CN113125417A - 一种受体试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种受体试剂及其应用。本发明提供的受体试剂包含缓冲溶液以及悬浮于其中的受体颗粒，所述受体颗粒能够与活性氧作用产生化学发光，其特征在于，所述受体颗粒的ZETA电位不高于‑10mV，且不低于‑50mV；每毫克受体颗粒的糖含量不高于25微克。本发明提供的受体试剂能够大批量生产、成本低廉、质量合格且性能稳定，能满足灵敏度要求、又能满足线性范围要求；包含该受体试剂的试剂盒具有样品抗干扰能力强、测试性能佳的优点。

Description

一种受体试剂及其应用

技术领域

本发明涉及化学发光检测领域，更具体地，本技术方案涉及一种受体试剂及其应用。

背景技术

免疫分析经过半个多世纪的发展，已经发展出了很多种类。根据测定过程中是否要将待测物质与反应体系分离可以分为非均相(Heterogenous)免疫分析和均相(Homogeneous)免疫分析。非均相免疫分析，是指引入探针进行标记的操作过程中，各种相关试剂混合反应后需要进行分离，将待测物与反应体系分离后再进行检测，是现在免疫分析中的主流方法。如广为人们熟知的酶联免疫吸附法(ELISA法)和磁微粒化学发光法等。均相免疫分析则是指在测定过程中将待测物与反应体系中的相关试剂混合反应后直接测定，而没有多余的分离或清洗的步骤。截止目前，多种灵敏的检测方法被应用于均相免疫分析，比如光学检测方法、电化学检测方法等。

例如，光激化学发光检测(Light Initiated Chemiluminescent Assay，LiCA)就是一种典型的均相免疫分析方法。它是基于两种微球表面包被的抗原或抗体，在液相中形成免疫复合物而将两种微球拉近。在激光的激发下，发生微球之间的单线态氧的转移，进而产生高能级的红光，通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。而当样本不含靶分子时，两种微球间无法形成免疫复合物，两种微球的间距超出单线态氧传播范围，单线态氧在液相中迅速淬灭，检测时则无高能级红光信号产生。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。光激化学发光技术已经在很多检测项目上得到应用。

按照传统光学检测理论知识，均相化学发光检测所用微球的粒径尺寸越均一，利用该微球进行的化学发光检测的性能越好。因此，本领域技术人员都趋于努力获得更均一粒径的单分散体系微球。然而，随着检测行业的进步，对超敏试剂的需求越来越多，不但对灵敏度要求极高，而且检测量程又要求非常宽，现有的均相化学发光检测方法就很难满足上述检测条件。

因此，亟需开发一种能够大批量生产、成本低廉、质量合格、性能稳定，既能满足灵敏度要求、又能满足线性范围要求的受体试剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种受体试剂，该受体试剂能够大批量生产、成本低廉、质量合格且性能稳定，包含该受体试剂的试剂盒具有样品抗干扰能力强、测试性能佳的优点。

为此，本发明第一方面提供了一种受体试剂，其包含缓冲溶液以及悬浮于其中的受体颗粒，所述受体颗粒能够与活性氧作用产生化学发光，其特征在于，所述受体颗粒的ZETA电位不高于-10mV，且不低于-50mV；每毫克受体颗粒的糖含量不高于25微克。

在本发明的一些优选实施方式中，所述受体试剂中受体颗粒的ZETA电位不高于-15mV，且不低于-40mV。

在本发明的一些具体实施例中，所述受体试剂中受体颗粒的ZETA电位选自-10mV、-20mV、-30mV、-40mV、-50mV。

在本发明的一些实施方式中，每毫克所述受体颗粒中的糖含量不高于15微克。

在本发明的一些具体实施例中，每毫克所述受体颗粒中的糖含量可以为3微克、6微克、9微克、12微克、15微克、18微克、21微克、24微克。

在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有生物分子。

在本发明的一些实施方式中所述载体的表面具有键合官能团，其与生物分子键合。

在本发明的一些实施方式中，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基中的至少一种，优选选自醛基和/或羧基。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面具有醛基。所述醛基基团与生物分子上的氨基基团反应形成席夫碱键，从而将生物分子键合到载体的表面。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面具有羧基。所述羧基基团与生物分子上的氨基基团反应形成酰胺键，从而将亲和素分子连接到载体的表面。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面没有包被糖分子，而直接键合生物分子。

