抗体決定子よりな
る均質試料を提供し、各双特異性決定子はジスルフイド
結合により結合された２個のＬ−Ｈ半分子で構成され、
各Ｌ−Ｈ半分子は互いに異なつており、かつ異なる抗原
決定基に対し特異性である。 本発明の双特異性モノクローナル抗体決定子は、それぞ
れ１個もしくはそれ以上のジスルフイド結合により結合
された２個の同一のＬ−Ｈ半分子よりなる２種の異なる
モノクローナル抗体決定子を供給し、これら２種の異な
る抗体決定子をジスルフイド結合を破壊するのに充分な
条件にかけ、Ｌ−Ｈ半分子をこれらが化学的に結合して
１個もしくはそれ以上のジスルフイド結合の形成により
双特異性抗体決定子を形成しうるような条件下で結合さ
せることにより作成される。 好ましくは、この方法はさらに、結合工程前にチオール
活性化剤により一対の同一半分子を誘導体化する工程を
含み、チオール活性化剤はチオール活性化半分子と異な
る半分子との間のジスルフイド結合の形成を促進する。 他の好適具体例において、モノクローナル抗体はIgG
（特に好ましくはIgG1、或いはやや劣るがIgG2A、IgG2B
若しくはIgG3）又はIgAである。各半分子は、IgG抗体か
ら誘導される場合、少なくともＦ（ab′）部分を含む。
チオール活性化剤は、チオール活性化半分子同志の再結
合を防止する。モノクローナル抗体決定子の一方又は両
者は２個以上のジスルフイド結合により結合された半分
子で構成され、これら決定子を半分子まで切断する工程
は、これら半分子のＨ鎖内におけるジスルフイド結合の
形成を阻止するような条件下で行なわれ、チオール活性
化剤は5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、2,
2′−ジピリジンジスルフイド、4,4′−ジピリジンジス
ルフイド又はサルフアイトとテトラチオネートとの混合
物である〔Ｆ（ab′）断片を他の蛋白質へ結合するため
のチオール活性化剤の使用は、たとえばラソ等(1980)ジ
ヤーナル・イミユノロジー、第１２５巻、第2610頁；ラ
ソ等、（１９８２）、キヤンサー・リサーチ、第４２
巻、第４５７頁及びマスホ等（１９７９）、Ｂ．Ｂ．
Ｒ．Ｃ．，第９０巻、第３２０頁に記載されており、こ
れらをここに参考のため引用する〕。好ましくは、ジス
ルフイド結合により元来結合されていた半分子のＨ鎖内
でのジスルフイド結合の形成は、切断反応をたとえば亜
砒酸化合物（たとえば亜砒酸ナトリウム）のような無機
亜砒酸塩或いはアリール亜砒酸エステル（たとえば酸化
フエニルアルシン）或いはカドミウム塩のようなジチオ
ール錯体形成剤の存在下で行なうことにより、或いは切
断反応をＨ鎖のコンホメーシヨンが改変されてジスルフ
イド結合の形成を阻止するような条件下、たとえばpH3.
8〜4.5（最も好ましくは4.2）の下で行なうことによ
り、或いはたとえばカルボキシペプチターゼＹのような
蛋白分解酵素を用いて１個以外の全システイン残基を除
去することにより阻止される。 互いに相似な半分子の再結合を阻止した場合、混合物か
らの双特異性決定子の精製はたとえばゲル過により分
子寸法に基づいて簡単に行なうことができる。これは、
溶解している分子、すなわち半分子及び双特異性ハイブ
リツド分子が寸法において半分子１つ分だけ相違してい
るので可能である。他の分離法は、たとえばイオン交換
及び等電点電気泳動法である。 第１図は生物発光分析に有用な集成体の略図であり、 第２図は双特異性モノクローナル抗体決定子を用いるチ
ヤンネリング免疫分析の略図であり、 第３図は双特異性モノクローナル抗体決定子を用いる螢
光エネルギー移動免疫分析の略図であり、 第４図はマウスIgG1と比較したウサギIgG2の構造を示す
略図であり、 第５図はマウス半分子における鎖内ジスルフイド競合反
応の略図であり、 第６図は双特異性モノクローナル抗体決定子の好適製造
方法の略図であり、 第７図は双特異性モノクローナル抗体決定子を用いる発
光エネルギー移動免疫分析の略図である。 本発明の双特異性モノクローナル抗体決定子は広範な用
途に有用である。これらの用途は全て、これら決定子が
動物における抗体生産を刺激しうる任意の２種の遊離の
又は表面若しくは粒子上に固定化された有効な蛋白、ポ
リペプチド、炭水化物、核酸又はハプテンなどの抗原決
定基の特異的部位の間を連結する高度に特的なリンカー
として作用しうる能力に由来する。 本発明による双特異性抗体決定子の１つの用途は、異な
る抗原決定基を含有するか又は固定化させた所望の表面
へ所望の抗原物質を結合させる薬剤としての使用であ
る。たとえば、粒子又は膜に固定化された酸素を固相触
媒として使用することができる。他のものに比較したこ
の種の固定化の利点は、酵素活性に対し悪影響のない抗
体を選択しうること、及び不純な混合物から純粋な酵素
を固定化させうることである。さらに、双特異性抗体決
定子は、たとえば医学的障害の診断に使用される免疫分
析法のために高度に特異的な双特異性試薬として、或い
は生物系における抗原決定基間の関係を研究するための
分子プローブとして使用することもできる。 双特異性抗体決定子の他の用途は、電極における使用で
ある。任意の形状の電極、たとえばボールチエン(Wohlt
jen)(1984)、アナリテイカル・ケミストリー、第５６
巻、第８７Ａ頁に記載されている電界効果トランジスタ
のような固相センサに使用することができる。 双特異性抗体決定子を用いて作成した酵素電極は、従来
の酵素電極よりも幾つかの利点を有する。１つの利点
は、その正確な自己組立特性である。すなわち、適当な
ハプテンを膜（電極膜或いは電極に連携する別の膜のい
ずれか）に取り付け、次いでこのハプテン誘導膜を適当
な双特異性抗体と酵素とを含有する溶液中へ浸漬するこ
とにより、所望の電極集成体が簡単に作成される。さら
に、この組み立ての容易性は、長時間の使用中に劣化が
生じた後に電極を容易に再充電しうることを意味する。 これら電極の他の利点は、さらに双特異性抗体決定子の
特異性の機能である。任意に与えられた酵素は、抗体の
特異的部位に結合しうる多数の抗原部位を有する。しか
しながら、多数のこれら部位における結合は酵素の失活
をもたらしうる。双特異性モノクローナル抗体決定子の
場合、この問題は決定子が酵素の失活を生ぜしめない部
位においてのみ酵素と結合するよう選択されるので避け
られる。 他の利点は、電極の組み立て又は再充電を不純な酵素混
合物で行ないうることである。何故なら、双特異性抗体
決定子の独特な特異性は、不純な混合物から適切な酵素
を選択しうるからである。或る場合、電極集成体は温和
な二官能価交差リンカー、たとえばジメチルスベルイミ
デートにより安定化させることができる。 双特異性抗体決定子のさらに他の用途は、たとえば分子
マイクロ回路として使用するための自己組立ネツトワー
