CN111521780B - 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测技术领域的一种丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒及其应用。该剂盒包括如下组分：与第一抗原结合的受体；第二抗原；所述第一抗原和第二抗原能够与丙型肝炎病毒抗体的可变区特异性结合；与第一抗体结合的受体；第二抗体；所述第一抗体和第二抗体能够与丙型肝炎病毒抗原的不同表位特异性结合。本发明所述HCV抗原抗体联检的试剂盒，能够对HCV核心抗原与抗体进行联合检测，进而缩短检测窗口期，且检测成本低。另外，所述试剂盒中还包括处理剂，该处理剂能够降低早期体内低亲和力抗体的干扰，提高转换期抗原检测灵敏度，进而提高了HCV的检测灵敏度，进一步缩短HCV检测窗口期。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒及其应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)为嗜肝性慢性病毒，患者感染HCV后临床症状不明显，不易被发现。HCV感染的慢性化发生率较高，容易较早出现肝硬化、肝癌。目前，国内常用的丙型肝炎病毒(HCV)检测试剂盒为抗体检测试剂盒，虽然HCV抗体检测技术的敏感性和特异性已经很高，但在HCV感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约40～70天的较长时期(平均66天)，称为感染后血清阳转前的窗口期，此时，HCV抗体检测试剂盒无法检出。
由于在HCV感染后6～15天(平均11天)HCV RNA就在感染者血液中出现，并在血清阳转之前达到一个较高的水平。为了降低窗口期感染的危险，缩短窗口期，以实现HCV感染的早期检测，许多国家引入敏感性很高的核酸检测技术。但是核酸检测技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、试剂比较昂贵以及容易交叉污染导致假阳性偏高。
HCV核心抗原也是在HCV感染者体内出现的早期感染的标志，几乎与HCV RNA同时出现。然而，一旦HCV感染者体内产生抗体发生血清阳转，抗核心抗原抗体与HCVcAg之间便可形成抗原抗体复合物，其检测敏感性会显著降低。
均相免疫测定方法是一种特殊情况下不必分离结合抗原抗体复合物和游离抗体即可进行的测定方法。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。
因此，亟需一种可缩短HCV检测窗口期的HCV检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒，该试剂盒能够对HCV核心抗原与抗体进行联合检测，缩短检测窗口期。
为此，本发明第一方面提供了一种丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒，其包括如下组分：
与第一抗原结合的受体；第二抗原；所述第一抗原和第二抗原能够与丙型肝炎病毒抗体的可变区特异性结合；
与第一抗体结合的受体；第二抗体；所述第一抗体和第二抗体能够与丙型肝炎病毒抗原的不同表位特异性结合。
在本发明的一些实施方式中，所述第二抗原与生物素结合，形成与生物素结合的第二抗原；和/或，所述第二抗体与生物素结合，形成与生物素结合的第二抗体。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一抗原和/或第二抗原为融合抗原；优选地，所述第一抗原和/或第二抗原为HCV核心抗原与NS3抗原的融合抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述丙型肝炎病毒抗原为HCV核心抗原。
在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒还包括处理剂。
在本发明的一些实施方式中，所述处理剂包括：
在本发明的一些优选的实施方式中，所述所述尿素的浓度为8wt％-12wt％；和/或，所述正丁醇的浓度为2v％-4v％，优选为2.5v％-3.5v％；和/或，所述离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％-1wt％，优选为0.6wt％-0.8wt％；和/或，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％-1.5v％，优选为0.8v％-1.2v％；和/或，所述金属盐的浓度为0.8wt％-1.2wt％，优选为0.8wt％-1.0wt％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)和/或十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)；优选地，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)；进一步优选地，所述离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
在本发明的另一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂选自吐温20、tritonx-100或tritonx-114；优选地，所述非离子型表面活性剂为tritonx-114。
在本发明的一些实施方式中，所述金属盐选自氯化钠或氯化钾；优选地，所述金属盐选自氯化钠。
在本发明的另一些实施方式中，所述处理剂还包括作为溶剂的缓冲液；优选地，所述缓冲液为0.01-0.1M的磷酸缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括供体；优选地，所述供体与亲和素结合，形成与亲和素结合的供体。
