CN115561230B - 二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用。经本申请的发明人研究发现，通过添加一定量的二硫苏糖醇(DTT)可以显著性提升三联吡啶钌标记抗体的稳定性。因此，本发明提供了一种二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，产品包括含有三联吡啶钌标记抗体和二硫苏糖醇的检测试剂。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用。
背景技术
电化学发光(又称电致化学发光)是指通过在电极表面施加适合的电压产生一些特定的电生物质，然后这些电生物质之间或电生物质与体系中的一些组分之间通过某些特定的反应引起电子传递然后形成激发态，这些激发态物质由激发态返回到基态同时释放能量并伴随有发光的一种现象。电化学发光需要经历两个过程：电化学反应与化学发光反应。电化学反应过程的任务主要是提供发生化学发光反应的中间体，化学发光反应则是产生的一些中间体之间或是中间体与体系中其它某些组分之间发生化学发光反应而产生激发态的过程，当激发态的物质回到基态时伴有光辐射现象。
电化学发光分为四种类型：第一种：电化学发光通过单重激发态途径的产生，在电极上施加适当的电压，分子R在电压作用下被氧化或被还原产生R+或R-，然后R+和R-相互反应产生单重激发态，此单重激发态回到基态时释放能量并伴随发光。第二种：电化学发光是通过三重激发态途径的产生，在电极上施加适当的电压，使分子R在电压作用下被氧化或被还原产生R+或R-，然后R+和R-再相互反应产生三重激发态，该三重激发态回到基态时伴有光辐射现象。第三种：电化学发光是共存物质的二次反应引起的，溶液内存在的其他物质与电解的产物之间发生氧化或是还原反应，生成分子或离子型激发态。第四种：由有某些特殊性质的溶剂分子引起的化学发光，如在六甲基磷酸肽胺中若存在较高浓度的NaClO4、LiClO4、LiCl、NaBF4、KI等类无机化合物，当外加一定直流电压时，就会产生电化学发光。
电化学发光免疫分析((electro-chemiluminescence immunoassay，ECLIA)是将免疫技术和电化学发光相结合的一种标记免疫分析方法。它结合了抗原抗体反应的特异性高和电化学发光检测的灵敏度高的特点，因其具有无放射性，灵敏度高，线性范围宽，操作简便，易标记，可实现在线活体分析等优点而备受关注。电化学发光免疫分析适用于对生物组织、体液等复杂生物样品中极低含量的生化物质及药物的分析，因此在免疫分析研究中发挥着越来越重要的作用。
目前，电化学发光免疫分析的化学发光剂主要为三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+，用化学发光剂三联吡啶钌标记抗体，通过抗原抗体反应和磁颗粒分离技术，再根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度的大小而对待测的抗原或抗体进行定量或定性。著名的罗氏诊断公司的免疫检测产品就为此方法学的产品。三联吡啶钌显著特点就是它的稳定性要远远高于同样用途的各种酶类(例如HRP酶、AP酶等)。一般认为采用三联吡啶钌标记抗体后抗体的活性不受影响，但研究多个三联吡啶钌标记的抗体后发现，有大约二十分之一的抗体在被标记上三联吡啶钌后，稳定性急剧下降，在溶液中的半衰期从数年降到了一周左右，而其他抗体标记三联吡啶钌后稳定性无明显变化。因此，如何能够使这些三联吡啶钌标记的抗体稳定，减少三联吡啶钌对被标记的抗体的影响，成为了制备高质量电化学发光免疫试剂的关键环节。
发明内容
经本申请的发明人研究发现，通过添加一定量的二硫苏糖醇(DTT)可以显著性提升三联吡啶钌标记抗体的稳定性。基于此，本申请一实施例提供一种二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用。
此外，还提供了一种稳定性好的基于电化学发光免疫分析的产品。
一种二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，所述产品包括含有三联吡啶钌标记抗体和二硫苏糖醇的检测试剂。
在其中一个实施例中，在所述检测试剂中，所述二硫苏糖醇的质量百分含量为0.001％～0.01％。
在其中一个实施例中，所述三联吡啶钌标记抗体包括三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体或三联吡啶钌标记的癌胚抗原抗体。
