CN104122395A - 一种检测样本中髓过氧化物酶浓度的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于体外免疫检测技术领域，具体涉及一种检测样本中髓过氧化物酶（MPO）浓度的试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板、髓过氧化物酶系列标准品和质控品、辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体、样本缓冲液、过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液、四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲溶液、1-2M的硫酸溶液、含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。本发明由于所用的检测仪器较为简单，均为通常所用仪器，故检测成本较低，利于推广；并且该试剂盒容易操作，不需要专业的人员即可实现；同时试剂盒内独特的标准品稀释液和样本缓冲液配方，大大提高了检测结果的可靠性和准确性。

Description

一种检测样本中髓过氧化物酶浓度的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外免疫检测技术领域，具体涉及一种检测样本中髓过氧化物酶（MPO）浓度的试剂盒及其制备方法。
背景技术
髓过氧化物酶（MPO）是一种相对分子质量为150KD的白细胞酶，是糖基化的血红素蛋白。MPO来源于多形核中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞,贮存在嗜天青颗粒中,当白细胞被激活及脱颗粒时,MPO被释放到吞噬泡和血浆中。在特定条件下,它能诱导氧化应激和组织损伤,作为系统炎症和氧化应激的标志物，MPO通过多种机制参与冠心病的发生、发展。大量流行病学研究显示MPO浓度的增高与冠心病密切相关，因此检测病人血浆中MPO的浓度对于冠心病患者具有十分重要的参考价值。
目前，在市面上检测MPO浓度常用的试剂种类需要配套昂贵的大型仪器，检测成本高，操作繁琐，对实验操作人员的技能要求高，不利于该项目检测的大范围推广。
发明内容
针对上述技术的不足之处，本发明提供一种操作简便、便于实验人员掌握、涉及实验仪器单一、普及率高、检测成本低、检测结果准确，非常利于大范围推广的髓过氧化物酶（MPO）定量检测试剂盒。
一种检测样本中髓过氧化物酶浓度的试剂盒，包括包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板、髓过氧化物酶系列标准品和质控品、辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体、样本缓冲液、过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液（称为底物A）、四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲溶液（称为底物B）、1-2M的硫酸溶液（称为终止液）、含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液（称为浓缩洗液）。
进一步的，所述微孔板为96孔聚苯乙烯微孔板，里面包被有1-50μg/孔的抗髓过氧化物酶单克隆抗体。
进一步的，所述的髓过氧化物酶系列标准品和质控品都是用髓过氧化物酶纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成，所述标准品不少于2个，所述质控品和所述标准品的区别只是浓度不同，所述质控品的作用是在试剂盒使用过程中起到核准校对的作用，即通过质控品测值是否在质控范围内来对标准品拟合出来的曲线进行核准校对，若质控品测值合格，则可以利用标准曲线来拟合出样本中的髓过氧化物酶浓度值。
进一步的，所述的标准品稀释液，是在PH7.0-8.0、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10%质量分数的动物血清、0.01-0.5%质量分数的防腐剂、1-10%质量分数的蛋白保护剂、0.05-1%质量分数的表面活性剂混合而成。
进一步的，所述样本缓冲液是在PH4.0-5.0、浓度为10-100mM的柠檬酸盐缓冲液中，分别加入0.1-3mM的金属离子络合剂、1-10%质量分数的蛋白保护剂、0.01-1%质量分数的表面活性剂、0.01-0.5%质量分数的防腐剂混合而成。
优选的，所述的表面活性剂为曲达通X-100、吐温20、布里杰-35、吐温40、吐温60、吐温80、十二烷基磺酸钠、斯盘20、烷基酚聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。
优选的，所述的防腐剂为Proclin300、叠氮钠、硫柳汞、硫酸庆大霉素。
优选的，所述的金属离子络合剂为乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸四钠。
优选的，所述的蛋白保护剂为牛血清白蛋白、牛γ蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。
制备所述试剂盒的方法，包括以下制备过程，所述制备过程不分先后：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释到浓度为1-50μg/ml，分别加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中进行包被；然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；甩去凹孔中的封闭液，烤干，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：用含有动物血清、防腐剂、蛋白保护剂、表面活性剂的磷酸盐缓冲液将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0-1000ng/ml的一系列标准品以及80-500ng/ml的质控品；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：将被过碘酸钠氧化好的辣根过氧化物酶与特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体混合交联，然后用硼氢化钠还原，再透析后即得髓过氧化物酶的酶标抗体；将酶标记物与甘油等体积混合，-20℃保存备用；
样本缓冲液的制备：将金属离子络合剂、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂分别加入到柠檬酸盐缓冲液中，搅拌均匀；
底物A的制备：将过氧化氢加入到柠檬酸盐缓冲液中，配制成过氧化氢终浓度为20-50%的柠檬酸盐混合溶液；
底物B的制备：将四甲基联苯胺加入到柠檬酸盐缓冲液中，配制成四甲基联苯胺最终浓度为5-20%的柠檬酸盐混合溶液；
终止液的制备：将浓硫酸加水稀释；
浓缩洗液的制备：把表面活性剂加到磷酸盐缓冲液中，然后混匀。
本发明由于所用的检测仪器较为简单，均为通常所用仪器，故检测成本较低，利于推广；并且该试剂盒容易操作，不需要专业的人员即可实现；同时试剂盒内独特的标准品稀释液和样本缓冲液配方，大大提高了检测结果的可靠性和准确性。
附图说明
图1为实施例2标准曲线图。
图2为实施例3标准曲线图。
图3为实施例4标准曲线图。
图4为实施例5标准曲线图。
图5为实施例6标准曲线图。
图6为实施例7标准曲线图。
图7为实施例8标准曲线图。
图8为实施例9标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1:
一种检测样本中髓过氧化物酶浓度的试剂盒，包括包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板、髓过氧化物酶系列标准品和质控品、辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体、样本缓冲液、过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液（称为底物A）、四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲溶液（称为底物B）、1-2M的硫酸溶液（称为终止液）、含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液（称为浓缩洗液）。
进一步的，所述微孔板为96孔聚苯乙烯微孔板，里面包被有1-50μg/孔的抗髓过氧化物酶单克隆抗体。