在本发明的一些实施方式中，所述生物分子能够与待测物分子特异性结合。

在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％，不高于20％。

在本发明的一些优选实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不高于15％。

在本发明的一些优选实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于8％。

在本发明的一些具体实施例中，所述受体颗粒在试剂1中的粒径分布变异系数C.V值可以选自5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％和25％。

在本发明的另一些实施方式中，所述受体颗粒在所述受体试剂中的粒径分布呈现多分散性。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的粒径选自100至400nm，优选为150至350nm，更优选为180至220nm。

在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在所述受体试剂中的浓度为10μg/ml至1mg/ml，优选为20μg/ml至500μg/ml，更优选为50μg/ml至200μg/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述受体试剂中还包括PH值为7.0至9.0的缓冲溶液，所述受体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中。

在本发明的一些实施方式中，所述缓冲溶液中含有多糖，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物，优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖(例如葡聚糖)的分子量分布Mw选自10000至1000000Da，优选选自100000至800000Da，更优选选自300000至700000Da。

在本发明的一些实施方式中，每升所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.2g且不高于2g。

在本发明的一些实施方式中，每升所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.5g且不高于1.5g。

在本发明的另一些实施方式中，所述载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的第一多糖层与第二多糖层自发关联。

在本发明的一些实施方式中，所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，并且所述连续多糖层通过所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。

在本发明的一些实施方式中，所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。

在本发明的一些实施方式中，所述胺反应性官能团是醛基或羧基。

在本发明的一些实施方式中，所述第一多糖层自发地与所述载体相关联。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地化学键合特异性结合配对成员中的一员结合。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。

在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒的制备方法包括如下步骤：

步骤S1，将载体表面含有键合官能团的受体微球与生物分子在活化剂的参与下反应得到中间产物。

步骤S2，加入封闭剂，对步骤S1所得的中间产物进行封闭处理；

步骤S3，对步骤S2中封闭处理后的中间产物进行清洗，得到表面键合有生物分子的受体颗粒。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所述载体表面的键合官能团的密度不低于10nmol/mg.

在本发明的另一些实施方式中，步骤S1中所述载体表面的键合官能团的密度不低于30nmol/mg。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所受体微球与所述生物分子的质量比为10:(0.3～0.9)。

在本发明的另一些实施方式中，步骤S1中所受体微球与所述生物分子的质量比为10:(0.6～0.8)。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中加入封闭剂后的封闭剂的终浓度不低于5wt％。

在本发明的另一些实施方式中，步骤S2中加入封闭剂后的封闭剂的终浓度不低于10wt％。

本发明的第二方面提供了一种化学发光检测试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的受体试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒具有至少1个试剂条，所述试剂条上开设有若干盛装试剂的试剂孔，其中至少1个试剂孔用于盛装所述受体试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述化学发黄检测试剂盒除了受体试剂外，根据检测对象或检测方法的需要，还包括其他试剂，例如：供体试剂、包被生物素的二抗、稀释液等。在体外诊断领域，尤其是免疫分析领域，各个厂家为了简化商品试剂盒中不同成分的命名，通常都会将试剂盒中不同瓶子的组分标记或简称为试剂1或R1、试剂2或R2、试剂3或R3，……，以此类推，这样便于客户识别、组装和使用，也出于技术保密的目的。因此，不同体外诊断厂家的试剂盒产品可能都会含有试剂1、试剂2、试剂3、……，但是不同厂家对应的各试剂组分却各不相同。

本发明的第三方面提供了一种根据本发明第一方面所述的受体试剂或本发明第二方面所述的试剂盒在化学发光分析仪上中的应用。

本发明的第四方面提供了一种根据本发明第一方面所述的受体试剂或本发明第二方面所述的试剂盒在POCT仪器中的应用。所述POCT是指现场快速检验或在病人旁边进行的临床检测。

本发明还提供了根据本发明第一方面所述的受体试剂或本发明第二方面所述的试剂盒在体外诊断疾病或非疾病诊断中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的受体试剂能够大批量生产、成本低廉、质量合格且性能稳定，能满足灵敏度要求、又能满足线性范围要求；包含该受体试剂的试剂盒具有样品抗干扰能力强、测试性能佳的优点。

