CN111521804A - 一种处理剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测技术领域的一种处理剂及其应用。所述处理剂包括：5wt％‑15wt％尿素；1v％‑5v％正丁醇；0.5wt％‑2wt％离子型表面活性剂；0.1v％‑2v％非离子型表面活性剂；5wt％‑15wt％金属盐。本发明所述处理剂能够裂解HCV病毒并变性核心抗原，使得HCV核心抗原表位暴露，提高HCV核心抗原的检测灵敏度，进而缩短HCV检测窗口期。另外，本发明所述处理剂还能解离低亲和力抗体，进而降低了早期体内低亲和力抗体的干扰。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种处理剂及其应用。
背景技术
在机体感染病原体时，如丙型肝炎病毒(HCV)，抗原是先于抗体出现感染性标志物之一，抗原的检测作为一种病原体存在的最直接、最早期的证据而应用于血清学检查，但由于检出率较低，临床上通常以检测抗体作为感染的标志。病原体感染机体后，抗体的出现仍有一段时间，在此窗口期检测抗体则出现漏检，而抗原则可以检出。但当血清中大量抗体出现后，与抗原结合形成抗原抗体复合物，使抗原的检测敏感性显著降低。
目前，国内常用的HCV检测试剂盒为抗体检测试剂盒，虽然HCV抗体检测技术的敏感性和特异性已经很高，但在HCV感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约40～70天的较长时期(平均66天)，称为感染后血清阳转前的窗口期，此时，HCV抗体检测试剂盒无法检出。
由于在HCV感染后6～15天(平均11天)HCV RNA就在感染者血液中出现，并在血清阳转之前达到一个较高的水平。为了降低窗口期感染的危险，缩短窗口期，以实现HCV感染的早期检测，许多国家引入敏感性很高的核酸检测技术。但是核酸检测技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、试剂比较昂贵以及容易交叉污染导致假阳性偏高。
HCV核心抗原也是在HCV感染者体内出现的早期感染的标志，几乎与HCV RNA同时出现。然而，一旦HCV感染者体内产生抗体发生血清阳转，抗核心抗原抗体与HCVcAg之间便可形成抗原抗体复合物，其检测敏感性会显著降低。
因此，亟需建立一种可缩短HCV检测窗口期的方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足提供一种处理剂，该处理剂能够裂解HCV病毒并变性核心抗原，使得HCV核心抗原表位暴露，提高HCV核心抗原的检测灵敏度，进而缩短HCV检测窗口期。
为此，本发明第一方面提供了一种处理剂，其包括：
在本发明的一些实施方式中，所述尿素的浓度为8wt％-12wt％；和/或，所述正丁醇的浓度为2v％-4v％，优选为2.5v％-3.5v％；和/或，所述离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％-1wt％，优选为0.6wt％-0.8wt％；和/或，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％-1.5v％，优选为0.8v％-1.2v％；和/或，所述金属盐的浓度为0.8wt％-1.2wt％，优选为0.8wt％-1.0wt％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)和/或十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
在本发明的一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂选自吐温20、tritonx-100或tritonx-114；优选地，所述非离子型表面活性剂为tritonx-114。
在本发明另一些实施方式中，所述金属盐选自氯化钠或氯化钾；优选地，所述金属盐选自氯化钠。
在本发明的一些实施方式中，所述处理剂还包括作为溶剂的缓冲液；优选地，所述缓冲液为0.01-0.1M的磷酸缓冲液。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的处理剂在HCV抗原检测中的应用。
本发明第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的处理剂在HCV抗原均相免疫检测中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述处理剂与待测样本混合后，再与HCV均相免疫检测中的试剂R1、R2混合。
在本发明的另一些实施方式中，所述处理剂与待测样本及HCV均相免疫检测的试剂R1、R2同时混合。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂R1为包含与第一抗体结合的受体溶液，所述受体能够在激发状态下生成活性氧；所述试剂R2为包含与生物素结合的第二抗体；
其中，所述第一抗体与第二抗体与HCV核心抗原的不同表位结合。
在本发明的另一些实施方式中，所述处理剂与待测样本的体积比为1:(0.5-2)；优选为1:(0.5-1.5)。
本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面所述的处理剂在体外诊断试剂中的应用。
本发明第五方面提供了一种包括如本发明第一方面所述处理剂的HCV抗原检测的试剂盒。
本发明第六方面提供了一种包括如本发明第一方面所述处理剂的HCV抗原抗体联检的试剂盒。