クの形成における使用である。 上記の用途は、パウラス(Paulus)に係る米国特許第4,44
4,878号公報に詳細に記載されており、参考のためにこ
こに引用する。 以下、本発明の双特異性抗体決定子の作成、並びに抗体
がマウスに由来する場合に使用する特定方法につきより
詳細に説明する。 第４図はウサギIgG1抗体とマウスIgG1抗体（これら抗体
は殆んどモノクローナル抗体からなつている）の間の構
造上の相違を示している。これらの構造は、重鎖を結合
するジスルフイド結合の個数が相違している。ウサギIg
G1の２つの半部は単一結合により合体され、Ｆ(ab′)2
からＦ（ab′）モノマーへの切断、並びにモノマーから
ダイマーへの再結合は、１個のみの結合の破壊及び再形成
を含み、これは比較的簡単な処理である。これに対し、
マウスIgG1の重鎖は３個のジスルフイド結合により結合
され、その破壊及び再形成は第５図に示した種類の鎖内
の競合副反応をもたらして、所望生成物の収率を著しく
低下させる。鎖内反応は、半分子を異なる半分子との結
合に対し使用不可能にする。本発明の方法は、マウスモ
ノクローナル抗体並びに他の哺乳動物に由来する抗体か
ら純粋な双特異性モノクローナル抗体決定子を高収率で
生産することを可能にする。 この方法は次の工程順序を含む。常法を用いて２種の異
なるモノクローナルIgG1抗体試料を作成し、各抗体は２
つの所望特異性の１つを有する。次いで、各試料をたと
えばペプシンのような適当なプロテアーゼに露出させ
て、固体分子のＦ(c′）部分を切断することによりＦ(a
b′)2断片を生成させる。次いで、各試料を、Ｆ（a
b′）半分子を結合しているジスルフイド結合を破壊す
るが分子内の他のジスルフイド結合は破壊しないような
条件にかける。同時に、これらの条件は、たとえばジチ
オール錯体形成剤〔たとえば亜砒酸ナトリウム（第６図
に示す）、芳香族亜砒酸化合物、たとえば酸化フエニル
アルシン又はCdCl2〕の添加により、或いは重鎖のコン
ホメーシヨンを改変することにより（たとえばpHを4.2
まで下げることにより)、或いは蛋白分解酵素（たとえば
カルボキシペプチダーゼＹ）を用いて１個以外の全還元
システイン残基を除去することにより、単一重鎖内のジ
スルフイド結合の形成を阻止するな条件である。 次いで、これら試料の一方をチオール活性化剤に露呈さ
せて遊離チオールの全部を錯体化させることにより、他
の遊離チオールと急速に反応してジスルフイドを形成し
うる誘導体を生成させるが、この誘導体を第６図におけ
る順序１の最後に示す。この目的に適する試薬には、た
とえばＤＴＮＢのような芳香族ジスルフイド〔エルマン
(Ellman)(1959)、Arch.Biochem.Biophys.第82巻、第70
頁〕（第６図）、2,2′−ジピリジンジスルフイド、4,
4′−ジピリジンジスルフイド〔グラセチ(Grasetti)等
(1967)Arch.Biochem.Biophys.第119巻、第41頁〕及びサ
ルフアイト／テトラチオネート〔マスホ等（１９７
９）、B.B.R.C.,第98巻、第320頁〕がある。次いで、こ
の活性化された試料を第６図の順序３にしたがつて、少
なくとも幾つかの半分子が化学的に結合して双特異性抗
体決定子を形成するが単一特異性のＦ(ab′)2を形成し
ないような条件下で、可使チオールを有する他のジチオ
ール錯体化試料と結合させる。 代案として、両試料をチオール活性化剤に露呈させて活
性化チオール誘導体を生成させることもできる（これ
は、多くの場合、活性化誘導体の比較的良好な安定性が
得られるため便利である）。次いで、試料の一方を過剰
の低分子量チオールで処理して、Ｆ（ab′）モノマーに
遊離チオールを再生させ、次いで過剰の低分子チオール
から分離する。ジチオール錯体形成剤（第６図の順序
２）の添加により、或いは重鎖のコンホメーシヨンを改
変することにより、分子内ジスルフイド結合の形成を避
けることができる。しかしながら或る場合には、分子内
ジスルフイド結合を形成することも望ましい。次いで、
この試料を、少なくとも幾つかの半分子が化学的に結合
して双特異性Ｆ(ab′)2を形成するような条件下でチオ
ール活性化型の他のＦ（ab′）試料と結合させる（第６
図の順序３）。 前記条件下で生成されるＦ(ab′)2フラクシヨンは、適
当に精製されたモノクローナル抗体が出発物質として使
用されているならば、所望の双特異性抗体決定子だけで
構成されているので、モノマーＦ（ab′）フラクシヨン
を所望のＦ(ab′)2から分子寸法に基づいてたとえばゲ
ル過のような便利な方法により除去して均質な双特異
性抗体決定子を簡単に得ることができる。 各双特異性決定子が蛋白アビジンにおける独特な抗原部
位に対し特異性である部位と、酵素β−ガラクトシダー
ゼにおける独特な抗原部位に対し特異性である部位とを
有するような同一の双特異性抗体決定子の均質試料を作
成するには、次の手順を使用する。この手順は、第６図
に一般的に示した工程にしたがう。 第１工程は、２種の蛋白質アビジン及びβ−ガラクトシ
ダーゼに対するモノクローナル抗体作成である。これ
は、先ず標準的な免疫法を用いて各蛋白質に対し１群の
BALB/Cマウスを免疫化させることにより行なわれる。 免疫化の後、免疫化動物の膊細胞を作成し、かつこれを
ガルフレ(Galfre)等（１９８１）、メソツズ・イン・エ
ンチモロジー、第７３巻、第３〜４６頁に記載された方
法によりMOPC-21ミエローマ細胞の誘導体（たとえばNS1
又はSP2/0-Ag14）と融合させる。ハイブリツド細胞とヒ
ポキサンチン−アミノブテリン−チミジン媒体中で選択
し、クローン化させ、かつガルフレ等（上記）に記載し
た方法により所望の酵素に対する抗体の産生につきスク
リーニングする。次いで、所望の酵素に対する抗体を産
生することが判明したクローンをスクリーニングして、
酵素に対する高親和性を有しかつ酵素の失活を生ぜしめ
ないようなIgG1種類の抗体を産生するクローンを選択す
る。興味あるクローンを液体窒素下で使用するまで貯蔵
する。プリスタン処理したマウスの腹腔内に腹水腫瘍と
してクローン化細胞を増殖させる標準技術により抗体を
作成する。 次いで、アビジン及びβ−ガラクトシダーゼに対する所
望のIgG1抗体を、パルハム等（１９８２）、ジャーナル
・オブ・イミュノロジカル・メソツヅ、第５３巻、第１
３３〜１７３頁に実質的に記載されるように硫酸アンモ
ニウム沈澱、ゲル過及び直線的塩濃度勾配による ＤＥＡＥセルローズでのクロマトグラフイーを含む方法
によつて腹水液から精製する。これらモノクローナル抗
体を、ラモイ(Lamoyi)及びニソノフ(Nisonoff)(1983)、
ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソツヅ、第５
６巻、第２３５〜２４３頁に記載されたように0.1M酢酸