附图说明

图1为根据本发明实施例2的实验组5的ZETA电位分布图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

I.术语

本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称，主要为一种激发态的氧分子，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O₂·-)、二电子还原产物过氧化氢(H₂O₂)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O₂)等。

本发明所述用语“受体颗粒”是指含有能够与活性氧反应产生可检测信号的化合物颗粒。受体颗粒被能量或活性化合物诱导激活并释放高能态的活性氧，该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获，从而传递能量以激活所述受体颗粒。在一个具体实施方式中，所述受体颗粒包含发光组合物和载体，发光组合物填充于载体中和/或包被于载体表面。

本发明所述“载体”选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠、粒子和微球，其可以是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述载体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述载体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。

本发明中，所述“发光组合物”即一种被称作为标记物的化合物，可进行化学反应以便引起发光，比如通过被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。激发态可以是单线态或是三重激发态。激发态可弛豫到基态直接发光，或者是通过将激发能量传递到发射能量受体，从而自身恢复到基态。在此过程中，能量受体颗粒将被跃迁为激发态而发光。

本发明所述用语“供体颗粒”是指含有通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体颗粒反应的诸如活性氧的活性中间体的敏化剂的颗粒。供体颗粒可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中，所述供体颗粒为填充有光敏剂的高分子微球，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。

在本发明中，所述“粒径分布变异系数C.V值”是指在纳米粒度仪的检测结果中，粒径在高斯分布中的变异系数。变异系数的计算公式为：变异系数C.V值＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％。标准偏差(Standard Deviation，SD)也被称为标准差，它描述各数据偏离平均数的距离(离均差)的平均数，它是离差平方和平均后的方根，用σ表示。标准差是方差的算术平方根。标准偏差能反映一个数据集的离散程度，标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。标准偏差σ为正态分布曲线上的拐点(0.607倍峰高处)至峰高与时间轴的垂线间的距离，即正态分布曲线上两拐点间距离的一半。半高峰宽(Wh/2)是指峰高一半处的峰宽，Wh/2＝2.355σ。通过正态分布曲线两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽或称基线宽度，W＝4σ或W＝1.699Wh/2。

本发明所述用语“待测样品”是指待测的含有或疑似含有待测目标分子的一种混合物。可以被用在本发明的待测样品包括体液，如血液(可以是在收集的血液样品中通常看到的抗凝血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取物等。其他类型的待测样品包括溶剂、海水、工业水样、食品样品、环境样本诸如土或水、植物材料、真核细胞、细菌、质粒、病毒、真菌、及来自于原核的细胞。待测样品可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如，为了避免HOOK效应，可以在上机检测前使用稀释液对待测样品进行稀释后再在检测仪器上进行检测。

本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员中的一员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。

本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。所述抗原可以为融合抗原，且在任何需要的情况下，抗原可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。

本发明所述用语“结合”或“键合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等物理或化学作用引起的两个分子间的联合。

本发明中，所述“直接或间接地连接”是指指定的物质能够通过化学或物理键合到另一物质上(直接地)；或者指定的物质通过中间体物质(化合物、聚合物、多糖)再化学或物理键合到另一物质上(间接地)。

本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。在本发明公开的技术思想下，特异性结合反应的检测方法包括但不限于：双抗体夹心法、竞争法、中和竞争法、间接法或捕获法。

本发明所述用语“特异性结合配对成员”是指这样一对分子，它们能够相互特异性结合，例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性结合配对物的例子是生物素-链霉亲和素系统，其中“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素及类亲和素，优选为中性亲和素和/或链霉亲和素。亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取，分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，因此可以和4个生物素分子亲密结合，在免疫机制有起重要作用。亲和素主要包括卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素及中性亲和素等。链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下，本发明中所用任何试剂，包括抗原、抗体、受体颗粒或受体颗粒，均可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对物中的任一员。