在本发明的一些实施方式中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光组合物和镧系元素的高分子微球。
本发明第二方面提供了一种利用如本发明第一方面所述试剂盒进行丙型肝炎病毒抗原抗体联检的方法，其包括至少两个检测区域，在一个检测区域检测是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗体-受体所形成的第一复合物，而在另一个检测区域检测是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗原-受体所形成的第二复合物；
其中，所述供体能够在激发状态下生成活性氧，所述受体能与活性氧反应产生可检测的化学发光信号。
在本发明的一些实施方式中，所述方法在一个检测区域准备第一组合物，并检测第一组合物中是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗体-受体所形成的第一复合物；
其中，所述第一组合物包含：待测样本；与第一抗原结合的受体；第二抗原；供体；所述第一抗原和第二抗原能够与丙型肝炎病毒抗体的可变区特异性结合。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一抗原和/或第二抗原为融合抗原；优选地，所述第一抗原和/或第二抗原为HCV核心抗原与NS3抗原的融合抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述方法在另一个检测区域准备第二组合物，并检测第二组合物中是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗原-受体所形成的第二复合物；
其中，所述第二组合物包含：待测样本；与第一抗体结合的受体；第二抗体；供体；所述第一抗体和第二抗体能够与丙型肝炎病毒抗原的不同表位特异性结合。
在本发明的一些具体实施方式中，所述丙型肝炎病毒抗原为HCV核心抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述第二抗原与供体通过第一特异性配对成员之间的相互作用相连；所述第二抗体与供体通过第二特异性配对成员之间的相互作用相连；优选地，所述第一特异性配对成员和/或所述二特异性配对成员为生物素-亲和素；进一步优选地，所述第二抗原和第二抗体分别与生物素结合分别形成与生物素结合的第二抗原和生物素结合的第二抗体；所述供体与亲和素结合形成与亲和素结合的供体。
在本发明的另一些实施方式中，当检测区域存在第一复合物和/或第二复合物时，用能量或者活性化合物激发供体产生活性氧，所述受体与活性氧反应生成可检测的化学发光信号。
在本发明的一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
S1，在一个反应区域准备第三组合物，所述第三组合物包含：待测样本、与第一抗原结合的受体以及第二抗原；在另一个反应区域准备第四组合物，所述第四组合物包含：待测样本、与第一抗体结合的受体以及第二抗体；
S2，将包含供体的溶液加入到第三组合物中，获得第一组合物；将包含供体的溶液加入到第四组合物中，获得第二组合物；
S3，将第一组合物和第二组合物分别送到检测区域，然后用能量或者活性化合物接触检测区域，激发供体产生活性氧；当存在第一复合物和/或第二复合物时，所述受体与活性氧反应生成可检测的化学发光信号；
S4，检测所述化学发光信号，判断待测样本中是否存在丙型肝炎病毒抗体和/或丙型肝炎病毒抗原以及丙型肝炎病毒抗体和/或丙型肝炎病毒抗原的浓度。
在本发明的一些实施方式中，所述第三组合物中包含的待测样本在加入第三组合物前预先用稀释液进行稀释，形成稀释的待测样本。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述稀释的待检样本的体积稀释倍数为1:(4-20)，优选为1:(6-16)，更优选为1:(8-14)。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，将包含与第一抗原结合的受体的溶液和包含第二抗原的溶液各自加入到反应区域，进而与待测样本形成第二组合物。
在本发明的一些实施方式中，所述第四组合物中的待测样本在加入第四组合物前预先处理剂进行处理，形成处理后的待测样本。
在本发明的另一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。
在本发明的一些实施方式中，计算第一复合物的化学发光信号值与HCV抗体阳性样本的临界值的比值，获得抗体孔S/CO值，以及计算第二复合物的化学发光信号值与HCV核心抗原阳性样本的临界值的比值，获得抗原孔S/CO值，然后输出抗体孔S/CO值和抗原孔S/CO值中较大的数值；若输出的数值≥1，则待测样本为阳性样本，若输出的数值＜1，则待测样本为阴性样本。
本发明的有益效果为：本发明所述HCV抗原抗体联检的试剂盒，能够对HCV核心抗原与抗体进行联合检测，进而缩短检测窗口期，且检测成本低。另外，所述试剂盒中还包括处理剂，该处理剂能够降低早期体内低亲和力抗体的干扰，提高转换期抗原检测灵敏度，进而提高了HCV的检测灵敏度，进一步缩短HCV检测窗口期。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。
本发明所述用语“待检样本”是指可能含有被分析物的一种混合物。可以被用在本发明公开的方法中的典型待检样本包括体液，如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液等。