ナトリウム（pH4.2）においてペプシン（２重量％）と
共に２５℃にて１８時間インキュベートすることによ
り、Ｆ(ab′)2断片まで切断する。次いで、これらＦ(a
b′)2断片を、パルハム等（上記）に記載されたように
0.1Mリン酸ナトリウム（pH6.8）においてＴＳＫ3000Ｓ
Ｗカラムで高性能液体クロマトグラフイーにかけて精製
する。 次いで、これらＦ(ab′)2フランクシヨンを、1mMのEDTA
と10mMの亜砒酸ナトリウムと0.1Mのリン酸ナトリウム
（pH6.8）中において1mMの２−メルカプトエチルアミン
により２５℃にて１８時間還元することによりFab′モ
ノマーまで完全に変換させる。次いで、この混合物に固
体ＤＴＮＢを２０ｍＭの最終濃度まで加える。２５℃に
て２〜３時間後、過剰のＤＴＮＢと低分子量の生成物と
を、0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）及び1mMＥＤＴＡ
で平衡化させたセフアデツクスＧ−25における遠心分離
ゲル過により除去する。得られたFab′モノマーのチ
オニトロベンソエート誘導体は比較的安定であり、これ
を殆んど分解することなく数日間貯蔵することができ
る。 次いで、Fab′モノマーのチオニトロベゾエート誘導体
の１つ（抗アビジン抗体から誘導したもの）を、1mMＥ
ＤＴＡ及び0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）において10
mMのメルカプトエチルアミンと共に２５℃にて３０分間
インキュベートすることにより（ジチオールと錯体化し
た）遊離チオール型まで変換する。次いで、過剰のメル
カプトエチルアミンと低分子量の反応生成物とを、0.1
Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）及び1mMＥＤＴＡで平衡化
させたセフアデツクスＧ−25で遠心分離ゲル過によつ
て除去する。 次いで、得られた抗−アビジンＦ（ab′）−チオールを
直ちに、0.5mg／ｍ若しくはそれ以上の蛋白濃度にて
抗−β−ガラクトシダーゼFab′のチオニトロベンゾエ
ート誘導体の当モル量と２５℃にて３〜２０時間接触さ
せて、双特異性Ｆ(ab′)2を生成させる。次いで、この
混合物に固体ＤＴＮＢを５ｍＭの最終濃度まで加え、か
つ２５℃にて３時間放置することにより全ての非共有結
合性ダイマー物質の消失を促進する。次いで、アビジン
及びβ−ガラクトシダーゼに対する均質な双特異性抗体
決定子を、0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）中における
ＴＳＫ3000SWの高性能液体クロマトグラフイーによりＦ
(ab′)2フラクシヨンを残余のFab′モノマーから分離す
ることによつて作成し、この手順はＦ(ab′)2に害を与
えずかつ他の物質に結合させる必要がなく、活性に影響
を及ぼしうるような構成上の変化の危険性が少ない。所
望の双特異性抗体決定子の形成は、ビオチン置換したセ
ルローズの円盤に対するβ−ガラクトシダーゼのアビジ
ン依存性結合を生ぜしめる能力によつて便利に示すこと
ができる。 双特異性抗体決定子は、化合物（たとえば乳糖）の分析
に際しビオチン置換されたセルロース膜へ結合させるこ
とができ、β−ガラクトシダーゼがその測定に役立つ
（以下詳細に説明する）。 ビオチンに結合したアビジンを有する膜を、抗アビジン
の半部及び抗−β−ガラクトシダーゼの半部を有する双
特異性決定子とβ−ガラクトシダーゼとに簡単に接触さ
せて、ビオチン置換膜上に抗−β−ガラクトシダーゼを
固定化させることができる。同様にして、グルコースオ
キシダーゼも膜に固定化することができる。 上記の同じ手順を用いて、一方が酵素グルコースオキシ
ダーゼにおける独特な抗原部位とβ−ガラクトシダーゼ
における抗原部位とに対する特異性を有しかつ他方がグ
ルコースオキシダーゼに対する異なる抗原部位とＩ型コ
ラーゲンにおける抗原部位とに対する特異性を有するよ
うな、２種の双特異性分子を作成することもできる。こ
れらを使用して、パウルス（上記）に記載されたよう
に、乳糖を一般的に測定するための電極を形成すること
ができる。 以下、分析される未知量の物質の尺度としても比色法、
反射測定法、発光測定法又は螢光測定法により測定しう
る物質につき測定を使用する種類の分析の例につき説明
する。一般に、この分析は液体試料中の未知物質の量を
測定し、この未知物質は少なくとも第１酵素により作用
を受けて、未知物質の尺度として使用しうる測定可能な
イオン若しくは化合物を発生する。分析は、第１酵素と
支持体若しくは第２酵素とに対し特異性を有する本発明
の双特異性抗体決定子によつて、第１酵素を固定支持体
（たとえば、ビーズ又は膜支持体）或いは予め順次に作
用する第２酵素へ結合させることを含む。この方法にお
いては、反応順序に多くの順次の酵素が関与し、作用す
る最後の酵素が一般に支持体に結合される。試料を支持
体に固定化された結合酵素と接触させ、かつ測定可能な
イオン若しくは化合物を測定する。測定しうる未知物質
はたとえば血糖を包含する。 代案として、順次の酵素を、測定すべき未知物質を介し
て適当な双特異性抗体によつて間接的に結合させること
もできる。これは、たとえばホルモン（たとえば妊娠試
験で測定されるヒト絨毛ゴナドトロピン及びインシュリ
ン）のような生物分子につき測定しうる物質の範囲を拡
大する。 第１図は、双特異性抗体決定子により結合される自己組
立酵素の配置を示す（丸印の酵素を結合するシエブロン
として示す）。配列における最後の酵素（ルシフエラー
ゼ）は、たとえばアビジン及びビオチン−置換膜（図示
せず）を用いて固定化させることができる。図示したよ
うに還元された場合、ルシフエラーゼは生物発光性とな
る〔図示した反応連鎖はウイーンハウゼン(Wien-hause
n)及びデルカ(DeLuca)(1982)、アナリチカル・バイオケ
ミストリー、第１２７巻、第３８０頁並びにハスチング
ス(Hastings)等に係る米国特許第4,278,761号公報に詳
細に記載されており、これら参考のためここに引用す
る〕。 第２図は、２個の双特異性モノクローナル抗体決定子を
使用する「チャンネリング」免疫分析を示している 〔図示した分析はリツトマン(Litman)等(1980)、アナリ
テイカル・バイオケミストリー、第１０６巻、第223頁
に記載されたチャンネリング免疫分析の原理の幾つかを
用いる〕。第１の双特異性抗体決定子は、第１酵素と、
測定される抗原（たとえばヒト絨毛ゴナドトロピン）に
おける第１抗原部位とに対し特異性を有する。第２の双
特異性決定子は第２酵素と、測定される抗原における第
２抗原部位とに対し特異性を有する。第１酵素は第１基
質に作用して第２基質を生成することができ、この第２