本发明所述的ZETA电位值是指受体颗粒在PH为6～9的分散体系中的电位值。颗粒的ZETA电位(ZETA potential)是指颗粒在剪切面处的电位；即连续相与附着在微球上的流体稳定层之间的电势差。由于分散粒子表面带有电荷而吸引周围的反号离子，这些反号离子在两相界面呈扩散状态分布而形成扩散双电层。根据Stern双电层理论可将双电层分为两部分，即Stern层和扩散层。Stern层定义为吸附在电极表面的一层离子(IHP or OHP)电荷中心组成的一个平面层，此平面层相对远离界面的流体中的某点的电位称为Stern电位。稳定层(Stationary layer)(包括Stern层和滑动面slipping plane以内的部分扩散层)与扩散层内分散介质(dispersion medium)发生相对移动时的界面是滑动面(slippingplane)，该处对远离界面的流体中的某点的电位称为ZETA电位或电动电位(ζ-电位)，即ZETA电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。它可以通过电动现象直接测定。目前测量ZETA电位的方法主要有电泳法、电渗法、流动电位法以及超声波法，其中以电泳法应用最广。

Ⅱ.具体实施方案

下面将更详细地说明本发明。

体外诊断(In Vitro diagnosis，IVD)技术，通常是指在人体之外，通过对机体包括血液、体液及组织等样本进行检测而获取相关的临床诊断信息，从而帮助判断疾病或机体功能的产品和服务。纳米材料具有独特的尺寸依赖物理或化学性质，在纳米尺度内，可以通过改变它们的尺寸、形状、化学组成及表面官能团等来调节其光、磁、电、热及生物学性能，特别是纳米材料由于具有远高于宏观材料的比表面积，可提供大量的空间在其表面修饰不同的分子，使得它们在生物分析和生物传感器等应用方面具有重要作用。利用这些表面修饰了不同分子的纳米材料可以有选择性地检测小分子、核酸、蛋白质和微生物等。显然，纳米材料与体外诊断技术融合后有望具有检测限更低、灵敏度更高、选择性更强等特性，而纳米材料与临床诊断分析技术相结合也将把临床体外诊断学科推向新的发展生长点。

在光激化学发光技术领域，供体颗粒和受体颗粒共同组成一对“双球”体系，两种颗粒之间借助抗原-抗体间结合，实现单线态氧的传递，诱导光激发化学发光过程，从而实现“免分离”的均相免疫分析。“双球”均是纳米微球，它们在光激化学发光系统中相辅相成，相互作用，相互配合，相互影响，二者缺一不可。两种纳米微球在液相中有很好悬浮特性，微球在液相中和抗原或抗体相遇完全符合液态动力学特征。在680nm的激光照射下，供体颗粒的光敏剂负责将周围环境中的氧气激发为单线态氧分子。当单线态氧分子扩散到受体颗粒时，与受体颗粒中的化学发光剂产生一系列化学发光反应，从而产生610nm～620nm的发射波长光信号。

光激化学发光分析技术的技术原理为:敏化剂在激光照射下能将周围环境中的氧分子激发为单线态氧分子，单线态氧分子能够与相距200nm左右的发光组合物反应，产生一定波长的光信号；当样品中包含待测抗原或抗体时，该抗原抗体的免疫反应能够使包含敏化剂的受体颗粒与包含发光组合物的受体颗粒结合，从而产生特定波长的光信号，检测该光信号即可检测待测抗原或抗体的含量。在上述描述的光激化学发光免疫反应中，受体颗粒和受体颗粒的直径、材质、表面性质等会显著影响敏化剂激发单线态氧分子的效率及单线态氧分子的能量传递效率；也会影响受体颗粒和受体颗粒的非特异性结合，从而导致检测结果出现误差，因此，受体颗粒和受体颗粒的直径范围、微粒大小的均一性、微粒的材质、表面化学性质等是光激化学发光分析技术研发改进的重点方向，而绝非本领域一般常识或行业惯例。

受体试剂是光激化学发光系统中一个不可或缺的重要组成部分，其所包含的受体颗粒中的发光物质能够与单线态氧反应产生检测信号。受体颗粒制备工艺、受体颗粒的粒径分布、发光物质的选择、受体颗粒的表面处理等都直接影响着最终的检测结果。发明人经大量研究发现，一方面严格控制受体颗粒中糖含量在合适范围，另一方面调控受体颗粒的ZETA值，能够有效解决大批量生产成本低廉、质量合格、性能稳定的受体试剂的问题。本发明正是基于上述方法作出的。

本发明第一方面涉及一种受体试剂，其包含缓冲溶液以及悬浮于其中的受体颗粒，所述受体颗粒能够与单线态氧作用产生化学发光，其特征在于：所述受体颗粒的ZETA电位不高于-10mV且不低于-50mV；每毫克受体颗粒的糖含量不高于25微克。