本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。所述抗原可以为融合抗原，且在任何需要的情况下，抗原可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
本发明所述用语“特异性结合配对成员”是指这样一对分子，它们能够相互特异性结合，例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性结合配对成员对的例子是生物素-亲和素系统，其中“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而“亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。“亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。
在任何需要的情况下，本发明中所用的任何试剂，包括抗原、抗体、受体或供体，可以根据实际需要缀合生物素-亲和素特异性结合配对成员中的任一员。
本发明所述用语“检测区域”是指能够提供检测本发明所述复合物以及其他免疫反应的结果的区域，例如可以是化学发光检测仪中提供光学检测的部位。同一个化学发光检测仪中的光学检测部位可以根据实际需要区分为一个或多个检测区域。
本发明所述用语“反应区域”是指化学反应或免疫反应发生的场所。本发明所述“反应区域”同所述“检测区域”可以是同一个位置，也可以是不同的位置。
本发明所述“检测区域”以及“反应区域”的尺寸和形状包括各种大小、各种形状的任何可以实现的几何结构，例如：试管、微孔板。
本发明所述“检测区域”以及“反应区域”的数量也不限于两个，它们均可以根据实际需要设置相应的多个检测区域和/或反应区域以同时对多个待检样本进行检测。
本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称，主要为一种激发态的氧分子，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O2)等。
本发明所述用语“供体”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明的一些实施方式中，所述供体为供体微球，其通过功能基团被包被在基体上形成填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧，此时感光微球也可以称为供氧微球或感光微球。所述供体微球表面可以有亲水性的醛基葡聚糖，内部填充有光敏剂。所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、和酞菁等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。所述供体微球表面还可以填充其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些供体的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放活性氧，例如单线态氧。
本发明所述用语“受体”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的化合物。供体被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的受体俘获，从而传递能量以激活所述受体。在本发明的一些实施方式中，所述受体为受体微球，其通过功能基团填充于基质中形成填充有发光组合物的高分子微粒，所述发光组合物包含有能够与活性氧发生反应的化学发光化合物。在本发明的一些具体实施例中，所述化学发光化合物，其经历与活性氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。这些物质的典型例子包括但不限于：烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烷基吖啶满、芳基乙醚烯、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳基咪唑或光泽精。
本发明中，所述“化学发光化合物”即一种被称作为标记物的化合物，可进行化学反应以便引起发光，比如通过被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。激发态可以是单线态或是三重激发态。激发态可弛豫到基态直接发光，或者是通过将激发能量传递到发射能量受体，从而自身恢复到基态。在此过程中，能量受体微球将被跃迁为激发态而发光。
本发明所述的“基质”其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基质可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述基质可以是固体(如聚合物、金属、玻璃、有机和无机物诸如矿物、盐和硅藻)、小油滴(如碳氢化合物、碳氟化合物、硅质流体)、囊泡(如合成的诸如磷脂、或天然的诸如细胞、及细胞器官)。基质可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。基质通常具有多功能性，或者能够通过特异或非特异的共价或非共价相互作用而结合到供体或受体上。有许多官能团是可用的或者将其合并进来。典型的官能团包括羧酸、乙醛、氨基、氰基、乙烯基、羟基、巯基等。适用于本发明的基质的一个非限制性的例子是羧基聚苯乙烯乳胶微球。