基質は第２酵素により作用を受けて測定可能な化合物若
しくはイオンを発生することができる。この分析は、測
定すべき分子を含有すると思われる液体混合物を２種の
双特異性決定子及び２種の酵素と、第１基質の存在下で
接触させて行なわれる。未知物質が存在する場合、これ
ら２種の決定子はこの物質に結合しかつ決定子に結合し
た２種の酵素を互いに極めて接近させて２種の反応の効
率を著しく増大させうる。図示した反応式において、第
１酵素はグルコースオキシダーゼであり、第２酵素はペ
ルオキシダーゼであり、第１基質はグルコースであり、
かつ第２基質は過酸化物であつてロイコ染料を酸化する
ことにより測定可能な染料を生成する。配列における最
後の酵素を固定化させることができる。第２図に示した
分析は信号をノイス比に対し改善する光学特性を含み、
酵素結合性の未知物質が存在しない場合にペルオキシダ
ーゼの作用を抑えるのに充分多量の競合酵素（この場
合、カタラーゼ）を使用する。 第３図は、第２図の分析に類似した螢光エネルギー伝達
免疫分析を示している。両者における相違点は、エネル
ギー移動分析においては有機基質でなく光を順次に作用
させて測定可能な結果を得ることである。この分析は２
種の螢光性蛋白質を使用し、図示した分析においてこれ
らはフイコエリトリン（「Phy」）及びアロフイコシアニ
ン（「All」）であり、両者は青色−緑色藻類により生成
され、グレイザー(Glazer)及びストライヤー(St-ryer)
(1983)、バイオフイジカル・ジャーナル、第４３巻、第
３２３頁には免疫分析に有用であると記載されており、
これを参考のためここに引用する。第３図に示したよう
に、一方の双特異性モノクローナル抗体決定子は分析さ
れる抗原（たとえばヒト絨毛ゴナドトロピン）における
第１部位とPhyとに対する特異性を有し、かつ第２双特
異性モノクローナル抗体決定子は抗原における第２部位
とAllとに対する特異性を有する。抗原の存在はPhyとAl
lとに密接させて、エネルギー移動効率を著しく増大さ
せる。Phyが５００ｎｍにて励起しかつ５８０ｎｍにて
透過するのに対し、Allが５００ｎｍにつき透明である
が５８０ｎｍにて励起しかつ６６０ｎｍにて透過するの
で、信号が発生する。かくして、両蛋白質に光を順次に
通過させることにより６６０ｎｍの信号のみが得られ、
この方法の効率は蛋白質の接近性に依存する。上記分析
におけるように、一方又は他方の螢光性蛋白質を、慣用
手段により或いは本発明の双特異性決定子により支持体
上へ固定化することができる。 第７図に示した関連の深い免疫分析は、発光性分子と螢
光性物質との間の発光エネルギー移動を含む〔パテル(P
atel)等（１９８３）、アナリテイカル・バイオケミス
トリー、第１２９巻、第１６２〜１６９頁〕。第７図を
参照して、発光性蛋白質アエクオリンをフイコエリトリ
ンと組み合せて使用する。抗原の存在はアエクオリンと
フイコエリトリンとを近接させて、エネルギー移動効率
を著しく増大させる。Ca+ +の添加は４７５ｎｍにおける
アエクオリンの発光性を誘発して、フイコエリトリンを
励起させると共にこれにより５８０ｎｍにて螢光を発生
させる。かくして、フイコエリトリンによるアエクオリ
ンの発光性の波長変調によつて５８０ｎｍの信号のみが
得られ、その効率はこれら蛋白質の接近性に依存する。 他の実施態様については、以下の請求の範囲に示す。た
とえば、IgG1抗体が好適であるが、本発明にはIgG2及び
IgA抗体も使用することができる。さらにＦ(c′）部分
だけでなく全半分子を使用することもできる。ジチオー
ル錯体形成剤として亜砒酸ナトリウムの代りに0.25ｍＭ
の酸化フエニルアルシンを使用することにより収率を僅
かに向上させることもできる。
の半分子で構成されることが知られている。２つの半分
子よりなるＨ鎖はジスルフイド結合により結合され、こ
れらは選択的還元により破壊することができる。２種の
異なるIgG試料につきこの工程を行なえば、半分子が結
合してハイブリツド抗体を形成することができる。これ
は、完全ウサギグロブリンを用いて行なうことができる
〔ニソノフ(Nisonoff)等、(1964)、サイエンス、第１３
４巻、第３７６−３７９頁〕。さらに、IgA抗体は同一
の半分子まで切断することができる。 また、ハイブリツドは、完全抗体でなくIgG抗体のＦ(a
b′)2断片を用いても形成されている。すなわち、免疫
特異性を与えない分子のＦ(c′）部分は、ハイブリツド
化前に、たとえばペプシンのような適当なプロテアーゼ
での切断によつて除去される。この手法はニソノフ等
（１９６０）、Arch・Biochem.Biophys、第89巻、第230〜
244頁並びにニソノフ及びリバース（１９６０）、Arch・
Biochem・Biophys.、第93巻、第460〜462頁に記載されて
いる。最近の論文〔カレント・コンテンツ（1981年１１
月２日）、第４４巻、第２５頁〕において、ニソノフは
次のように述べている： 「現在まで、この方法は主として抗−フエリチン抗体と
細胞表面抗原に対する抗体とのハイブリツドを用いてフ
エリチンにより細胞表面を染色することによりその用途
が制限されていた。さらに、ハイブリツド抗体の使用
も、薬理剤を所望の組織表面と特異的に接触させる手段
として考えられていた。」 細胞毒性薬剤を供給するためのこの種のハイブリツドの
使用も、ラソ(Raso)及びグリフイン(Griffin)(1978)、Fe
d.Proc・第37巻、第1350頁に示唆されている。 ミルステイン(Milstein)(1981)、Proc.R.Soc.Lond.,第B2
11巻、第393-412頁は「腫瘍の特異的処理に対する毒性
物質のキヤリアとしてモノクローナル抗体」を使用する
可能性を示唆して、「Fab断片は完全抗体よりも良好な
標的剤である」と述べている。 さらにハイブリツド抗体は、それぞれ異なる抗体を生成
しうる２個の細胞を融合させてハイブリツド抗体を産生
しうるハイブリツド細胞を作成することによつても作ら
れている。この種の方法は、ミルステイン・アンド・ク
エロ(Milstein&Cuello)(1983)、ネイチヤー、第３０５
巻、第５３７〜５４０頁に記載されている。異なるモノ
クローナル抗体を産生するマウスハイブリーマ細胞を融
合させ、かつ得られた融合細胞により２種の異なる群の
親の重鎖と軽鎖との全ゆる可能な組み合せで構成される
抗体混合物が産生される。この分子混合物には、親の抗
体分子のそれぞれの半部よりなるハイブリツド抗体があ
り、これはイオン交換クロマトグラフイーにより部分精
製することができた。 他の論文、すなわちラソ等（１９８１）、キヤンサー・
リサーチ、第４１巻、第２０７５−２０７８頁は、ウサ
ギ抗体Ｆ(ab′)2断片の不純な試料の生成を記載してい
る。このウサギ抗体断片は還元により切断され、かつア