在本发明的一些优选实施方式中，所述受体试剂中受体颗粒的ZETA电位不高于-15mV，且不低于-40mV。

在本发明的一些具体实施例中，所述受体试剂中受体颗粒的ZETA电位选自-10mV、-20mV、-30mV、-40mV、-50mV。本专利的发明人发现，精确控制受体试剂中受体颗粒的ZETA电位在合适范围内，能够使试剂盒具有抗干扰能力强、测试性能佳的优点。

在本发明的一些具体实施例中，每毫克所述受体颗粒中的糖含量不高于15微克。

在本发明的一些具体实施例中，每毫克所述受体颗粒中的糖含量可以为3微克、6微克、9微克、12微克、15微克、18微克、21微克、24微克。

在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有生物分子。

在本发明的一些实施方式中所述载体的表面具有键合官能团，其与生物分子键合。

在本发明的一些实施方式中，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基中的至少一种，优选选自醛基和/或羧基。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面具有醛基。所述醛基基团与生物分子上的氨基基团反应形成席夫碱键，从而将生物分子键合到载体的表面。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面具有羧基。所述羧基基团与生物分子上的氨基基团反应形成酰胺键，从而将亲和素分子连接到载体的表面。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面没有包被糖分子，而直接键合生物分子。

在本发明的一些实施方式中，所述生物分子能够与待测物分子特异性结合。

在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于5％，不高于20％。

在本发明的一些优选实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不高于15％。

在本发明的一些优选实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值不低于8％。

在本发明的一些具体实施例中，所述受体颗粒在试剂1中的粒径分布变异系数C.V值可以选自5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％和25％。

在本发明的另一些实施方式中，所述受体颗粒在所述受体试剂中的粒径分布呈现多分散性。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的粒径选自100至400nm，优选为150至350nm，更优选为180至220nm。

在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在所述受体试剂中的浓度为10μg/ml至1mg/ml，优选为20μg/ml至500μg/ml，更优选为50μg/ml至200μg/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述受体试剂中还包括PH值为7.0至9.0的缓冲溶液，所述受体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中。

在本发明的一些实施方式中，所述缓冲溶液中含有多糖，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物，优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖(例如葡聚糖)的分子量分布Mw选自10000至1000000Da，优选选自100000至800000Da，更优选选自300000至700000Da。

在本发明的一些实施方式中，每升所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.2g且不高于2g。

在本发明的一些实施方式中，每升所述缓冲溶液中的糖含量不低于0.5g且不高于1.5g。

本发明的受体颗粒中的糖含量可以来自于受体颗粒表面包被的多糖，也可以来自于抗原抗体或特异性结合配对成员自身结构中所携带的多糖成分。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖选自含有三个或三个以上未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖中的至少一种；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖中的至少一种，最优选为葡聚糖和/或葡聚糖衍生物。多糖，特别是葡聚糖和葡聚糖衍生物，它们可以增加载体表面的亲水性，并提供抗体分子和载体表面连接的共轭位点。受体微粒表面包被多糖可以增加微球的亲水性，并避免非特异性吸附现象的发生，极大影响后期光激化学发光检测的光信号。本专利的发明人发现，精确控制微球表面的糖含量在合适范围内，能够很好地解决光激化学发光技术在体外诊断领域应用所存在的某些技术问题。

在本发明中，糖浓度或糖含量可以采用蒽酮法测定糖。利用蒽酮法测多糖是本领域技术人员所知悉的一种方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm～630nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。

在受体颗粒表面包被多糖可以降低颗粒的非特异性吸附。但是，多糖却也会带来其他一些列问题，例如：成本较高、工艺复杂、检测信号降低。特别是在体外诊断领域，由于人体体液成分复杂，含有很多未知的成分，我们发现多糖包被的受体试剂用于体外诊断往往会对检测信号产生较大影响。为了综合解决这些问题，本发明人发现，严格控制受体颗粒上的糖含量，减少受体微球上包被多的糖，甚至不包被多糖，效果较好。

在本发明的另一些实施方式中，所述载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的第一多糖层与第二多糖层自发关联。

在本发明的一些实施方式中，所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，并且所述连续多糖层通过所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。