本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中，表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团，例如但不限于：氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中，表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。
Ⅱ.具体实施方案
下面将更详细地说明本发明。
本申请的发明人通过在两个检测区域对HCV的核心抗原和抗体进行联合检测，在其中一个检测区域进行HCV抗体的检测，同时在另一个检测区域进行HCV核心抗原的检测，缩短了HCV检测的窗口期。另外，本申请的发明人通过在HCV抗体的检测区域内加入稀释后的待检样本，进而降低了抗体在待检液中的浓度，解决了高浓度HCV抗体样本的HOOK效应问题；同时，在HCV核心抗原的检测区域内加入未经稀释的待检样本，不降低HCV核心抗原在待检液中的浓度，避免带来低浓度HCV核心抗原样本检测灵敏度偏低的问题。同时在HCV核心抗原的检测区域内添加处理剂，降低了早期体内低亲和力抗体的干扰，从而提高转换期HCV核心抗原检测灵敏度，进而提高了本发明所述方法对HCV的检测灵敏度。本发明正是基于上述方法作出的。
为此，本发明第一方面所涉及的丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒，其包括如下组分：
与第一抗原结合的受体；第二抗原；所述第一抗原和第二抗原能够与丙型肝炎病毒抗体的可变区特异性结合；
与第一抗体结合的受体；第二抗体；所述第一抗体和第二抗体能够与丙型肝炎病毒抗原的不同表位特异性结合。
在本发明的一些实施方式中，所述第二抗原与生物素结合，形成与生物素结合的第二抗原；和/或，所述第二抗体与生物素结合，形成与生物素结合的第二抗体。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一抗原和/或第二抗原为融合抗原；优选地，所述第一抗原和/或第二抗原为HCV核心抗原与NS3抗原的融合抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述丙型肝炎病毒抗原为HCV核心抗原。
在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒还包括处理剂。
在本发明的一些实施方式中，所述处理剂包括：
本发明处理剂中的尿素用于解离低亲和力的抗体，正丁醇和非离子型表面活性剂用于HCV病毒裂解，离子型表面活性剂和金属盐用于变性HCV核心抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述尿素的浓度为8wt％-12wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述尿素的浓度可以为8wt％、9wt％、10wt％、11wt％和12wt％。
在本发明的另一些实施方式中，所述正丁醇的浓度为2v％-4v％，优选为2.5v％-3.5v％。在本发明的一些具体实施例中，所述正丁醇的浓度可以为2v％、2.5v％、3v％、3.5v％和4v％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％-1wt％，优选为0.6wt％-0.8wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.75wt％、0.8wt％、0.9wt％和1wt％。
在本发明的另一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％-1.5v％，优选为0.8v％-1.2v％。在本发明的一些具体实施方式中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％、0.8v％、1.0v％、1.2v％和1.5v％。
在本发明的一些实施方式中，所述金属盐的浓度为0.8wt％-1.2wt％，优选为0.8wt％-1.0wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述金属盐的浓度为0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％和1.2wt％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)和/或十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)；优选地，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)；进一步优选地，所述离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
在本发明的另一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂选自吐温20、tritonx-100或tritonx-114；优选地，所述非离子型表面活性剂为tritonx-114。
在本发明的一些实施方式中，所述金属盐选自氯化钠或氯化钾；优选地，所述金属盐选自氯化钠。
本申请的发明人通过研究发现，在CTAB存在的条件下，大幅度提高处理剂中氯化钠的使用浓度，可以明显提高阴性样本和阳性样本的区分度。
在本发明的另一些实施方式中，所述处理剂还包括作为溶剂的缓冲液；优选地，所述缓冲液为0.01-0.1M的磷酸缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括供体；优选地，所述供体与亲和素结合，形成与亲和素结合的供体。