本发明的有益效果为：本发明所述处理剂能够裂解HCV病毒并变性核心抗原，使得HCV核心抗原表位暴露，提高HCV核心抗原的检测灵敏度，进而缩短HCV检测窗口期。另外，本发明所述处理剂还能解离低亲和力抗体，进而降低了早期体内低亲和力抗体的干扰。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“离子型表面活性剂”，又称离子型乳化剂。可以形成胶束的一类物质，其分子总是同时含有亲水基团和亲油基团，且其亲水基团为离子型基团。
本发明所述用语“非离子型表面活性剂”是一种在水溶液中不产生离子的表面活性剂。它在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团。
本发明所述用语“磷酸缓冲液(PB，Phosphate Buffer)”，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，通常使用的有磷酸钠缓冲液(NaH2PO4和Na2HPO4)和磷酸钾缓冲液(K2HPO4和KH2PO4)，由于它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广。
本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。
本发明所述用语“待检样本”是指可能含有被分析物的一种混合物。可以被用在本发明公开的方法中的典型待检样本包括体液，如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液等。
本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。所述抗原可以为融合抗原，且在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
在任何需要的情况下，本发明中所用的任何试剂，包括抗原、抗体、受体或供体，可以根据实际需要缀合生物素-亲和素特异性结合配对成员中的任一员。
本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称，主要为一种激发态的氧分子，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O2)等。
本发明所述用语“供体”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明的一些实施方式中，所述供体为供体微球，其通过功能基团被包被在基体上形成填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧，此时供体微球也可以称为供氧微球或感光微球。所述供体微球表面可以有亲水性的醛基葡聚糖，内部填充有光敏剂。所述供体微球表面还可以填充其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。
本发明所述用语“受体”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的化合物。供体被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的受体俘获，从而传递能量以激活所述受体。在本发明的一些实施方式中，所述受体为受体微球，其通过功能基团填充于基质中形成填充有发光组合物的高分子微粒，所述发光组合物包含有能够与活性氧发生反应的化学发光化合物。在本发明的一些具体实施例中，所述化学发光化合物，其经历与活性氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。
本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中，表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团，例如但不限于：氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中，表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。
Ⅱ.具体实施方案
下面将更详细地说明本发明。
本发明第一方面所涉及的处理剂，其包括：
本发明处理剂中的尿素用于解离低亲和力的抗体，正丁醇和非离子型表面活性剂用于HCV病毒裂解，离子型表面活性剂和金属盐用于变性HCV核心抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述尿素的浓度为8wt％-12wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述尿素的浓度可以为8wt％、9wt％、10wt％、11wt％和12wt％。
在本发明的另一些实施方式中，所述正丁醇的浓度为2v％-4v％，优选为2.5v％-3.5v％。在本发明的一些具体实施例中，所述正丁醇的浓度可以为2v％、2.5v％、3v％、3.5v％和4v％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％-1wt％，优选为0.6wt％-0.8wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.75wt％、0.8wt％、0.9wt％和1wt％。
