CN101017172A - 一种测定丙型肝炎病毒总核心抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定丙型肝炎病毒总核心抗原的方法，包括在检测前利用蛋白变性剂和非离子型表面活性剂对标本进行预处理，再采用丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒进行检测。本发明的预处理能影响Ig分子的可变区，尤其是超变区的构型，减低其与抗原的结合机会，同时能有效促进抗原抗体复合物的解离，使核心抗原得以充分曝露。该方法的阳性检出率和PCR阳性检出率接近，同时具有操作简单、高灵敏度和高特异性的优点，适于在临床推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及病毒抗原检测技术领域，具体涉及丙型肝炎病毒总核心抗原的检测方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)感染人体后，有接近半数人会发展成慢性肝炎，其中部分病人最终发展为肝硬化和肝癌。迄今为止尚未有预防丙型肝炎的疫苗问世，也没有治疗的特效药物，因此早期诊断仍是防止HCV传播的有效手段。
丙型肝炎病毒(HCV)的检测对于丙型肝炎的早期诊断和指导临床治疗具有重要意义，人感染HCV后存在一个相当长时间的病毒血症阳性而血清抗体阴性时期，被称之为检验血清阳转期前的“窗口期”。这一时期HCV复制活跃，具有很强的感染性，“窗口期”内进行输血、注射等医学治疗手段都极有可能造成HCV感染，从而引起疾病传播。
研究表明，HCV RNA的存在才是病毒复制的标志。定性检测HCV RNA主要采用RT--PCR技术，但是由于PCR技术需要严格干净的工作环境和较高的实验技巧，而且PCR操作过程较易发生交叉感染导致假阳性，故其应用受到了很大限制。2001年Ortho公司推出了检测HCV核心抗原ELISA试剂盒，经大量临床效检评价，约87％的HCV RNA阳性样品中含有可检测到的HCV核心抗原，国内湖南景达生物工程有限公司也推出了商业化的游离核心抗原检测试剂盒，经过对2.75万献浆员进行连续两年的HCV感染状况追踪，确诊了11例HCV感染者，HCV核心抗原诊断试剂较HCV抗体检测试剂对HCV感染的阳性检测时间提前19～68天，平均缩短39.3天。该方法操作简便且与现有的仪器设备有较好的兼容性。
然而一旦体内产生了抗体，血清阳转后抗核心抗原抗体与HCV-cAg之间便可形成抗原抗体复合物，其检测的敏感性就大大降低了。因此迫切需要寻求一种高灵敏度的总核心抗原检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定丙型肝炎病毒总核心抗原的方法，以克服现有技术存在的缺陷，显著提高总核心抗原检测的灵敏度。
为实现上述目的，本发明的方法包括如下步骤：
(1)预处理液配方为：0.3％TritonX100，1.5％SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL。取待测血清标本100μl，加入预处理液50μl，充分混合后于56℃孵育30min。
(2)采用丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒，每孔先后加入样品稀释液100μl、经预处理的标本100μl，按照试剂盒操作步骤进行酶联免疫反应。
本发明的技术方案能产生以下技术效果：
包括Triton-x100和SDS在内的预处理液影响Ig分子的可变区，尤其是超变区的构型，减低其与抗原的结合机会，有效促进了抗原抗体复合物的解离。其中的SDS作用于病毒颗粒并在一定温度下振荡，加速了病毒颗粒的裂解，使核心抗原得以充分曝露。结果表明其阳性检出率高达83％，较游离核心抗原22.2％的检测率有了很大的提高。此外，总核心抗原检测法还具有很高的特异性
附图说明
图1：北京佑安医院18例门诊病例PCR检测结果
1：阳性对照，2：阴性对照，3-18：样品检测结果
具体实施方案
实施例一：游离核心抗原测定、总核心抗原测定及PCR测定三种检测方法的结果比较。
本发明共涉及75例血清标本，其中50份标本为中南大学湘雅医院门诊病例，为单项转氨酶升高或临床怀疑肝脏疾病患者，18份为北京佑安医院门诊病例，7例为湖南省岳阳市第二医院门诊病例。
1、采用丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫检测试剂盒，按照试剂盒操作步骤进行酶联免疫反应(参见公开号CN1877330申请文件)，以酶标仪450nm波长测各孔OD值，临界值为二阴性对照值的平均值+0.06，反应孔的OD值大于临界值即判断为阳性。
2、取待测血清标本100μl，加入预处理液50μl，预处理液为0.3％Triton-x100，1.5％SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL。混合后56℃孵育30分钟，采用丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒，按照试剂盒操作步骤进行酶联免疫反应，以酶标仪450nm波长测各孔OD值，临界值为二阴性对照平均值+0.06，反应孔的OD值大于临界值即判断为阳性。
3、采用亚培abotte生产的试剂盒，取50μl被检血清样品，分别加入200μl试剂A，50μl试剂B，用混匀器混匀至无颗粒状态，14000rpm离心5min；取出上清85μl，加入等体积试剂C并混匀，14000rpm离心10min；轻轻将液体全部倒掉，在滤纸上沾干残留部分；加入75％预冷酒精400μl，充分混匀，14000rpm离心5min；轻轻倒掉液体，在滤纸上沾干残留部分，酒精灯上快速烘干。