在本发明的一些实施方式中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光组合物和镧系元素的高分子微球。
本发明第二方面涉及一种利用如本发明第一方面所述试剂盒进行丙型肝炎病毒抗原抗体联检的方法，其包括至少两个检测区域，在一个检测区域检测是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗体-受体所形成的第一复合物，而在另一个检测区域检测是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗原-受体所形成的第二复合物；
其中，所述供体能够在激发状态下生成活性氧，所述受体能与活性氧反应产生可检测的化学发光信号。
在本发明的一些实施方式中，所述方法在一个检测区域准备第一组合物，并检测第一组合物中是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗体-受体所形成的第一复合物；
其中，所述第一组合物包含：待测样本；与第一抗原结合的受体；第二抗原；供体；所述第一抗原和第二抗原能够与丙型肝炎病毒抗体的可变区特异性结合。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一抗原和/或第二抗原为融合抗原；优选地，所述第一抗原和/或第二抗原为HCV核心抗原与NS3抗原的融合抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述方法在另一个检测区域准备第二组合物，并检测第二组合物中是否存在由供体-丙型肝炎病毒抗原-受体所形成的第二复合物；
其中，所述第二组合物包含：待测样本；与第一抗体结合的受体；第二抗体；供体；所述第一抗体和第二抗体能够与丙型肝炎病毒抗原的不同表位特异性结合。
在本发明的一些具体实施方式中，所述丙型肝炎病毒抗原为HCV核心抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述第二抗原与供体通过第一特异性配对成员之间的相互作用相连；所述第二抗体与供体通过第二特异性配对成员之间的相互作用相连；优选地，所述第一特异性配对成员和/或所述二特异性配对成员为生物素-亲和素；进一步优选地，所述第二抗原和第二抗体分别与生物素结合分别形成与生物素结合的第二抗原和生物素结合的第二抗体；所述供体与亲和素结合形成与亲和素结合的供体。
在本发明的另一些实施方式中，当检测区域存在第一复合物和/或第二复合物时，用能量或者活性化合物激发供体产生活性氧，所述受体与活性氧反应生成可检测的化学发光信号。
在本发明的一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
S1，在一个反应区域准备第三组合物，所述第三组合物包含：待测样本、与第一抗原结合的受体以及第二抗原；在另一个反应区域准备第四组合物，所述第四组合物包含：待测样本、与第一抗体结合的受体以及第二抗体；
S2，将包含供体的溶液加入到第三组合物中，获得第一组合物；将包含供体的溶液加入到第四组合物中，获得第二组合物；
S3，将第一组合物和第二组合物分别送到检测区域，然后用能量或者活性化合物接触检测区域，激发供体产生活性氧；当存在第一复合物和/或第二复合物时，所述受体与活性氧反应生成可检测的化学发光信号；
S4，检测所述化学发光信号，判断待测样本中是否存在丙型肝炎病毒抗体和/或丙型肝炎病毒抗原以及丙型肝炎病毒抗体和/或丙型肝炎病毒抗原的浓度。
本发明所述方法中，所有试剂组合后，均可以根据需要进行混匀和/或温育。具体地，所述温育的温度可以是35-45℃，时间可以是10-20min；优选地，所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃；温育的时间可以选自12min、15min、16min或18min。
在本发明的一些实施方式中，所述第三组合物中包含的待测样本在加入第三组合物前预先用稀释液进行稀释，形成稀释的待测样本。本发明的方法通过在两个检测区域内加入不同的样本量来缓解高浓度抗体样本的HOOK问题和提高低浓度抗原样本的检测灵敏度问题
在本发明的一些优选的实施方式中，所述稀释的待检样本的体积稀释倍数为1:(4-20)，优选为1:(6-16)，更优选为1:(8-14)。在本发明的一些具体实施方式中，所述稀释的待检样本的体积稀释倍数为1:5、1:7、1:9、1:11、1:13、1:15、1:17和1:19。本发明中对用于稀释待检样本的稀释液没有特别限制，一个非限制性的稀释液的例子可以含氯化钠、小牛血清等的PB缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，将包含与第一抗原结合的受体的溶液和包含第二抗原的溶液各自加入到反应区域，进而与待测样本形成第二组合物。
在本发明的一些实施方式中，所述第四组合物中的待测样本在加入第四组合物前预先处理剂进行处理，形成处理后的待测样本。
在本发明的一些实施方式中，所述处理剂包括：
本发明处理剂中的尿素用于解离低亲和力的抗体，正丁醇和非离子型表面活性剂用于HCV病毒裂解，离子型表面活性剂和金属盐用于变性HCV核心抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述尿素的浓度为8wt％-12wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述尿素的浓度可以为8wt％、9wt％、10wt％、11wt％和12wt％。
在本发明的另一些实施方式中，所述正丁醇的浓度为2v％-4v％，优选为2.5v％-3.5v％。在本发明的一些具体实施例中，所述正丁醇的浓度可以为2v％、2.5v％、3v％、3.5v％和4v％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％-1wt％，优选为0.6wt％-0.8wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.75wt％、0.8wt％、0.9wt％和1wt％。