在本发明的一些实施方式中，所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。

在本发明的一些实施方式中，所述胺反应性官能团是醛基或羧基。

在本发明的一些实施方式中，所述第一多糖层自发地与所述载体相关联。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。

在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地化学键合特异性结合配对成员中的一员结合。

在本发明的一些实施方式中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。

在本发明的一些实施方式中，所述发光组合物能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号，其包含化学发光化合物和金属螯合物。

在本发明的一些具体实施方式中，所述化学发光化合物选自烯烃化合物，优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物，更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。

在本发明的另一些具体实施方式中，所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII族金属，优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌，更优选为铕。

在本发明的一些具体实施方式中，所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂：4’-(10-甲基-9-蒽基)-2,2’:6’2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺]四乙酸(MTTA)、2-

(1’,1’,2’,2’,3’,3’-七氟-4’,6’-己二酮-6’-基)-萘(NHA)、4,4’-二(2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基)-邻-三联苯(BHHT)、4,4’-二(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基)-氯代磺基-邻-三联苯(BHHCT)、4,7-联苯-1,10-菲咯啉(DPP)、1,1,1-三氟丙酮(TTA)、3-萘酰-1,1,1-三氟丙酮(NPPTA)、萘基三氟丁二酮(NTA)、三辛基氧化膦(TOPO)、三苯基氧化膦(TPPO)、3-苯甲酰-1,1,1-三氟丙酮(BFTA)、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮(fod)、2,2’-联吡啶(bpy)、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒的制备方法包括如下步骤：

步骤S1，将载体表面含有键合官能团的受体微球与生物分子在活化剂的参与下反应得到中间产物。

步骤S2，加入封闭剂，对步骤S1所得的中间产物进行封闭处理；

步骤S3，对步骤S2中封闭处理后的中间产物进行清洗，得到表面键合有生物分子的受体颗粒。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所述载体表面的键合官能团的密度不低于10nmol/mg.

在本发明的另一些实施方式中，步骤S1中所述载体表面的键合官能团的密度不低于30nmol/mg。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所受体微球与所述生物分子的质量比为10:(0.3～0.9)。

在本发明的另一些实施方式中，步骤S1中所受体微球与所述生物分子的质量比为10:(0.6～0.8)。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中加入封闭剂后的封闭剂的终浓度不低于5wt％。

在本发明的另一些实施方式中，步骤S2中加入封闭剂后的封闭剂的终浓度不低于10wt％。

本发明的第二方面涉及一种化学发光检测试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的受体试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒具有至少1个试剂条，所述试剂条上开设有若干盛装试剂的试剂孔，其中至少1个试剂孔用于盛装所述受体试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述化学发黄检测试剂盒除了受体试剂外，根据检测对象或检测方法的需要，还包括其他试剂，例如：供体试剂、包被生物素的二抗、稀释液等。在体外诊断领域，尤其是免疫分析领域，各个厂家为了简化商品试剂盒中不同成分的命名，通常都会将试剂盒中不同瓶子的组分标记或简称为试剂1或R1、试剂2或R2、试剂3或R3，……，以此类推，这样便于客户识别、组装和使用，也出于技术保密的目的。因此，不同体外诊断厂家的试剂盒产品可能都会含有试剂1、试剂2、试剂3、……，但是不同厂家对应的各试剂组分却各不相同。

本发明的第三方面涉及一种根据本发明第一方面所述的受体试剂或本发明第二方面所述的试剂盒在化学发光分析仪上中的应用。

本发明的第四方面涉及一种根据本发明第一方面所述的受体试剂或本发明第二方面所述的试剂盒在POCT仪器中的应用。所述POCT是指现场快速检验或在病人旁边进行的临床检测。

本发明还涉及根据本发明第一方面所述的受体试剂或本发明第二方面所述的试剂盒在体外诊断疾病或非疾病诊断中的应用。

本申请的发明人发现，受体颗粒的ZETA电位直接影响光激化学发光的检测结果。如果想要实现光激化学发光系统在临床免疫诊断中的商业化应用，就需要大批量的生产成本低廉、质量合格、性能稳定的受体试剂，那么就必须严格控制受体试剂中的受体颗粒的ZETA电位在合适的范围。