在其中一个实施例中，所述检测试剂还包含缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液和MOPSO缓冲液中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述检测试剂还包含无机盐、表面活性剂和保护剂中的一种或多种，所述无机盐包括氯化钠和氯化钾中的一种或两种，所述表面活性剂包括吐温80、吐温20和TritonX-100中的一种或多种，所述保护剂为酪蛋白、酪蛋白酸钠、琥珀酸酪蛋白、重组酪蛋白酸钠和重组琥珀酸酪蛋白的一种或多种。
在其中一个实施例中，在所述检测试剂中，所述无机盐的质量百分含量为0.5％～5％，所述表面活性剂的质量百分含量为0.2％～3％，所述保护剂的质量百分含量为0.05％～2％。
在其中一个实施例中，所述检测试剂还包括质量百分含量为1％～3％的牛血清白蛋白。
在其中一个实施例中，所述检测试剂还包括质量百分含量为1％～5％的牛血清。
在其中一个实施例中，所述检测试剂还包括防腐剂，防腐剂选自proclin 300和叠氮钠中的至少一种。
在其中一个实施例中，在所述检测试剂中，所述防腐剂的质量百分含量为0.05％～0.5％。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
在本发明的描述中，“多种”的含义是至少两种，例如两种，三种等，除非另有明确具体的限定。
术语“抗体”指能特异性结合于相应抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽。抗体可为多克隆或单克隆、多链或单链或完整免疫球蛋白，可来源于天然来源或重组来源。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链及两条轻(L)链的四聚体。各重链由重链可变区(VH)及重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2及CH3)构成。各轻链由轻链可变区(VL)及轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域(CL)构成。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，分散在称为框架区(FR)的较保守区中。各VH及VL由自氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR及四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体。抗体可以属于任何同种型/类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
本文所用的术语“抗原”指与能够与抗体特异性结合的物质。除非与上下文矛盾，术语“抗原”和“待测物质”可在本发明的上下文中互换使用。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
二硫苏糖醇(Dithiothreitol，简称为DTT)是一种小分子还原剂，化学式为C4H10O2S2，其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。经本申请的发明人研究发现，通过添加一定量的二硫苏糖醇(DTT)可以显著性提升三联吡啶钌标记抗体的稳定性。
基于此，本申请一实施方式提供了一种二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用。具体地，该产品包括含有三联吡啶钌标记抗体和二硫苏糖醇的检测试剂。
进一步地，在检测试剂中，二硫苏糖醇的质量百分含量为0.001％～0.01％。在一个可选地具体示例中，检测试剂中的二硫苏糖醇的质量百分含量为0.001％、0.003％、0.005％、0.007％、0.008％或0.01％。进一步地，检测试剂中的二硫苏糖醇的质量浓度为0.002％～0.08％。更进一步地，检测试剂中的二硫苏糖醇的质量浓度为0.002％～0.05％。
在一些实施例中，三联吡啶钌标记抗体包括三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体、三联吡啶钌标记的癌胚抗原抗体等抗体。可以理解的是，三联吡啶钌标记的抗体不限于上甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，还可以是其他抗体。当然，针对某一抗原的抗体会有多种，然而，不是针对该抗原的所有抗体都会容易受三联吡啶钌标记影响，对于容易受三联吡啶钌标记影响的这部分抗体，二硫苏糖醇可以显著改善三联吡啶钌标记对其的影响，提高这些抗体的稳定性；对于不受三联吡啶钌标记影响的这部分抗体，二硫苏糖醇对其也无负面影响。