ンチリシンＡ鎖Ｆ(ab′)2断片と再結合された。標的薬
剤供給実験には、双特異性のダイマーが使用された。こ
の論文は次のように述べている： 「この研究に使用した２種類の精製抗体は慣用のヘテロ
抗血清から単離した。したがつて、これら２種のものを
融合させると、複雑な親和性と特異性との組み合せが生
ずる筈である。均質なハイブリドーマ由来の抗体の出現
は、ハイブリツド抗体の構成半部の結合親和性に対し完
全な制御を与え、この均一性は供給ベヒクルとしてのそ
の最終的効果を著しく促進する。」 本発明は同一の双特異性(bispecific)抗体決定子よりな
る均質試料を提供し、各双特異性決定子はジスルフイド
結合により結合された２個のＬ−Ｈ半分子で構成され、
各Ｌ−Ｈ半分子は互いに異なつており、かつ異なる抗原
決定基に対し特異性である。 本発明の双特異性モノクローナル抗体決定子は、それぞ
れ１個もしくはそれ以上のジスルフイド結合により結合
された２個の同一のＬ−Ｈ半分子よりなる２種の異なる
モノクローナル抗体決定子を供給し、これら２種の異な
る抗体決定子をジスルフイド結合を破壊するのに充分な
条件にかけ、Ｌ−Ｈ半分子をこれらが化学的に結合して
１個もしくはそれ以上のジスルフイド結合の形成により
双特異性抗体決定子を形成しうるような条件下で結合さ
せることにより作成される。 好ましくは、この方法はさらに、結合工程前にチオール
活性化剤により一対の同一半分子を誘導体化する工程を
含み、チオール活性化剤はチオール活性化半分子と異な
る半分子との間のジスルフイド結合の形成を促進する。 他の好適具体例において、モノクローナル抗体はIgG
（特に好ましくはIgG1、或いはやや劣るがIgG2A、IgG2B
若しくはIgG3）又はIgAである。各半分子は、IgG抗体か
ら誘導される場合、少なくともＦ（ab′）部分を含む。
チオール活性化剤は、チオール活性化半分子同志の再結
合を防止する。モノクローナル抗体決定子の一方又は両
者は２個以上のジスルフイド結合により結合された半分
子で構成され、これら決定子を半分子まで切断する工程
は、これら半分子のＨ鎖内におけるジスルフイド結合の
形成を阻止するような条件下で行なわれ、チオール活性
化剤は5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、2,
2′−ジピリジンジスルフイド、4,4′−ジピリジンジス
ルフイド又はサルフアイトとテトラチオネートとの混合
物である〔Ｆ（ab′）断片を他の蛋白質へ結合するため
のチオール活性化剤の使用は、たとえばラソ等(1980)ジ
ヤーナル・イミユノロジー、第１２５巻、第2610頁；ラ
ソ等、（１９８２）、キヤンサー・リサーチ、第４２
巻、第４５７頁及びマスホ等（１９７９）、Ｂ．Ｂ．
Ｒ．Ｃ．，第９０巻、第３２０頁に記載されており、こ
れらをここに参考のため引用する〕。好ましくは、ジス
ルフイド結合により元来結合されていた半分子のＨ鎖内
でのジスルフイド結合の形成は、切断反応をたとえば亜
砒酸化合物（たとえば亜砒酸ナトリウム）のような無機
亜砒酸塩或いはアリール亜砒酸エステル（たとえば酸化
フエニルアルシン）或いはカドミウム塩のようなジチオ
ール錯体形成剤の存在下で行なうことにより、或いは切
断反応をＨ鎖のコンホメーシヨンが改変されてジスルフ
イド結合の形成を阻止するような条件下、たとえばpH3.
8〜4.5（最も好ましくは4.2）の下で行なうことによ
り、或いはたとえばカルボキシペプチターゼＹのような
蛋白分解酵素を用いて１個以外の全システイン残基を除
去することにより阻止される。 互いに相似な半分子の再結合を阻止した場合、混合物か
らの双特異性決定子の精製はたとえばゲル過により分
子寸法に基づいて簡単に行なうことができる。これは、
溶解している分子、すなわち半分子及び双特異性ハイブ
リツド分子が寸法において半分子１つ分だけ相違してい
るので可能である。他の分離法は、たとえばイオン交換
及び等電点電気泳動法である。 第１図は生物発光分析に有用な集成体の略図であり、 第２図は双特異性モノクローナル抗体決定子を用いるチ
ヤンネリング免疫分析の略図であり、 第３図は双特異性モノクローナル抗体決定子を用いる螢
光エネルギー移動免疫分析の略図であり、 第４図はマウスIgG1と比較したウサギIgG2の構造を示す
略図であり、 第５図はマウス半分子における鎖内ジスルフイド競合反
応の略図であり、 第６図は双特異性モノクローナル抗体決定子の好適製造
方法の略図であり、 第７図は双特異性モノクローナル抗体決定子を用いる発
光エネルギー移動免疫分析の略図である。 本発明の双特異性モノクローナル抗体決定子は広範な用
途に有用である。これらの用途は全て、これら決定子が
動物における抗体生産を刺激しうる任意の２種の遊離の
又は表面若しくは粒子上に固定化された有効な蛋白、ポ
リペプチド、炭水化物、核酸又はハプテンなどの抗原決
定基の特異的部位の間を連結する高度に特的なリンカー
として作用しうる能力に由来する。 本発明による双特異性抗体決定子の１つの用途は、異な
る抗原決定基を含有するか又は固定化させた所望の表面
へ所望の抗原物質を結合させる薬剤としての使用であ
る。たとえば、粒子又は膜に固定化された酸素を固相触
媒として使用することができる。他のものに比較したこ
の種の固定化の利点は、酵素活性に対し悪影響のない抗
体を選択しうること、及び不純な混合物から純粋な酵素
を固定化させうることである。さらに、双特異性抗体決
定子は、たとえば医学的障害の診断に使用される免疫分
析法のために高度に特異的な双特異性試薬として、或い
は生物系における抗原決定基間の関係を研究するための
分子プローブとして使用することもできる。 双特異性抗体決定子の他の用途は、電極における使用で
ある。任意の形状の電極、たとえばボールチエン(Wohlt
jen)(1984)、アナリテイカル・ケミストリー、第５６
巻、第８７Ａ頁に記載されている電界効果トランジスタ
のような固相センサに使用することができる。 双特異性抗体決定子を用いて作成した酵素電極は、従来
の酵素電極よりも幾つかの利点を有する。１つの利点
は、その正確な自己組立特性である。すなわち、適当な
ハプテンを膜（電極膜或いは電極に連携する別の膜のい
ずれか）に取り付け、次いでこのハプテン誘導膜を適当
な双特異性抗体と酵素とを含有する溶液中へ浸漬するこ
とにより、所望の電極集成体が簡単に作成される。さら
に、この組み立ての容易性は、長時間の使用中に劣化が
生じた後に電極を容易に再充電しうることを意味する。 これら電極の他の利点は、さらに双特異性抗体決定子の
特異性の機能である。任意に与えられた酵素は、抗体の
特異的部位に結合しうる多数の抗原部位を有する。しか
しながら、多数のこれら部位における結合は酵素の失活
をもたらしうる。双特異性モノクローナル抗体決定子の