取28μl的PCR Mix I，加入RT-Enzyme Mix2μl混匀，取30μl分别加于PCR管中，4000rpm离心1min；37℃保温30min。然后按下列参数进行第一次PCR：94℃，5分钟预变性，然后进入94℃、30s，50℃、30s，72℃、30s循环，共30个循环，最后72℃，5min。接着进行第二次PCR扩增：取第一次反应物1.2μl，22.5μl的PCR Mix II，Tap DNA聚合酶0.5μl，加入到新编号PCR管中混匀，4000rpm离心1min左右。按下列参数进行PCR扩增：94℃/5min，然后进入94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s循环，共30个循环，最后72℃、5min。
实验结果(参见表1)表明：在75例被检测的血清标本中，经PCR测定HCV-RNA阳性为36人，经丙型肝炎核心抗原试剂盒测定游离抗原阳性为8人，采用总抗原测定阳性为27人，所有丙型肝炎核心抗原测定阳性标本均为PCR阳性，在PCR阴性病例中无丙型肝炎核心抗原检测阳性者。
表1：丙型肝炎病毒核心抗原检测方法与PCR检测方法结果
| 样品数 | PCR测定阳性例数 | 游离核心抗原测定阳性例数 | 总核心抗原测定例数 | |
| 北京佑安医院 | 18 | 10 | 3 | 9 |
| 中南大学湘雅医院 | 50 | 24 | 3 | 16 |
| 湖南岳阳市二医院 | 7 | 2 | 2 | 2 |
| 总计 | 75 | 36 | 8 | 30 |
北京佑安医院18例标本中，10例RT-PCR测定为阳性(参见图1)，其中例7、8、9游离抗原检测法测定为阳性；总抗原测定法测定有9例阳性，均与RT-PCR结果相符，仅例14总抗原测定法测定为阴性而RT-PCR测定为阳性。
实施例二：总核心抗原测定与定量荧光PCR测定的结果比较
采用总核心抗原测定法及常规定量荧光PCR方法，涉及的50例血清标本来自中南大学湘雅医学院，以复制数＞0.5×103判定为阳性，经定量荧光PCR检测出阳性标本24例，总抗原测定阳性标本16例，结果见表2，其中“+”表示为阳性，“-”表示为阴性。结果显示荧光定量PCR在病毒复制数＞106时利用核心总抗原测定均可测出病毒感染。
在50个病例中，无一例是酶联免疫阳性而RT-PCR或定量PCR阴性的，由此说明核心总抗原的检测试剂还具有很高的特异性，而且和PCR检测的阳性率接近，适合在不具备RT-PCR、荧光定量PCR检测条件的中小医院推广使用。
表2：丙型肝炎病毒核心抗原和荧光定量PCR检测结果
| 样品 | 游离抗原 | 总抗原 | HCV-RNA | 样品 | 游离抗原 | 总抗原 | HCV-RNA |
| 1 | - | - | - | 26 | - | - | 3.14×105 |
| 2 | - | + | 3.56×105 | 27 | - | - | - |
| 3 | - | - | - | 28 | - | + | 1.84×107 |
| 4 | - | + | 5.1×105 | 29 | - | - | - |
| 5 | + | + | 1.93×105 | 30 | - | - | - |
| 6 | - | - | - | 31 | - | - | - |
| 7 | - | - | - | 32 | - | + | 2.23×106 |
| 8 | - | - | - | 33 | - | - | - |
| 9 | - | - | - | 34 | - | + | 8.71×106 |
| 10 | + | + | 2.53×105 | 35 | - | - | - |
| 11 | - | - | - | 36 | - | - | 3.42×105 |
| 12 | - | + | 5.25×106 | 37 | - | - | - |
| 13 | - | - | - | 38 | - | - | - |
| 14 | - | + | 1.75×106 | 39 | - | + | 1.46×106 |
| 15 | - | - | - | 40 | + | + | 1.63×107 |
| 16 | - | + | 8.4×105 | 41 | - | - | 6.79×104 |
| 17 | - | - | 2.9×105 | 42 | - | + | 7.21×106 |
| 18 | - | - | - | 43 | - | + | 3.44×106 |
| 19 | - | + | 3.54×106 | 44 | - | + | 1.05×104 |
| 20 | - | - | - | 45 | - | - | - |
| 21 | - | + | 1.27×107 | 46 | - | - | - |
| 22 | - | + | 9.84×103 | 47 | - | - | - |
| 23 | - | - | 1.63×106 | 48 | - | + | 9.0×106 |
| 24 | - | - | - | 49 | - | - | - |
| 25 | - | - | - | 50 | - | - | - |
Claims (3)
1、一种测定丙型肝炎病毒总核心抗原的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)预处理液配方为：0.3％Triton×100，1.5％SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL。取待测血清标本100μl，加入预处理液50μl，充分混合后于56℃孵育30min。
(2)采用丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒，每孔先后加入样品稀释液100μl、经预处理的标本100μl，按照试剂盒操作步骤进行酶联免疫反应。
2、一种测定丙型肝炎病毒总核心抗原的方法，其特征在于步骤(1)中可以采用Triton×114、吐温80等非离子型表面活性剂代替。
3、一种测定丙型肝炎病毒总核心抗原的方法，其特征在于步骤(3)中采用丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒为湖南景达生物工程有限公司产品，专利公开号为：CN1877330。
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