在本发明的另一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％-1.5v％，优选为0.8v％-1.2v％。在本发明的一些具体实施方式中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％、0.8v％、1.0v％、1.2v％和1.5v％。
在本发明的一些实施方式中，所述金属盐的浓度为0.8wt％-1.2wt％，优选为0.8wt％-1.0wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述金属盐的浓度为0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％和1.2wt％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)和/或十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
在本发明的一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂选自吐温20、tritonx-100或tritonx-114；优选地，所述非离子型表面活性剂为tritonx-114。
在本发明另一些实施方式中，所述金属盐选自氯化钠或氯化钾；优选地，所述金属盐选自氯化钠。
本申请的发明人通过研究发现，在CTAB存在的条件下，大幅度提高处理剂中氯化钠的使用浓度，可以明显提高阴性样本和阳性样本的区分度。
在本发明的一些实施方式中，所述处理剂还包括作为溶剂的缓冲液；优选地，所述缓冲液为0.01-0.1M的磷酸缓冲液。
本发明第二方面涉及一种如本发明第一方面所述的处理剂在HCV抗原检测中的应用。
本发明第三方面涉及一种如本发明第二方面所述的处理剂在HCV抗原均相免疫检测中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述处理剂与待测样本混合后，再与HCV均相免疫检测中的试剂R1、R2混合。
在本发明的另一些实施方式中，所述处理剂与待测样本及HCV均相免疫检测的试剂R1、R2同时混合。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂R1为包含与第一抗体结合的受体溶液，所述受体能够在激发状态下生成活性氧；所述试剂R2为包含与生物素结合的第二抗体；
其中，所述第一抗体与第二抗体与HCV核心抗原的不同表位结合。
在本发明的另一些实施方式中，所述处理剂与待测样本的体积比为1:(0.5-2)；优选为1:(0.5-1.5)。在本发明的一些具体实施方式中，所述处理剂与待测样本的体积比为1:0.5、1:1和1:1.5。
本发明第四方面涉及一种如本发明第一方面所述的处理剂在体外诊断试剂中的应用。
本发明第五方面涉及一种包括如本发明第一方面所述处理剂的HCV抗原检测的试剂盒。
本发明第六方面涉及一种包括如本发明第一方面所述处理剂的HCV抗原抗体联检的试剂盒。
Ⅲ.具体实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
下述实施例中的检测结果均为使用LITA HT进行检测的结果。
下述实施例中处理剂用于对HCV Ag/Ab联合检测中抗原孔的待测样本进行处理，抗原孔中其他组分有FG-HCV-Ab1和Bio-HCV-Ab2(两株针对HCV核心抗原不同表位的单抗，一株单抗与受体结合，另一株单抗与生物素结合)。处理剂的使用方法有两种，分别为：
使用方法1：
1)将处理剂与待测样本按体积比1:1混合，37℃温育30min，获得处理后的待测样本；
2)取25ul处理后的待测样本加入至微孔板中，然后再加入25ul FG-HCV-Ab1溶液和25ul Bio-HCV-Ab2溶液，37℃温育15min后加入175ul SA-GG溶液，37℃温育10min，读数。
使用方法2：
1)向微孔板中分别加入25ul处理剂、25ul待测样本，25ul FG-HCV-Ab1溶液和25ulBio-HCV-AB2溶液，37℃温育15min；
2)再加入175ul SA-GG溶液，37℃温育10min，读数。
实施例1：处理剂中不同浓度NaCl对HCV抗原检测灵敏度的影响
(1)采用的处理剂中包括：10wt％的尿素、3v％的正丁醇、1v％的Triton X-114、0.75wt％的CTAB以及NaCl；其中NaCl的浓度如表1所示。
(2)实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为100ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表1。
表1
从表1可知，处理剂中随着氯化钠浓度的增加，检测结果中阳性与阴性信号值比值大幅度增加。说明提高氯化钠浓度有助于提高抗原检测的灵敏度。
实施例2：处理剂中CTAB/Triton X-114对HCV抗原检测灵敏度的影响
1)采用使用方法2进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为100ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为磷酸缓冲液稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表2。
表2
从表2可知，加入表面活性剂后，阳性与阴性信号值比值大幅度增加，尤其是CTAB，增加效果非常明显，说明增加表面活性剂能够提高抗原检测的灵敏度。可能的原因是CTAB会与蛋白结合，改变核心抗原的构象，使得与所选抗体结合的表位暴露。