进一步的，所述的髓过氧化物酶系列标准品和质控品都是用髓过氧化物酶纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成，所述标准品不少于2个，所述质控品和所述标准品的区别只是浓度不同，所述质控品的作用是在试剂盒使用过程中起到核准校对的作用，即通过质控品测值是否在质控范围内来对标准品拟合出来的曲线进行核准校对，若质控品测值合格，则可以利用标准曲线来拟合出样本中的髓过氧化物酶浓度值。
进一步的，所述的标准品稀释液，是在PH7.0-8.0、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10%质量分数的动物血清、0.01-0.5%质量分数的防腐剂、1-10%质量分数的蛋白保护剂、0.05-1%质量分数的表面活性剂混合而成。
进一步的，所述样本缓冲液是在PH4.0-5.0、10-100mM浓度的柠檬酸缓冲液中，分别加入0.1-3mM的金属离子络合剂、1-10%质量分数的蛋白保护剂、0.01-1%质量分数的表面活性剂、0.01-0.5%质量分数的防腐剂混合而成。
优选的，所述的表面活性剂为曲达通X-100、吐温20、布里杰-35、吐温40、吐温60、吐温80、十二烷基磺酸钠、斯盘20、烷基酚聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。
优选的，所述的防腐剂为Proclin300、叠氮钠、硫柳汞、硫酸庆大霉素。
优选的，所述的金属离子络合剂为乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸四钠。
优选的，所述的蛋白保护剂为牛血清白蛋白、牛γ蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。
制备所述试剂盒的方法，包括以下制备过程，所述制备过程不分先后：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释到浓度为1-50μg/ml，分别加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中进行包被；然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；甩去凹孔中的封闭液，烤干，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：用含有动物血清、防腐剂、蛋白保护剂、表面活性剂的磷酸盐缓冲液将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列标准品以及80、300ng/ml的质控品；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：将被过碘酸钠氧化好的辣根过氧化物酶与特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体混合交联，然后用硼氢化钠还原，再透析后即得髓过氧化物酶的酶标抗体；将酶标记物与甘油等体积混合，-20℃保存备用；
样本缓冲液的配制：将金属离子络合剂、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂分别加入到柠檬酸盐缓冲液中，搅拌均匀；
底物A的制备：将过氧化氢加入到柠檬酸盐缓冲液中，配制成过氧化氢终浓度为20-50%的柠檬酸盐混合溶液；
底物B的制备：将四甲基联苯胺加入到柠檬酸盐缓冲液中，配制成四甲基联苯胺最终浓度为5-20%的柠檬酸盐混合溶液；
终止液的制备：将浓硫酸加水稀释；
浓缩洗液的制备：把表面活性剂加到磷酸盐缓冲液中，然后混匀。
实施例2：
通过以下方法制备该试剂盒：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为7.4的20mM磷酸钠缓冲液稀释到浓度为1μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4℃包被过夜；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含1%牛血清白蛋白的PH7.4的10mM磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：用含有1%新生牛血清、0.05%Proclin300、3%牛血清白蛋白、0.1%Triton X-100的20mM磷酸钠缓冲溶液（PH7.4）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:2000的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中分别添加：1mM EDTA二钠、1%牛血清白蛋白、0.1%Tween20、0.1%BRIJ-35和0.05%Proclin300，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备
底物A：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加20%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加5%的TMB，充分混匀；
终止液：1M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入1%吐温20，充分混匀；
如附图1所示为本实施例的标准曲线图，表1为本实施例质控品、样本检测结果。
表1质控品、样本检测结果
实施例3：
通过以下方法制备该试剂盒：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为8.0的10mM磷酸钠缓冲液稀释到浓度为10μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4℃包被过夜；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含2%牛血清白蛋白的PH8.0的10mM磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：用含有2%山羊血清、0.1%叠氮钠、1%牛γ蛋白、0.1%Tween20的20mM磷酸钠缓冲溶液（PH7.4）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:2000的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：向20mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.5）中分别添加：0.5mM EDTA四钠、2%牛血清白蛋白、0.05%Triton X-100、0.2%BRIJ-35和0.05%Proclin300，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备
底物A：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加30%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加10%的TMB，充分混匀；
终止液：1M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入1%吐温20，充分混匀；
如附图2所示为本实施例的标准曲线图，表2为本实施例质控品、样本检测结果。
表2质控品、样本检测结果
实施例4：
通过以下方法制备该试剂盒：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：
将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为7.2的15mM磷酸钠缓冲液稀释到浓度为20μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4℃包被过夜；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含2.5%牛血清白蛋白的PH7.2的15mM磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：
用含有1%马血清、0.1%叠氮钠、3%牛血清白蛋白、0.1%Tween80的20mM磷酸钠缓冲溶液（PH7.4）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:2000的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：
向15mM柠檬酸钠缓冲液（PH5.0）中分别添加：0.1mM EDTA二钠、1%牛γ蛋白、0.1%Triton X-100、0.15%BRIJ-35和0.1%叠氮钠，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备：