場合、この問題は決定子が酵素の失活を生ぜしめない部
位においてのみ酵素と結合するよう選択されるので避け
られる。 他の利点は、電極の組み立て又は再充電を不純な酵素混
合物で行ないうることである。何故なら、双特異性抗体
決定子の独特な特異性は、不純な混合物から適切な酵素
を選択しうるからである。或る場合、電極集成体は温和
な二官能価交差リンカー、たとえばジメチルスベルイミ
デートにより安定化させることができる。 双特異性抗体決定子のさらに他の用途は、たとえば分子
マイクロ回路として使用するための自己組立ネツトワー
クの形成における使用である。 上記の用途は、パウラス(Paulus)に係る米国特許第4,44
4,878号公報に詳細に記載されており、参考のためにこ
こに引用する。 以下、本発明の双特異性抗体決定子の作成、並びに抗体
がマウスに由来する場合に使用する特定方法につきより
詳細に説明する。 第４図はウサギIgG1抗体とマウスIgG1抗体（これら抗体
は殆んどモノクローナル抗体からなつている）の間の構
造上の相違を示している。これらの構造は、重鎖を結合
するジスルフイド結合の個数が相違している。ウサギIg
G1の２つの半部は単一結合により合体され、Ｆ(ab′)2
からＦ（ab′）モノマーへの切断、並びにモノマーから
ダイマーへの再結合は、１個のみの結合の破壊及び再形成
を含み、これは比較的簡単な処理である。これに対し、
マウスIgG1の重鎖は３個のジスルフイド結合により結合
され、その破壊及び再形成は第５図に示した種類の鎖内
の競合副反応をもたらして、所望生成物の収率を著しく
低下させる。鎖内反応は、半分子を異なる半分子との結
合に対し使用不可能にする。本発明の方法は、マウスモ
ノクローナル抗体並びに他の哺乳動物に由来する抗体か
ら純粋な双特異性モノクローナル抗体決定子を高収率で
生産することを可能にする。 この方法は次の工程順序を含む。常法を用いて２種の異
なるモノクローナルIgG1抗体試料を作成し、各抗体は２
つの所望特異性の１つを有する。次いで、各試料をたと
えばペプシンのような適当なプロテアーゼに露出させ
て、固体分子のＦ(c′）部分を切断することによりＦ(a
b′)2断片を生成させる。次いで、各試料を、Ｆ（a
b′）半分子を結合しているジスルフイド結合を破壊す
るが分子内の他のジスルフイド結合は破壊しないような
条件にかける。同時に、これらの条件は、たとえばジチ
オール錯体形成剤〔たとえば亜砒酸ナトリウム（第６図
に示す）、芳香族亜砒酸化合物、たとえば酸化フエニル
アルシン又はCdCl2〕の添加により、或いは重鎖のコン
ホメーシヨンを改変することにより（たとえばpHを4.2
まで下げることにより)、或いは蛋白分解酵素（たとえば
カルボキシペプチダーゼＹ）を用いて１個以外の全還元
システイン残基を除去することにより、単一重鎖内のジ
スルフイド結合の形成を阻止するな条件である。 次いで、これら試料の一方をチオール活性化剤に露呈さ
せて遊離チオールの全部を錯体化させることにより、他
の遊離チオールと急速に反応してジスルフイドを形成し
うる誘導体を生成させるが、この誘導体を第６図におけ
る順序１の最後に示す。この目的に適する試薬には、た
とえばＤＴＮＢのような芳香族ジスルフイド〔エルマン
(Ellman)(1959)、Arch.Biochem.Biophys.第82巻、第70
頁〕（第６図）、2,2′−ジピリジンジスルフイド、4,
4′−ジピリジンジスルフイド〔グラセチ(Grasetti)等
(1967)Arch.Biochem.Biophys.第119巻、第41頁〕及びサ
ルフアイト／テトラチオネート〔マスホ等（１９７
９）、B.B.R.C.,第98巻、第320頁〕がある。次いで、こ
の活性化された試料を第６図の順序３にしたがつて、少
なくとも幾つかの半分子が化学的に結合して双特異性抗
体決定子を形成するが単一特異性のＦ(ab′)2を形成し
ないような条件下で、可使チオールを有する他のジチオ
ール錯体化試料と結合させる。 代案として、両試料をチオール活性化剤に露呈させて活
性化チオール誘導体を生成させることもできる（これ
は、多くの場合、活性化誘導体の比較的良好な安定性が
得られるため便利である）。次いで、試料の一方を過剰
の低分子量チオールで処理して、Ｆ（ab′）モノマーに
遊離チオールを再生させ、次いで過剰の低分子チオール
から分離する。ジチオール錯体形成剤（第６図の順序
２）の添加により、或いは重鎖のコンホメーシヨンを改
変することにより、分子内ジスルフイド結合の形成を避
けることができる。しかしながら或る場合には、分子内
ジスルフイド結合を形成することも望ましい。次いで、
この試料を、少なくとも幾つかの半分子が化学的に結合
して双特異性Ｆ(ab′)2を形成するような条件下でチオ
ール活性化型の他のＦ（ab′）試料と結合させる（第６
図の順序３）。 前記条件下で生成されるＦ(ab′)2フラクシヨンは、適
当に精製されたモノクローナル抗体が出発物質として使
用されているならば、所望の双特異性抗体決定子だけで
構成されているので、モノマーＦ（ab′）フラクシヨン
を所望のＦ(ab′)2から分子寸法に基づいてたとえばゲ
ル過のような便利な方法により除去して均質な双特異
性抗体決定子を簡単に得ることができる。 各双特異性決定子が蛋白アビジンにおける独特な抗原部
位に対し特異性である部位と、酵素β−ガラクトシダー
ゼにおける独特な抗原部位に対し特異性である部位とを
有するような同一の双特異性抗体決定子の均質試料を作
成するには、次の手順を使用する。この手順は、第６図
に一般的に示した工程にしたがう。 第１工程は、２種の蛋白質アビジン及びβ−ガラクトシ
ダーゼに対するモノクローナル抗体作成である。これ
は、先ず標準的な免疫法を用いて各蛋白質に対し１群の
BALB/Cマウスを免疫化させることにより行なわれる。 免疫化の後、免疫化動物の膊細胞を作成し、かつこれを
ガルフレ(Galfre)等（１９８１）、メソツズ・イン・エ
ンチモロジー、第７３巻、第３〜４６頁に記載された方
法によりMOPC-21ミエローマ細胞の誘導体（たとえばNS1
又はSP2/0-Ag14）と融合させる。ハイブリツド細胞とヒ
ポキサンチン−アミノブテリン−チミジン媒体中で選択
し、クローン化させ、かつガルフレ等（上記）に記載し
た方法により所望の酵素に対する抗体の産生につきスク
リーニングする。次いで、所望の酵素に対する抗体を産
生することが判明したクローンをスクリーニングして、
酵素に対する高親和性を有しかつ酵素の失活を生ぜしめ
ないようなIgG1種類の抗体を産生するクローンを選択す
る。興味あるクローンを液体窒素下で使用するまで貯蔵
する。プリスタン処理したマウスの腹腔内に腹水腫瘍と
してクローン化細胞を増殖させる標準技術により抗体を
作成する。 次いで、アビジン及びβ−ガラクトシダーゼに対する所