在本发明的另一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％-1.5v％，优选为0.8v％-1.2v％。在本发明的一些具体实施方式中，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v％、0.8v％、1.0v％、1.2v％和1.5v％。
在本发明的一些实施方式中，所述金属盐的浓度为0.8wt％-1.2wt％，优选为0.8wt％-1.0wt％。在本发明的一些具体实施例中，所述金属盐的浓度为0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％和1.2wt％。
在本发明的一些实施方式中，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)和/或十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)；优选地，所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)；进一步优选地，所述离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
在本发明的另一些实施方式中，所述非离子型表面活性剂选自吐温20、tritonx-100或tritonx-114；优选地，所述非离子型表面活性剂为tritonx-114。
在本发明的一些实施方式中，所述金属盐选自氯化钠或氯化钾；优选地，所述金属盐选自氯化钠。
本申请的发明人通过研究发现，在CTAB存在的条件下，大幅度提高处理剂中氯化钠的使用浓度，可以明显提高阴性样本和阳性样本的区分度。
在本发明的另一些实施方式中，所述处理剂还包括作为溶剂的缓冲液；优选地，所述缓冲液为0.01-0.1M的磷酸缓冲液。
在本发明的另一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。
在本发明的一些实施方式中，计算第一复合物的化学发光信号值与HCV抗体阳性样本的临界值的比值，获得抗体孔S/CO值，以及计算第二复合物的化学发光信号值与HCV核心抗原阳性样本的临界值的比值，获得抗原孔S/CO值，然后输出抗体孔S/CO值和抗原孔S/CO值中较大的数值；若输出的数值≥1，则待测样本为阳性样本，若输出的数值＜1，则待测样本为阴性样本。
本发明中，用语“HCV抗体阳性样本的临界值”为标定好的HCV抗体阳性对照品(抗体参考样品)，在相同条件下进行检测时的发光信号值；用语“HCV核心抗原阳性样本的临界值”为标定好的HCV抗原阳性对照品(抗原参考样品)，在相同条件下进行检测时的发光信号值。
Ⅲ.具体实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒的制备
1.受体-HCV抗体1(针对HCV核心抗原的N端表位)的制备
1)抗体处理：将HCV抗体1进行透析，更换为包被缓冲液，并测定蛋白浓度。
2)受体处理：将受体通过离心，超声等过程更换为包被缓冲液；
3)偶联：将处理好的受体及处理后的HCV抗体1混合反应，经还原，封闭等过程后，得到受体-HCV抗体1，使用保存液进行定容并保存。
2.生物素-HCV抗体2(针对HCV核心抗原的C端表位)的制备
1)抗体处理：将HCV抗体2进行透析，更换为标记缓冲液，并测定蛋白浓度。
2)标记反应：将处理好的HCV抗体2与活化生物素混合反应，进行标记。
3)透析：将标记后的生物素-HCV抗体2进行透析，以去除未标记的游离生物素。
4)保存：将透析后的生物素-HCV抗体2测定蛋白浓度，加入甘油后保存。
3.受体-HCV抗原1的制备
1)抗原处理：将HCV抗原1进行透析，更换为包被缓冲液，并测定蛋白浓度。
2)受体处理：将受体通过离心，超声等过程更换为包被缓冲液；
3)偶联：将处理好的受体及处理后的HCV抗原1混合反应，经还原，封闭等过程后，得到受体-HCV抗原1，使用保存液进行定容并保存。
4.生物素-HCV抗原2的制备
1)抗原处理：将HCV抗原2进行透析，更换为标记缓冲液，并测定蛋白浓度。
2)标记反应：将处理好的HCV抗原2与活化生物素混合反应，进行标记。
3)透析：将标记后的生物素-HCV抗原2进行透析，以去除未标记的游离生物素。
4)保存：将透析后的生物素-HCV抗原2测定蛋白浓度，加入甘油后保存。
5.试剂1，试剂2的制备
使用稀释液将偶联抗体或抗原的受体及生物素标记物按比例配制成试剂1和试剂2。分装，贴签，2～8℃保存。
6.试剂3的制备
将所需化学试剂以一定比例混合配制。分装，贴签，2～8℃保存。
7.参考品的制备
将阳性原料或灭活后血清用稀释液以一定比例稀释配制。分装，贴签，2～8℃保存。
8.HCV Ag/Ab质控品的制备
将阳性原料或灭活后血清用稀释液以一定比例稀释配制。分装，贴签，2～8℃保存。
9.组装
将上述半成品进行检测，合格后按试剂盒组成成分进行组装，外加包装盒。
实施例2：试剂盒中处理剂各组分浓度的筛选
下述实施例中的检测结果均为使用LITA HT进行检测的结果。
下述实施例中处理剂用于对HCV Ag/Ab联合检测中抗原孔的待测样本处理，抗原孔中其他组分有FG-HCV-Ab1和Bio-HCV-Ab2(两株针对HCV核心抗原不同表位的单抗，一株单抗与受体结合，另一株单抗与生物素结合)。处理剂的使用方法有两种，分别为：
使用方法1：
1)将处理剂与待测样本按体积比1:1混合，37℃温育30min，获得处理后的待测样本；