Ⅲ.具体实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

实施例1受体试剂A的制备

1.1羧基聚苯乙烯乳胶微球的合成及表征

1)准备100ml的三口烧瓶，加入40mmol苯乙烯、3mmol甲基丙烯酸、10ml水，搅拌10min后通N₂ 30min；

2)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠，溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤1)的反应体系中，继续通N₂ 30min；

3)将反应体系升温至70℃，反应15小时；

4)将反应完成后的乳液冷却至室温，用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水多次离心沉降清洗，直至离心初的上清液的电导率接近去离子水，然后用水稀释，以乳液形式保存；

5)由电导滴定法测得该乳胶微球羧基含量为70nmol/mg。

1.2.发光组合物的填埋过程及表征

1)准备25ml的圆底烧瓶，加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU³⁺)，10ml 95％乙醇，磁力搅拌，水浴升温至70℃，获得配合物溶液；

2)准备100ml的三口烧瓶，加入10ml 95％乙醇、10ml水和10ml浓度为10％、步骤1.1中获得的羧基聚苯乙烯乳胶微球，磁力搅拌，水浴升温至70℃；

3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中，70℃反应2小时后停止搅拌，自然冷却；

4)将上述乳液离心1小时，30000G，离心后弃去上清液，得到填埋有发光组合物的羧基聚苯乙烯微球。用20Mm HEPES缓冲液定容，使其终浓度为20mg/ml。

5)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为204.9nm，变异系数(C.V.)＝5.03％。

1.3羧基发光微球偶联HIV抗原的包被

1)将HIV抗原透析至pH值为5.0的50mM MES缓冲液，测得浓度为1mg/ml。

2)在2ml离心管中加入0.5mL羧基发光微球和0.5ml透析后的HIV抗原，混匀后加入100μl 10mg/ml EDAC溶液(50mM MES缓冲液)，2-8℃反应4小时。

3)反应完毕后加入0.5ml 100mg/ml BSA溶液(50mM MES缓冲液)，2-8℃反应2小时。

4)反应完毕后离心30min，20000g，离心后弃去上清液，用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗四次，并稀释至终浓度为100μg/ml，获得偶联HIV抗原的受体颗粒溶液。

实施例2受体试剂中受体颗粒的ZETA电位的测定

本发明采用ZETA电位的检测方法：NICOMP 380Z3000运用多普勒电泳法(ELS)测定ZETA电位值。主要是通过测定带电粒子在悬浮液中的电泳迁移速率，从而得到ZETA电位值。通过测定微球的ZETA电位，来判断胶体的稳定性。颗粒的ZETA电位的影响因素主要是颗粒表面所带电荷。

本发明的ZETA电位的测定的方法为：

2.1.按照实施例1所述的方式制备不同的受体试剂，其中各受体试剂中，利用蒽酮法检测每毫克所述受体颗粒中的糖含量不高于25微克，如表1所示。

2.2.配制样品，将步骤2.1制备的不同受体试剂稀释至去离子水中，浓度10μg/mL。

2.3.NICOMP 380Z3000仪器先经标准品标定后，再进行ZETA电位的测定。结果如表1所示。实验组5的ZETA电位见图1。

表1

结果分析：由实验组1-3的结果可以看出，其他条件不变，当活化剂的含量增加时，ZETA电位的绝对值降低；由实验组4-6的结果可以看出，其他条件不变，当包被比例提高时，ZETA电位的绝对值降低。由实验组5、7和8的结果可以看出，其他条件不变，当封闭剂的终浓度提高时，ZETA电位绝对值降低。由实验组5和9的结果可以看出，其他条件不变，当羧基密度提高时，ZETA电位的绝对值提高。

实施例3受体试剂的抗干扰评价

采用HIV抗体检测试剂盒进行检测评估，化学发光检测过程是在博阳生物科技(上海)有限公司开发的全自动光激化学发光分析系统(LiCA HT)上完成并输出检测结果。具体实验步骤如下：