望のIgG1抗体を、パルハム等（１９８２）、ジャーナル
・オブ・イミュノロジカル・メソツヅ、第５３巻、第１
３３〜１７３頁に実質的に記載されるように硫酸アンモ
ニウム沈澱、ゲル過及び直線的塩濃度勾配による ＤＥＡＥセルローズでのクロマトグラフイーを含む方法
によつて腹水液から精製する。これらモノクローナル抗
体を、ラモイ(Lamoyi)及びニソノフ(Nisonoff)(1983)、
ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソツヅ、第５
６巻、第２３５〜２４３頁に記載されたように0.1M酢酸
ナトリウム（pH4.2）においてペプシン（２重量％）と
共に２５℃にて１８時間インキュベートすることによ
り、Ｆ(ab′)2断片まで切断する。次いで、これらＦ(a
b′)2断片を、パルハム等（上記）に記載されたように
0.1Mリン酸ナトリウム（pH6.8）においてＴＳＫ3000Ｓ
Ｗカラムで高性能液体クロマトグラフイーにかけて精製
する。 次いで、これらＦ(ab′)2フランクシヨンを、1mMのEDTA
と10mMの亜砒酸ナトリウムと0.1Mのリン酸ナトリウム
（pH6.8）中において1mMの２−メルカプトエチルアミン
により２５℃にて１８時間還元することによりFab′モ
ノマーまで完全に変換させる。次いで、この混合物に固
体ＤＴＮＢを２０ｍＭの最終濃度まで加える。２５℃に
て２〜３時間後、過剰のＤＴＮＢと低分子量の生成物と
を、0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）及び1mMＥＤＴＡ
で平衡化させたセフアデツクスＧ−25における遠心分離
ゲル過により除去する。得られたFab′モノマーのチ
オニトロベンソエート誘導体は比較的安定であり、これ
を殆んど分解することなく数日間貯蔵することができ
る。 次いで、Fab′モノマーのチオニトロベゾエート誘導体
の１つ（抗アビジン抗体から誘導したもの）を、1mMＥ
ＤＴＡ及び0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）において10
mMのメルカプトエチルアミンと共に２５℃にて３０分間
インキュベートすることにより（ジチオールと錯体化し
た）遊離チオール型まで変換する。次いで、過剰のメル
カプトエチルアミンと低分子量の反応生成物とを、0.1
Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）及び1mMＥＤＴＡで平衡化
させたセフアデツクスＧ−25で遠心分離ゲル過によつ
て除去する。 次いで、得られた抗−アビジンＦ（ab′）−チオールを
直ちに、0.5mg／ｍ若しくはそれ以上の蛋白濃度にて
抗−β−ガラクトシダーゼFab′のチオニトロベンゾエ
ート誘導体の当モル量と２５℃にて３〜２０時間接触さ
せて、双特異性Ｆ(ab′)2を生成させる。次いで、この
混合物に固体ＤＴＮＢを５ｍＭの最終濃度まで加え、か
つ２５℃にて３時間放置することにより全ての非共有結
合性ダイマー物質の消失を促進する。次いで、アビジン
及びβ−ガラクトシダーゼに対する均質な双特異性抗体
決定子を、0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH6.8）中における
ＴＳＫ3000SWの高性能液体クロマトグラフイーによりＦ
(ab′)2フラクシヨンを残余のFab′モノマーから分離す
ることによつて作成し、この手順はＦ(ab′)2に害を与
えずかつ他の物質に結合させる必要がなく、活性に影響
を及ぼしうるような構成上の変化の危険性が少ない。所
望の双特異性抗体決定子の形成は、ビオチン置換したセ
ルローズの円盤に対するβ−ガラクトシダーゼのアビジ
ン依存性結合を生ぜしめる能力によつて便利に示すこと
ができる。 双特異性抗体決定子は、化合物（たとえば乳糖）の分析
に際しビオチン置換されたセルロース膜へ結合させるこ
とができ、β−ガラクトシダーゼがその測定に役立つ
（以下詳細に説明する）。 ビオチンに結合したアビジンを有する膜を、抗アビジン
の半部及び抗−β−ガラクトシダーゼの半部を有する双
特異性決定子とβ−ガラクトシダーゼとに簡単に接触さ
せて、ビオチン置換膜上に抗−β−ガラクトシダーゼを
固定化させることができる。同様にして、グルコースオ
キシダーゼも膜に固定化することができる。 上記の同じ手順を用いて、一方が酵素グルコースオキシ
ダーゼにおける独特な抗原部位とβ−ガラクトシダーゼ
における抗原部位とに対する特異性を有しかつ他方がグ
ルコースオキシダーゼに対する異なる抗原部位とＩ型コ
ラーゲンにおける抗原部位とに対する特異性を有するよ
うな、２種の双特異性分子を作成することもできる。こ
れらを使用して、パウルス（上記）に記載されたよう
に、乳糖を一般的に測定するための電極を形成すること
ができる。 以下、分析される未知量の物質の尺度としても比色法、
反射測定法、発光測定法又は螢光測定法により測定しう
る物質につき測定を使用する種類の分析の例につき説明
する。一般に、この分析は液体試料中の未知物質の量を
測定し、この未知物質は少なくとも第１酵素により作用
を受けて、未知物質の尺度として使用しうる測定可能な
イオン若しくは化合物を発生する。分析は、第１酵素と
支持体若しくは第２酵素とに対し特異性を有する本発明
の双特異性抗体決定子によつて、第１酵素を固定支持体
（たとえば、ビーズ又は膜支持体）或いは予め順次に作
用する第２酵素へ結合させることを含む。この方法にお
いては、反応順序に多くの順次の酵素が関与し、作用す
る最後の酵素が一般に支持体に結合される。試料を支持
体に固定化された結合酵素と接触させ、かつ測定可能な
イオン若しくは化合物を測定する。測定しうる未知物質
はたとえば血糖を包含する。 代案として、順次の酵素を、測定すべき未知物質を介し
て適当な双特異性抗体によつて間接的に結合させること
もできる。これは、たとえばホルモン（たとえば妊娠試
験で測定されるヒト絨毛ゴナドトロピン及びインシュリ
ン）のような生物分子につき測定しうる物質の範囲を拡
大する。 第１図は、双特異性抗体決定子により結合される自己組
立酵素の配置を示す（丸印の酵素を結合するシエブロン
として示す）。配列における最後の酵素（ルシフエラー
ゼ）は、たとえばアビジン及びビオチン−置換膜（図示
せず）を用いて固定化させることができる。図示したよ
うに還元された場合、ルシフエラーゼは生物発光性とな
る〔図示した反応連鎖はウイーンハウゼン(Wien-hause
n)及びデルカ(DeLuca)(1982)、アナリチカル・バイオケ
ミストリー、第１２７巻、第３８０頁並びにハスチング
ス(Hastings)等に係る米国特許第4,278,761号公報に詳
細に記載されており、これら参考のためここに引用す
る〕。 第２図は、２個の双特異性モノクローナル抗体決定子を