实施例3：处理剂中正丁醇对HCV抗原检测灵敏度的影响
采用的处理剂如下：
实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为25ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表3。
表3
从表3可知，加入正丁醇后抗原检测的灵敏度(阳性值/阴性值)提高，且正丁醇最优浓度为3v％。
实施例4：处理剂中离子型表面活性剂对HCV抗原检测灵敏度的影响
采用的处理剂如下：
实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为25ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表4。
表4
从表4可知，离子型表面活性剂CTAB的解离效果优于TTAB和DTAB，可能是因为TTAB和DTAB的烷基数较CTAB少，其变构抗原的能力弱于CTAB。
实施例5：处理剂中金属盐对HCV抗原检测灵敏度的影响
采用的处理剂如下：
实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为25ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表5。
表5
从表5可知，将处理剂中9wt％的NaCl更换为9wt％的KCl后，其检测重组抗原的灵敏度下降，考虑到KCl的分子量大于NaCl，为防止这种下降是因盐离子的摩尔浓度偏低导致，故同时使用处理剂C(11.5wt％KCl，摩尔浓度约等于9wt％NaCl)作为对照。上述结果可知，即使增加KCl使用量，其检测重组抗原的灵敏度也没有提高。因此NaCl对提高HCV抗原检测灵敏度的效果优于KCl。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (15)
1.一种处理剂，其包括：
2.根据权利要求1所述的处理剂，其特征在于，所述尿素的浓度为8wt％-12wt％；和/或，所述正丁醇的浓度为2v％-4v％，优选为2.5v％-3.5v％；和/或，所述离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％-1wt％，优选为0.6wt％-0.8wt％；和/或，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％-1.5v％，优选为0.8v％-1.2v％；和/或，所述金属盐的浓度为0.8wt％-1.2wt％，优选为0.8wt％-1.0wt％。
3.根据权利要求1或2所述的处理剂，其特征在于，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、十四烷基三甲基溴化铵和/或十二烷基三甲基溴化铵；优选地，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵和/或十四烷基三甲基溴化铵；进一步优选地，所述离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的处理剂，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自吐温20、tritonx-100或tritonx-114；优选地，所述非离子型表面活性剂为tritonx-114。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的处理剂，其特征在于，所述金属盐选自氯化钠或氯化钾；优选地，所述金属盐选自氯化钠。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的处理剂，其特征在于，所述处理剂还包括作为溶剂的缓冲液；优选地，所述缓冲液为0.01-0.1M的磷酸缓冲液。
7.一种如权利要求1-6中任意一项所述的处理剂在HCV抗原检测中的应用。
8.一种如权利要求1-6中任意一项所述的处理剂在HCV抗原均相免疫检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述处理剂与待测样本混合后，再与HCV均相免疫检测中的试剂R1、R2混合。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述处理剂与待测样本及HCV均相免疫检测的试剂R1、R2同时混合。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述试剂R1为包含与第一抗体结合的受体溶液，所述受体能够在激发状态下生成活性氧；所述试剂R2为包含与生物素结合的第二抗体；
其中，所述第一抗体与第二抗体与HCV核心抗原的不同表位结合。
12.根据权利要求9-11中任意一项所述的应用，其特征在于，所述处理剂与待测样本的体积比为1:(0.5-2)；优选为1:(0.5-1.5)。
13.一种如权利要求1-6中任意一项所述的处理剂在体外诊断试剂中的应用。
14.一种包括如权利要求1-6中任意一项所述处理剂的HCV抗原检测的试剂盒。
15.一种包括如权利要求1-6中任意一项所述处理剂的HCV抗原抗体联检的试剂盒。
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| CN111521804B (zh) | 2024-01-19 |
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