在一些实施例中，检测试剂还包含缓冲液。可选地，缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液和MOPSO缓冲液中的至少一种。进一步地，缓冲液的浓度为0.01mmol/L～0.5mmol/L。在一个可选地具体示例中，在检测试剂中，HEPES缓冲液的中4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的浓度为0.01mmol/L～0.5mmol/L。更进一步地，缓冲液的浓度为0.1mmol/L～0.4mmol/L。在一些实施例中，检测试剂包含0.01mmol/L～0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液。在另一些实施例中，检测试剂包含0.01mmol/L～0.5mmol/L的Tris缓冲液。在另一些实施例中，检测试剂包含0.01mmol/L～0.5mmol/L的MOPSO缓冲液。
在一些实施例中，检测试剂还包含无机盐。在一个可选地具体示例中，无机盐包括氯化钠和氯化钾中的一种或两种。可选地，检测试剂中的无机盐的质量百分含量为0.5％～5％。在一个可选地具体示例中，检测试剂中的无机盐的质量百分含量为0.5％、1％、1.5％、2％、3％或5％。进一步地，检测试剂中的无机盐的质量百分含量为1％～3％。更进一步地，检测试剂中的无机盐的质量百分含量为1％～2％。
在一些实施例中，检测试剂还包含表面活性剂。可选地，检测试剂中的表面活性剂包括十二烷基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween-80)和月桂醇聚氧乙烯醚中的一种或多种。可选地，检测试剂中的表面活性剂的质量百分含量为0.2％～3％。在一个可选地具体示例中，检测试剂中的表面活性剂的质量百分含量为0.2％、0.3％、0.5％、1％、2％或2.5％。进一步地，检测试剂中的表面活性剂的质量百分含量为0.2％～1.5％。更进一步地，地，检测试剂中的表面活性剂的质量百分含量为0.2％～1％。
在一些实施例中，检测试剂还包含保护剂。可选地，检测试剂中的保护剂为酪蛋白、酪蛋白酸钠、琥珀酸酪蛋白、重组酪蛋白酸钠和重组琥珀酸酪蛋白的一种或多种。在一些实施例中，检测试剂中的保护剂的质量百分含量为0.05％～2％。在一个可选地具体示例中，检测试剂中的保护剂的质量百分含量为0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％。进一步地，检测试剂中的保护剂的质量百分含量为0.05％％～1％。更进一步地，测试剂中的保护剂的质量百分含量为0.05％％～0.5％。
在一些实施例中，检测试剂还包含无机盐、表面活性剂和保护剂。
在一些实施例中，在检测试剂中，无机盐的质量百分含量为0.5％～5％，表面活性剂的质量百分含量为0.2％～3％，保护剂的质量百分含量为0.05％～2％。进一步地，在检测试剂中，无机盐的质量百分含量为1％～3％，表面活性剂的质量百分含量为0.2％～1.5％，保护剂的质量百分含量为0.05％％～1％。更进一步地，在检测试剂中，无机盐的质量百分含量为1％～2％，表面活性剂的质量百分含量为0.2％～1％，保护剂的质量百分含量为0.05％％～0.5％。
在一些实施例中，检测试剂的pH为6.3～7。在一个可选地具体示例中，检测试剂的pH为6.3、6.5或6.8。进一步地，检测试剂的pH为6.3～6.8。
在一些实施例中，上述任一实施例的检测试剂还含有防腐剂。可选地，防腐剂选自proclin 300和叠氮钠中的至少一种。可选地，在检测试剂中，防腐剂的质量百分含量为0.01％～0.5％。进一步地，在检测试剂中，防腐剂的质量百分含量为0.01％～0.4％。
在一些实施例中，上述任一实施例的检测试剂还含有牛血清白蛋白(BSA)。可选地，在检测试剂中，牛血清白蛋白的质量百分含量为1％～3％。在一个可选地具体示例中，检测试剂中的牛血清白蛋白的质量百分含量为1％、1.5％、2％、2.5％或3％。进一步地，检测试剂中的牛血清白蛋白的质量百分含量为1.5％～2.5％。
在一些实施例中，上述任一实施例的检测试剂还含有牛血清。可选地，牛血清为胎牛血清和小牛血清中的一种或两种。可选地，在检测试剂中，牛血清的质量百分含量为1％～5％。在一个可选地具体示例中，检测试剂中的牛血清的质量百分含量为1％、2％、3％、4％或5％。进一步地，检测试剂中的牛血清白蛋白的质量百分含量为1％～4％。更进一步地，检测试剂中的牛血清白蛋白的质量百分含量为1％～3％。
在一些实施例中，上述任一实施例的检测试剂还含有蔗糖。可选地，在检测试剂中，蔗糖的质量百分含量为0.5％～5％。在一个可选地具体示例中，检测试剂中的牛血清的质量百分含量为0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。进一步地，检测试剂中的牛血清白蛋白的质量百分含量为0.5％～4％。更进一步地，检测试剂中的牛血清白蛋白的质量百分含量为1％～3％。