2)取25ul处理后的待测样本加入至微孔板中，然后再加入25ulFG-HCV-Ab1溶液和25ulBio-HCV-Ab2溶液，37℃温育15min后加入175ulSA-GG溶液，37℃温育10min，读数。
使用方法2：
1)向微孔板中分别加入25ul处理剂、25ul待测样本，25ulFG-HCV-Ab1溶液和25ulBio-HCV-AB2溶液，37℃温育15min；
2)再加入175ul SA-GG溶液，37℃温育10min，读数。
1.处理剂中不同浓度NaCl对HCV抗原检测灵敏度的影响
(1)采用的处理剂中包括：10wt％的尿素、3v％的正丁醇、1v％的Triton X-114、0.75wt％的CTAB以及NaCl；其中NaCl的浓度如表1所示。
(2)实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为100ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表1。
表1
从表1可知，处理剂中随着氯化钠浓度的增加，检测结果中阳性与阴性信号值比值大幅度增加。说明提高氯化钠浓度有助于提高抗原检测的灵敏度。
2.处理剂中CTAB/Triton X-114对HCV抗原检测灵敏度的影响
1)采用使用方法2进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为100ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为磷酸缓冲液稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表2。
表2
从表2可知，加入表面活性剂后，阳性与阴性信号值比值大幅度增加，尤其是CTAB，增加效果非常明显，说明增加表面活性剂能够提高抗原检测的灵敏度。可能的原因是CTAB会与蛋白结合，改变核心抗原的构象，使得与所选抗体结合的表位暴露。
3.处理剂中正丁醇对HCV抗原检测灵敏度的影响
采用的处理剂如下：
/>
实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为25ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表3。
表3
从表3可知，加入正丁醇后抗原检测的灵敏度(阳性值/阴性值)提高，且正丁醇最优浓度为3v％。
4.处理剂中离子型表面活性剂对HCV抗原检测灵敏度的影响
采用的处理剂如下：
/>
实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为25ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表4。
表4
从表4可知，离子型表面活性剂CTAB的解离效果优于TTAB和DTAB，可能是因为TTAB和DTAB的烷基数较CTAB少，其变构抗原的能力弱于CTAB。
5.处理剂中金属盐对HCV抗原检测灵敏度的影响
采用的处理剂如下：
/>
实验方法：采用使用方法1进行检测，其中采用的FG-HCV-Ab1的浓度为25ug/ml，Bio-HCV-Ab2的浓度为0.5ug/ml，待测样本为阴性血清稀释的HCV重组核心抗原，检测结果见表5。
表5
从表5可知，将处理剂中9wt％的NaCl更换为9wt％的KCl后，其检测重组抗原的灵敏度下降，考虑到KCl的分子量大于NaCl，为防止这种下降是因盐离子的摩尔浓度偏低导致，故同时使用处理剂C(11.5wt％KCl，摩尔浓度约等于9wt％NaCl)作为对照。上述结果可知，即使增加KCl使用量，其检测重组抗原的灵敏度也没有提高。因此NaCl对提高HCV抗原检测灵敏度的效果优于KCl。
实施例3：HCV抗原抗体联检方法的效果
一、采用的试剂盒的主要组分如下：
处理剂：10％尿素、3％正丁醇、1％Triton114、0.75％CTAB和9％氯化钠；
受体-HCV抗体1：实施例1制备的受体-HCV抗体1试剂，且使用发光试剂缓冲液稀释受体-HCV抗体1至50ug/ml；
生物素-HCV抗体2：实施例1制备的生物素-HCV抗体2试剂，且使用生物素缓冲液稀释生物素-HCV抗体2至1ug/ml；
受体-HCV抗原1：实施例1制备的受体-HCV抗原1试剂，且使用发光试剂缓冲液稀释受体-HCV抗原1至30ug/ml；
生物素-HCV抗原2：实施例1制备的生物素-HCV抗原2试剂，且使用生物素缓冲液稀释生物素-HCV抗原2至0.5ug/ml；
样本稀释液：含氯化钠、小牛血清等的PB缓冲液。
二、实验步骤
方案一：
1.取25ul处理剂加入至抗原孔；
2.在抗原孔中加入25ul样本(阴性对照、抗原参考样品或抗原阳性对照)，25ul受体-HCV抗体1和25ul生物素-HCV抗体2；
3.在稀释位加入100ul样本稀释液；
4.在稀释位中加入10ul样本(阴性对照、抗体参考样品或抗体阳性对照)，振荡100秒混匀；
5.取25ul稀释后样本(阴性对照、抗体参考样品或抗体阳性对照)，加入至抗体孔；
6.在抗体孔中加入25ul受体-HCV抗原1和25ul生物素-HCV抗原2；
7.37℃温育15min；
8.抗原孔及抗体孔中分别加入175ul通用液(亲和素-供体)；
9.37℃温育10min；
10.读数，结果见表6。
表6
| 面板号 | 天 | HCV Ag/Ab(LICA)S/CO | Anti-HCV Abbott Architect S/CO |
| 1 | 0 | 0.37 | 0.05 |
| 2 | 7 | 0.38 | 0.04 |
| 3 | 9 | 0.41 | 0.04 |
| 4 | 16 | 0.48 | 0.05 |
| 5 | 19 | 0.36 | 0.04 |
| 6 | 23 | 1.17 | 0.04 |