1)将不同条件制备的HIV抗原包被的羧基发光微球(实施例2中1-9)用发光试剂缓冲液稀释至相同的工作浓度。

2)按照HIV抗体检测试剂盒说明书进行检测。

3)按反应模式手工加入样本及HIV抗原包被的羧基发光微球受体试剂和试剂盒中的试剂二进行第一阶段温育。

4)加入感光珠溶液。

5)进行第二阶段温育。

6)放入LiCA HT读数，不同受体试剂的样本测值如表2所示，不同受体试剂的样本区分度如表3所示。

在本实施例中，试剂的抗干扰性能检测，选择阴性血清和血浆管样本进行检测，来评价试剂的抗血浆管干扰能力。当血浆管样本信号测值/阴性血清样本的均值大于1时，存在血浆管干扰；当血浆管样本信号测值/阴性血清样本的均值远大于1时，血浆管干扰严重；当血浆管样本信号测值/阴性血清样本的均值小于1时，不存在血浆管干扰。

表2

表3

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										血浆管01	96.20	6.63	0.80	0.97	0.67	2.24	3.01	4.79	1.79
血浆管02	219.99	7.03	0.62	0.85	0.58	2.85	3.25	6.23	1.64
										血浆管03	1346.51	9.00	0.95	0.69	0.51	4.39	3.14	5.73	1.44
血浆管04	545.17	6.48	0.78	0.64	0.84	3.65	3.17	4.39	1.11

结果分析：由表3可以看出，实验组1血浆管干扰最严重，实验组3-5不存在血浆管干扰，其他组干扰较弱。因此，实验组3-5血浆管干扰最弱，试剂抗干扰能力较好。

综合实施例2和实施例3的结果可得，HIV抗原偶联的羧基微球的受体颗粒Zeta电位在-5至-50mV之间，试剂抗血浆管干扰能力较强；Zeta电位在-15至-50mV之间，试剂抗血浆管干扰能力最佳。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (16)

1.一种受体试剂，其包含缓冲溶液以及悬浮于其中的受体颗粒，所述受体颗粒能够与活性氧作用产生化学发光，其特征在于，所述受体颗粒的ZETA电位不高于-10mV，且不低于-50mV；每毫克受体颗粒的糖含量不高于25微克。

2.根据权利要求1所述的受体试剂，其特征在于，所述受体试剂中受体颗粒的ZETA电位不高于-15mV，且不低于-40mV。

3.根据权利要求1或2所述的受体试剂，其特征在于，每毫克所述受体颗粒中的糖含量不高于15微克。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的受体试剂，其特征在于，所述受体颗粒包括载体，所述载体的内部填充有发光组合物，所述载体的表面键合有生物分子。

5.根据权利要求4所述的受体试剂，其特征在于，所述载体的表面具有键合官能团，其与生物分子键合。

6.根据权利要求5所述的受体试剂，其特征在于，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的受体试剂，其特征在于，所述载体的表面具有羧基基团，所述羧基基团与生物分子上的氨基基团反应从而将生物分子键合到载体的表面。

8.根据权利要求5-7中任意一项所述的受体试剂，其特征在于，所述载体的表面没有包被糖分子，所述生物分子能够与待测物分子特异性结合。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的受体试剂，其特征在于，所述受体颗粒的制备方法包括如下步骤：

步骤S1，将载体表面含有键合官能团的受体微球与生物分子在活化剂的参与下反应得到中间产物；

步骤S2，加入封闭剂，对步骤S1所得的中间产物进行封闭处理；

步骤S3，对步骤S2中封闭处理后的中间产物进行清洗，得到表面键合有生物分子的受体颗粒。

10.根据权利要求9所述的受体试剂，其特征在于，步骤S1中所述载体表面的键合官能团的密度不低于10nmol/mg，优选不低于30nmol/mg。

11.根据权利要求9或10所述的受体试剂，其特征在于，步骤S1中所述受体微球与所述生物分子的质量比为10:(0.3～0.9)。

12.根据权利要求9-11中任意一项所述的受体试剂，其特征在于，步骤S1中所述活化剂的加入量不低于30nmol/mg。

13.根据权利要求9-12中任意一项所述的受体试剂，其特征在于，步骤S2中加入封闭剂后的封闭剂的终浓度不低于5wt％。

14.一种化学发光检测试剂盒，其包括如权利要求1至13中任意一项所述的受体试剂。

15.一种根据权利要求1至13中任意一项所述的受体试剂或权利要求14所述的试剂盒在化学发光分析仪上中的应用。

16.一种根据权利要求1至13中任意一项所述的受体试剂或权利要求14所述的试剂盒在POCT仪器中的应用。

Images