此外，基于上述，本申请一实施方式还提供了一种基于电化学发光免疫分析的产品。具体地，基于电化学发光免疫分析的产品包括上述任一实施例的检测试剂。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.制备基础试剂：基础试剂由氯化钠、Triton X-100、酪蛋白、proclin 300、BSA、小牛血清、蔗糖和PBS缓冲液的组成，其中：氯化钠的质量百分含量为1％，Triton X-100的质量百分含量为0.5％，酪蛋白的质量百分含量为0.1％，proclin 300的质量百分含量为0.2％，BSA的质量百分含量为2％，小牛血清的质量百分含量为2％，蔗糖的质量百分含量为1％，PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L。
2.按照表1，采用步骤1制备的基础试剂制备含有三联吡啶钌标记抗体的检测试剂。在表1中，抗体一为江苏三联生物工程股份有限公司的甲胎蛋白(AFP)抗体(抗体克隆号A0032，标记三联吡啶钌)，抗体二为江苏三联生物工程股份有限公司的癌胚抗原(CEA)的抗体(抗体克隆号C0053，标记三联吡啶钌)，抗体三为江苏三联生物工程股份有限公司的神经元烯醇化酶(NSE)抗体(抗体克隆号N0027，标记三联吡啶钌)；以上抗体都为鼠抗。半衰期的测试方法为用上记抗体配制成检测试剂，其检测信号降低一半所需的时间为其半衰期；“ppm”是指质量百分含量，1ppm＝0.0001％。
表1
由表1可知，抗体一和抗体二经三联吡啶钌标记后，如果不添加二硫苏糖醇，其抗体的半衰期只有十天左右，稳定性明显降低，而在添加二硫苏糖醇后，经三联吡啶钌标记的抗体一和抗体二的半衰期明显提高。并且，由抗体三可知，对于对三联吡啶钌标记不敏感的抗体，二硫苏糖醇对其稳定性没有明显的影响。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂，所述检测试剂包括抗体和二硫苏糖醇，在所述检测试剂中，所述二硫苏糖醇的质量百分含量为0.001%~0.01%；所述抗体对三联吡啶钌标记敏感且标记有三联吡啶钌，二硫苏糖醇可以显著改善三联吡啶钌标记对抗体的影响，提高抗体的稳定性。
2.根据权利要求1所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，所述三联吡啶钌标记抗体包括三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体和三联吡啶钌标记的癌胚抗原抗体中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂还包含缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液和MOPSO缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求1~3任一项所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂还包含无机盐、表面活性剂和保护剂中的一种或多种，所述无机盐包括氯化钠和氯化钾中的一种或两种，所述表面活性剂包括吐温80、吐温20和Triton X-100中的一种或多种，所述保护剂包括酪蛋白、酪蛋白酸钠、琥珀酸酪蛋白、重组酪蛋白酸钠和重组琥珀酸酪蛋白的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，在所述检测试剂中，所述无机盐的质量百分含量为0.5%~5%，所述表面活性剂的质量百分含量为0.2%~3%，所述保护剂的质量百分含量为0.05%~2%。
6.根据权利要求1~3和5中任一项所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂还包括质量百分含量为1%~3%的牛血清白蛋白。
7.根据权利要求6所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂还包括质量百分含量为1%~5%的牛血清。
8.根据权利要求1~3、5和7中任一项所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂还包括防腐剂，防腐剂选自proclin 300和叠氮钠中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的二硫苏糖醇在制备基于电化学发光免疫分析的产品中的应用，其特征在于，在所述检测试剂中，所述防腐剂的质量百分含量为0.05%~0.5%。
10.根据权利要求1~9任一项所述的应用制备的基于电化学发光免疫分析的产品。
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