| 7 | 26 | 11.96 | 0.04 |
| 8 | 30 | 5.01 | 0.04 |
| 9 | 33 | 7.41 | 0.04 |
| 10 | 37 | 7.77 | 0.04 |
| 11 | 41 | 10.04 | 0.04 |
从表6可知，HCV联检试剂检测HCV阳转盘，与仅检测HCV抗体比，窗口期提前至少18天。
方案二：
1.取25ul处理剂及25ul样本(阴性对照、抗原参考样品或抗原阳性对照)加入至预处理管，混匀；
2. 37℃温育30min；
3.在抗原孔中加入25ul处理后样本(阴性对照、抗原参考样品或抗原阳性对照)，25ul受体-HCV抗体1和25ul生物素-HCV抗体2；
4.在稀释位加入100ul样本稀释液；
5.在稀释位中加入10ul样本(阴性对照、抗体参考样品或抗体阳性对照)，振荡100秒混匀；
6.取25ul稀释后样本(阴性对照、抗体参考样品或抗体阳性对照)，加入至抗体孔；
7.在抗体孔中加入25ul受体-HCV抗原1和25ul生物素-HCV抗原2；
8. 37℃温育15min；
9.抗原孔及抗体孔中分别加入175ul通用液(亲和素-供体)；
10. 37℃温育10min；
11.读数，结果见表7。
表7
三、样本阴阳性判别标准
1.抗原孔信号值与抗原参考样品信号值比值为抗原孔的S/CO值；
2.抗体孔信号值与抗体参考样品信号值比值为抗体孔的S/CO值；
3.比较抗原孔S/CO值与抗体孔S/CO值，输出较大的S/CO值作为最终结果S/CO测值；
4.最终结果S/CO测值大于1为阳性，小于1为阴性。
从表7的检测结果可知，检测HCV抗原国家参考品，4份阳性参考品(P1-P4)中有3份可检出。说明采用本发明所述抗原抗体联合检测的方法进行检测的试剂盒的灵敏性较好，并可以缩短HCV检测的窗口期。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (11)
1.一种丙型肝炎病毒抗原抗体联检的试剂盒，其包括如下组分，
供体，能够在激发状态下生成活性氧；
与第一抗原结合的受体；第二抗原；所述第一抗原和第二抗原能够与丙型肝炎病毒抗体的可变区特异性结合；所述第二抗原与供体通过第一特异性配对成员之间的相互作用相连；
与第一抗体结合的受体；第二抗体；所述第一抗体和第二抗体能够与丙型肝炎病毒抗原的不同表位特异性结合；所述第二抗体与供体通过第二特异性配对成员之间的相互作用相连；
所述受体能与活性氧反应产生可检测的化学发光信号；
处理剂，所述处理剂包括尿素、正丁醇、离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和金属盐，其中所述离子型表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵和/或十二烷基三甲基溴化铵，所述非离子型表面活性剂选自tritonx-100或tritonx-114，所述金属盐选自氯化钠或氯化钾；
所述处理剂中各组分浓度为：
尿素 5wt%-15wt%；
正丁醇 1v%-5v%；
离子型表面活性剂 0.5wt%-2wt%；
非离子型表面活性剂 0.1v%-2v%；
金属盐 5wt%-15wt%。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗原与生物素结合，形成与生物素结合的第二抗原；和/或，所述第二抗体与生物素结合，形成与生物素结合的第二抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原和/或第二抗原为融合抗原。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原和/或第二抗原为HCV核心抗原与NS3抗原的融合抗原。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述丙型肝炎病毒抗原为HCV核心抗原。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述尿素的浓度为8wt%-12wt%；和/或，所述正丁醇的浓度为2v%-4v%；和/或，所述离子型表面活性剂的浓度为0.5wt%-1wt%；和/或，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.5v%-1.5v%。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述正丁醇的浓度为2.5v%-3.5v%；和/或，所述离子型表面活性剂的浓度为0.6wt%-0.8wt%；和/或，所述非离子型表面活性剂的浓度为0.8v%-1.2v%。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述处理剂还包括作为溶剂的缓冲液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为0.01-0.1M的磷酸缓冲液。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述供体与亲和素结合，形成与亲和素结合的供体。
11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光组合物和镧系元素的高分子微球。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910105700 | 2019-02-01 | ||
| CN201910105700X | 2019-02-01 |
Publications (2)
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