CN113495152A - 一种抑制素b定量检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种抑制素b定量检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抑制素B定量检测试剂盒及使用方法，检测试剂盒提供的系统反应液，添加了氧化剂、SDS，在对抑制素B进行检测中，样本进行氧化处理不用单独进行，实现样本边氧化边反应的反应模式；本申请提供的抑制素B定量检测试剂盒，克服了现有检测抑制素B方法存在的反应时间长、操作步骤较复杂等的不足，具有省时、便于操作和灵敏度高、特异性强的特点。

Description

一种抑制素B定量检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种抑制素B定量检测试剂盒及使用方法。
背景技术
抑制素(inhibin,INH)是细胞因子中转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员之一，是由α-亚基和β-亚基通过二硫键连接组成的异二聚体糖蛋白激素。β-亚基又分为βA和βB两种形式，分别与α-亚基通过二硫键形成抑制素A(INHA)和抑制素B(INHB)。
抑制素B是卵巢储备功能和睾丸曲细精管功能的主要标记物，可以用于卵巢因素引起的女性不孕和曲细精管功能障碍引起的男性不育检测。在男性体内，抑制素B是睾丸来源的糖蛋白激素，成年男性体内血清抑制素B水平与FSH呈显著负相关，对FSH起负反馈作用。男性出生后不久，血清抑制素B水平逐渐上升，于青春期Ⅱ期达到成年人水平，从青春期Ⅲ期至成年，抑制素B与FSH之间一直维持负相关关系。20-30岁时，抑制素B水平到达另一个高峰，此后抑制素B水平随年龄增加逐渐降低。而在女性体内，抑制素B主要由卵巢的中、小窦状卵泡的颗粒细胞产生，可以反馈性抑制垂体前叶促卵泡激素(FSH)的释放，调节卵泡的生成。INHB水平比FSH更早、更直接的反应卵巢储备情况。
目前，抑制素B的酶联免疫法检测均采用生物素-链霉亲和素在内的双抗体夹心法系统，一方面反应时间比较长，另一方面操作步骤复杂，不便于在临床开展使用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种抑制素B定量检测试剂盒及使用方法，检测试剂盒提供的系统反应液，添加了氧化剂、SDS，在对抑制素B进行检测中，样本进行氧化处理不用单独进行，实现样本边氧化边反应的反应模式；本申请提供的抑制素B定量检测试剂盒，克服了现有检测抑制素B方法存在的反应时间长、操作步骤较复杂等的不足，具有省时、便于操作和灵敏度高、特异性强的特点。
本发明的目的是以下述方式实现的：一种抑制素B定量检测试剂盒，包括包被有抗抑制素B抗体的包被板、包含抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液、和酶结合物，酶结合物为酶标记的针对抑制素B的单克隆抗体。
所述的抑制素B定量检测试剂盒，还包括系统反应液，系统反应液包括保护蛋白、缓冲液、SDS和氧化剂。
系统反应液还包括防腐剂。
氧化剂为过氧化氢；缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液；保护蛋白可以是牛血清白蛋白、Casein中的至少一种；防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
系统反应液每升中含有8-12g SDS，30％过氧化氢163-172ml。
系统反应液每升中含有8-12g SDS，30％过氧化氢163-172ml、牛血清白蛋白8-12g、Proclin 300 0.8-1.3ml。
包被板为包被针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体的酶标板；酶标记的针对抑制素B的单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的针对抑制素B的βB亚基的单克隆抗体。
包含抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液分别为包含0pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、400pg/ml、1200pg/ml浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液。
包被板中使用的包被液为pH7.4的Tris溶液、pH7.4的PBS溶液中的一种，所用的针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体的浓度为2-10ug/ml，所用的封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl溶液；酶结合物的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种，酶结合物还包括清洁抗体；校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种；酶标记的抗抑制素B单克隆抗体与酶结合物稀释液按体积比1:(2200—2800)的比例混合得到酶结合物。
所述的抑制素B定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)，
加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
本发明试剂盒基于酶联免疫法制备而成，配合酶标仪使用，操作简便，检测速度快。与已上市的抑制素B检测试剂盒相比，本试剂盒采用酶直接标记抗抑制素B抗体的双抗体夹心法的方法，实现一步法的反应方式；优化系统反应液配方，添加了氧化剂、SDS，对样本进行氧化处理不用单独进行，实现样本边氧化边反应的反应模式。
系统反应液中的过氧化氢作为氧化样本的主要成分，是样本中抑制素B中含有甲硫氨酸的位点充分暴露出来，使抗体更好的识别和结合，使得到的检测结果更准确。
附图说明
图1是本申请试剂盒与现有产品的相关性参考图。
具体实施方式
一种抑制素B定量检测试剂盒，包括包被有抗抑制素B抗体的包被板、包含抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液、和酶结合物，酶结合物为酶标记的针对抑制素B的单克隆抗体。
所述的抑制素B定量检测试剂盒，还包括系统反应液，系统反应液包括保护蛋白、缓冲液、SDS和氧化剂。
系统反应液还包括防腐剂。
氧化剂为过氧化氢；缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液；保护蛋白可以是牛血清白蛋白、Casein中的至少一种；防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
系统反应液每升中含有8-12g SDS，30％过氧化氢163-172ml。
系统反应液每升中含有8-12g SDS，30％过氧化氢163-172ml、牛血清白蛋白8-12g、Proclin 300 0.8-1.3ml。