使用する「チャンネリング」免疫分析を示している 〔図示した分析はリツトマン(Litman)等(1980)、アナリ
テイカル・バイオケミストリー、第１０６巻、第223頁
に記載されたチャンネリング免疫分析の原理の幾つかを
用いる〕。第１の双特異性抗体決定子は、第１酵素と、
測定される抗原（たとえばヒト絨毛ゴナドトロピン）に
おける第１抗原部位とに対し特異性を有する。第２の双
特異性決定子は第２酵素と、測定される抗原における第
２抗原部位とに対し特異性を有する。第１酵素は第１基
質に作用して第２基質を生成することができ、この第２
基質は第２酵素により作用を受けて測定可能な化合物若
しくはイオンを発生することができる。この分析は、測
定すべき分子を含有すると思われる液体混合物を２種の
双特異性決定子及び２種の酵素と、第１基質の存在下で
接触させて行なわれる。未知物質が存在する場合、これ
ら２種の決定子はこの物質に結合しかつ決定子に結合し
た２種の酵素を互いに極めて接近させて２種の反応の効
率を著しく増大させうる。図示した反応式において、第
１酵素はグルコースオキシダーゼであり、第２酵素はペ
ルオキシダーゼであり、第１基質はグルコースであり、
かつ第２基質は過酸化物であつてロイコ染料を酸化する
ことにより測定可能な染料を生成する。配列における最
後の酵素を固定化させることができる。第２図に示した
分析は信号をノイス比に対し改善する光学特性を含み、
酵素結合性の未知物質が存在しない場合にペルオキシダ
ーゼの作用を抑えるのに充分多量の競合酵素（この場
合、カタラーゼ）を使用する。 第３図は、第２図の分析に類似した螢光エネルギー伝達
免疫分析を示している。両者における相違点は、エネル
ギー移動分析においては有機基質でなく光を順次に作用
させて測定可能な結果を得ることである。この分析は２
種の螢光性蛋白質を使用し、図示した分析においてこれ
らはフイコエリトリン（「Phy」）及びアロフイコシアニ
ン（「All」）であり、両者は青色−緑色藻類により生成
され、グレイザー(Glazer)及びストライヤー(St-ryer)
(1983)、バイオフイジカル・ジャーナル、第４３巻、第
３２３頁には免疫分析に有用であると記載されており、
これを参考のためここに引用する。第３図に示したよう
に、一方の双特異性モノクローナル抗体決定子は分析さ
れる抗原（たとえばヒト絨毛ゴナドトロピン）における
第１部位とPhyとに対する特異性を有し、かつ第２双特
異性モノクローナル抗体決定子は抗原における第２部位
とAllとに対する特異性を有する。抗原の存在はPhyとAl
lとに密接させて、エネルギー移動効率を著しく増大さ
せる。Phyが５００ｎｍにて励起しかつ５８０ｎｍにて
透過するのに対し、Allが５００ｎｍにつき透明である
が５８０ｎｍにて励起しかつ６６０ｎｍにて透過するの
で、信号が発生する。かくして、両蛋白質に光を順次に
通過させることにより６６０ｎｍの信号のみが得られ、
この方法の効率は蛋白質の接近性に依存する。上記分析
におけるように、一方又は他方の螢光性蛋白質を、慣用
手段により或いは本発明の双特異性決定子により支持体
上へ固定化することができる。 第７図に示した関連の深い免疫分析は、発光性分子と螢
光性物質との間の発光エネルギー移動を含む〔パテル(P
atel)等（１９８３）、アナリテイカル・バイオケミス
トリー、第１２９巻、第１６２〜１６９頁〕。第７図を
参照して、発光性蛋白質アエクオリンをフイコエリトリ
ンと組み合せて使用する。抗原の存在はアエクオリンと
フイコエリトリンとを近接させて、エネルギー移動効率
を著しく増大させる。Ca+ +の添加は４７５ｎｍにおける
アエクオリンの発光性を誘発して、フイコエリトリンを
励起させると共にこれにより５８０ｎｍにて螢光を発生
させる。かくして、フイコエリトリンによるアエクオリ
ンの発光性の波長変調によつて５８０ｎｍの信号のみが
得られ、その効率はこれら蛋白質の接近性に依存する。 他の実施態様については、以下の請求の範囲に示す。た
とえば、IgG1抗体が好適であるが、本発明にはIgG2及び
IgA抗体も使用することができる。さらにＦ(c′）部分
だけでなく全半分子を使用することもできる。ジチオー
ル錯体形成剤として亜砒酸ナトリウムの代りに0.25ｍＭ
の酸化フエニルアルシンを使用することにより収率を僅
かに向上させることもできる。
─────────────────────────────────────────────────────
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(56)参考文献 特表昭58−502182（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】２種の異なるモノクローナル抗体決定子を
供給し、該モノクローナル抗体決定子の一方又は両者は
２個以上のジスルフィド結合により結合されたＬ−Ｈ半
分子で構成され、 前記Ｌ−Ｈ半分子を結合する前記ジスルフィド結合を破
壊するのに充分な条件に前記２種の異なる抗体決定子を
かけることにより、各決定子を一対の同一半分子に切断
し、 前記同一半分子対の１つをジスルフィド結合の形成を促
進するチオール活性化剤で誘導体化させ、かつ 前記半分子をこれらが１個若しくはそれ以上のジスルフ
ィド結合の形成により双特異性抗体決定子を形成しうる
条件下で結合させる 工程を含む双特異性モノクローナル抗体決定子の製造方
法であって、 前記２種の異なる抗体決定子がIgG若しくはIgAであり、 １つより多いジスルフィド結合を有する前記決定子を半
分子に切断する工程を、前記半分子のＨ鎖内でのジスル
フィド結合の形成を阻止するジチオール錯体形成剤の存
在下で行なうこと を特徴とする上記の製造方法。 【請求項１】ジチオール錯体形成剤が亜砒酸化合物を含
む請求の範囲第１項記載の方法。 【請求項３】亜砒酸化合物が無機亜砒酸塩を含む請求の
範囲第２項記載の方法。 【請求項４】無機亜砒酸塩が亜砒酸ナトリウムを含む請
求の範囲第３項記載の方法。 【請求項５】亜砒酸化合物がアリール亜砒酸エステルを
含む請求の範囲第２項記載の方法。 【請求項６】アリール亜砒酸エステルが酸化フェニルア
ルシンを含む請求の範囲第５項記載の方法。 【請求項７】ジチオール錯体形成剤がカドミウム塩を含
む請求の範囲第１項記載の方法。 【請求項８】チオール活性化剤が２，２′−ジピリジン
ジスルフィドを含む請求の範囲第１項記載の方法。 【請求項９】チオール活性化剤が４，４′−ジピリジン
ジスルフィドを含む請求の範囲第１項記載の方法。 【請求項１０】チオール活性化剤がサルファイトとテト
ラチオネートとの混合物を含む請求の範囲第１項記載の
方法。
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