包被板为包被针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体的酶标板；酶标记的针对抑制素B的单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的针对抑制素B的βB亚基的单克隆抗体。
包含抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液分别为包含0pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、400pg/ml、1200pg/ml浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液。
包被板中使用的包被液为pH7.4的Tris溶液、pH7.4的PBS溶液中的一种，所用的针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体的浓度为2-10ug/ml，所用的封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl溶液；酶结合物的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种，酶结合物还包括清洁抗体；校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种；酶标记的抗抑制素B单克隆抗体与酶结合物稀释液按体积比1:(2200—2800)的比例混合得到酶结合物。
所述的抑制素B定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)，
加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50μl校准品及待测样本，然后分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl；
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，18-23℃下避光反应20分钟；
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所使用的物料和检测仪器均为本行业常规物料产品，均为市场上普通所售产品，所使用的检测方法为本行业常规使用方法。
制备抑制素B定量检测试剂盒
1、制备包被板
包被液为pH7.4的Tris的一种，所用的抗体为针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体，浓度为5ug/ml。所用的封闭液是含有牛血清白蛋白的0.05M pH7.4的Tris-HCl，其按照常规的包被抗体的制备方法进行制备。针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体的来源厂家及型号是杭州博岳生物、B2。
(1)包被液的制备：采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl，溶于900mL纯化水中，用6MHCl调pH至7.4，定容至1000mL制得包被液；
(2)封闭液的制备：采用6.05g的Tris和8.5g的NaCl，溶于900mL纯化水中，用6M HCl调pH至7.4，定容至1000mL，得溶液A；然后在一部分溶液A中加入30g的BSA、1ml的Proclin300和100g蔗糖，然后通过加入溶液A的方式定容至1000ml制得封闭液。
Tris、NaCl、BSA、纯化水、蔗糖、Proclin300分别为分析纯。
2、酶结合物的制备
酶结合物的缓冲液采用PBS缓冲液，所用的保护蛋白可以是牛血清白蛋白，所用的防腐剂为Proclin 300，所用的清洁抗体是用于消除嗜异性抗体引起的非特异性吸附，提升试剂盒灵敏度或者降低本底等。
(1)PBS缓冲液的制备：采用0.592g的NaH2PO4·2H2O、5.80g的Na2HPO4·12H2O，和8.5g的NaCl溶于900mL纯化水中，用6M HCl调pH至7.4，定容至1000mL；
(2)先取一部分PBS-NaCl缓冲液，在PBS-NaCl缓冲液中加入30g的BSA、1ml的Proclin300和0.05g的清洁抗体，然后通过加入PBS-NaCl缓冲液的方式定容至1000ml制得酶结合物稀释液；
(3)辣根过氧化物酶标记抗体
采用过碘酸钠法进行抗体标记：称取1mg HRP溶解于0.2mL蒸馏水中，逐滴加入0.2mL新配的0.1M NaIO4溶液，混匀，4℃避光放置30分钟；加入0.2mL的0.16M的乙二醇溶液，混匀，室温18-23℃放置30分钟；在上述溶液中加入1mg抑制素B抗体，置于透析袋内在0.05MpH9.5的碳酸盐缓冲液中进行透析过夜。将标记的抗体取出，加入40uL新配制的NaBH4(10mg/mL)后在4℃下放置2小时；加入等体积的饱和硫酸铵进行沉淀，离心去上清；用PBS溶解沉淀，再置于透析袋内在0.02M磷酸盐缓冲液中进行透析。将透析袋内溶液取出，加入等体积的甘油，得到的即是辣根过氧化物酶标记的抑制素B抗体。抑制素B抗体的来源及型号分别是杭州博岳生物、B16。
(4)将HRP标记的抗抑制素B单克隆抗体与酶结合物稀释液按体积比1:2500的比例混合，得到的即为酶结合物。
NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaCl、BSA、纯化水、清洁抗体、蒸馏水、HRP、抑制素B抗体、Proclin300分别为分析纯。清洁抗体的来源及型号分别是博岳生物、M0101。
将HRP标记的抗抑制素B单克隆抗体按1:4000加入到上述酶结合物稀释液中，得到的即为酶结合物。
3、系统反应液的制备
系统反应液的缓冲液采用PBS缓冲液，保护蛋白是牛血清白蛋白，所用的防腐剂采用Proclin300。
(1)PBS缓冲液的制备：采用0.592g的NaH2PO4·2H2O、5.80g的Na2HPO4·12H2O，和8.5g的NaCl溶于700mL纯化水中，用6M HCl调pH至7.4；
(2)然后加入30％过氧化氢167ml，然后定容至1000mL；
(3)先取一部分PBS缓冲液，在PBS缓冲液中加入10g的BSA、1ml Proclin300、10g的十二烷基硫酸钠，然后通过加入PBS缓冲液的方式定容至1000ml制得系统反应液。
NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaCl、BSA、30％过氧化氢、纯化水、十二烷基硫酸钠、Proclin300分别为分析纯。
4.校准品的制备
(1)PBS缓冲液的制备：采用0.592g的NaH2PO4·2H2O、5.80g的Na2HPO4·12H2O，和8.5g的NaCl溶于900mL纯化水中，用6M HCl调pH至7.4，定容至1000mL；
(2)先取一部分PBS缓冲液，在PBS缓冲液中加入30g BSA、1ml Tween-20、5g庆大霉素、1ml Proclin300，然后通过加入PBS缓冲液的方式定容至1000ml制得校准品稀释液。
将抑制素B用该校准品稀释液进行稀释，配制成0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、600pg/ml、1200pg/ml六个浓度的抑制素B校准品。
NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaCl、BSA、庆大霉素、纯化水、抑制素B、Proclin300、Tween-20分别为分析纯。抑制素B抗原的来自杭州博岳生物。
5、其他通用试剂组分：底物、终止液、洗液采购自郑州达诺生物。
6、试验过程
1、实验操作步骤(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔：用微量移液器依次加入50μl校准品及待测样本，分别加入50μl系统反应液，再加入酶结合物50μl。
(2)温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟。
(3)洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干。
(4)显色：每包被孔加底物液100μl，室温18-23℃下避光反应20分钟。
(5)终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
2、结果计算
(1)酶标仪检测：选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm。在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。
(2)计算：本试剂盒推荐采用点到点回归拟和方式，即以系列校准品浓度值为横坐标(X轴)，以标准品OD值为纵坐标(Y轴)，建立点到点标准曲线，从而根据曲线计算待测样本抑制素B的含量。
计算示例数据如下表表1。
表1
Figure BDA0002419946170000061
3、本发明试剂盒临床验证
为了验证本发明试剂盒抑制素B与对比厂家anshlabs结果的一致性，共收集83例血清样本进行平行检测，检测结果进行临床相关性分析，结果如下表表2，根据表中数据制得相关性参考图如图1。
表2
Figure BDA0002419946170000062
Figure BDA0002419946170000071
从图1显示比对结果表明，本发明试剂盒与对比试剂盒的现行相关R2为0.9523，证明本发明试剂盒与对比试剂盒间相关性较好。
本发明试剂盒采用一步法反应，将辣根过氧化物酶直接偶联在抗抑制素B单克隆抗体上，将加有过氧化氢的系统反应液与酶结合物同时加入，这样样本位点的氧化与抗体的结合同时进行，减少反应时间和简化操作步骤，实现更方便快捷的操作方法，更灵活和便于临床操作使用。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：包括包被有抗抑制素B抗体的包被板、包含抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液、和酶结合物，酶结合物为酶标记的针对抑制素B的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：还包括系统反应液，系统反应液包括保护蛋白、缓冲液、SDS和氧化剂。
3.根据权利要求2所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：系统反应液还包括防腐剂。
4.根据权利要求2所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：氧化剂为过氧化氢；缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液；保护蛋白可以是牛血清白蛋白、Casein中的至少一种；防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：系统反应液每升中含有8-12g SDS，30%过氧化氢 163-172ml。
6.根据权利要求2所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：系统反应液每升中含有8-12g SDS，30%过氧化氢 163-172ml、牛血清白蛋白8-12g、Proclin 300 0.8-1.3ml。
7.根据权利要求1所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：包被板为包被针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体的酶标板；酶标记的针对抑制素B的单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的针对抑制素B的βB亚基的单克隆抗体。
8.根据权利要求1或7所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：包含抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液分别为包含0pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、400pg/ml、1200pg/ml浓度抑制素B抗原的系列梯度校准品溶液。
9.根据权利要求1或7所述的抑制素B定量检测试剂盒，其特征在于：包被板中使用的包被液为pH7.4的Tris溶液、pH7.4的PBS溶液中的一种，所用的针对抑制素B的α亚基的单克隆抗体的浓度为2-10ug/ml，所用的封闭液是含有牛血清白蛋白的pH7.4的Tris-HCl溶液；酶结合物的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为小牛血清、牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种，酶结合物还包括清洁抗体；校准品的制备中使用的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液或PBS缓冲液，所用的保护蛋白为牛血清白蛋白、Casein中的至少一种，所用的防腐剂为Proclin 300、NaN3、卡松中的至少一种；酶标记的抗抑制素B单克隆抗体与酶结合物稀释液按体积比1:（2200—2800）的比例混合得到酶结合物。
10.根据权利要求1-9任一权利要求所述的抑制素B定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤，
（1）加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，依次加入50µl校准品及待测样本，然后分别加入50µl系统反应液，再加入酶结合物50µl；
（2）温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
（3）洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
（4）显色：每包被孔加底物液100µl，18-23℃下避光反应20分钟；
（5）终止：每包被孔加终止液50µl，终止反应。
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