底物A：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加35%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加15%的TMB，充分混匀；
终止液：2M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入1%吐温80，充分混匀；
如附图3所示为本实施例的标准曲线图，表3为本实施例质控品、样本检测结果。
表3为质控品、样本检测结果
实施例5：
通过以下方法制备该试剂盒：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：
将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为7.4的30mM磷酸钠缓冲液稀释到浓度为30μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4℃包被过夜；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含1%牛血清白蛋白的PH7.4的30mM磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：
用含有1.5%猪血清、0.1%Proclin300、1.5%牛血清白蛋白、0.1%SDS的20mM磷酸钠缓冲溶液（PH7.4）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:2000的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：
向20mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.8）中分别添加：0.2mM EDTA二钠、3%牛血清白蛋白、0.1%Tween20、0.15%SDS和0.1%Proclin300，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备：
底物A：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加40%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加20%的TMB，充分混匀；
终止液：2M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入1%Span-20，充分混匀。
如附图4所示为本实施例的标准曲线图，表4为本实施例质控品、样本检测结果。
表4为质控品、样本检测结果
实施例6：
通过以下方法制备该试剂盒：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：
将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为8.0的10mM磷酸钠缓冲液稀释到浓度为50μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4℃包被过夜；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含3%牛血清白蛋白的PH8.0的10mM磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：
用含有1.5%鼠血清、0.1%叠氮钠、3%牛血清白蛋白、0.1%Tween60的15mM磷酸钠缓冲溶液（PH7.2）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:3000的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：向50mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.2）中分别添加：0.5mM EDTA二钠、4.5%牛血清白蛋白、0.1%Span-20、0.15%Tween20和0.1%Proclin300，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备：
底物A：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加50%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向10mM柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加20%的TMB，充分混匀；
终止液：2M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入1%Tween60，充分混匀；
如附图5所示为本实施例的标准曲线图，表5为本实施例质控品、样本检测结果。
表5为质控品、样本检测结果
实施例7：
通过以下方法制备该试剂盒：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：
将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为8.0的10mM/L磷酸钠缓冲液稀释到浓度为10μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4℃包被过夜；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含2%牛血清白蛋白的PH8.0的10mM/L磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：
用含有2%山羊血清、0.1%叠氮钠、1%牛γ蛋白、0.1%Tween20的20mM/L磷酸钠缓冲溶液（PH7.4）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM/L PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:2000的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：
向20mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.5）中分别添加：0.5mM/L EDTA四钠、2%牛血清白蛋白、0.05%Triton X-100、0.2%BRIJ-35和0.05%Proclin300，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备：
底物A：向10mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加30%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向10mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加10%的TMB，充分混匀；
终止液：1M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入1%吐温20，充分混匀；
如附图6所示为本实施例的标准曲线图，表6为本实施例质控品、样本检测结果。
表6质控品、样本检测结果。
实施例8：
通过以下方法制备该试剂盒：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：
将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为7.4的25mM/L磷酸钠缓冲液稀释到浓度为15μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，150ul/孔，4℃包被18小时；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含1.5%牛血清白蛋白的PH7.4的25mM/L磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2.5小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4.5小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：
用含有3.5%绵羊血清、0.1%Proclin300、5%甘油、0.2%NP-4（烷基酚聚氧乙烯(4)醚）的20mM/L磷酸钠缓冲溶液（PH7.4）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、250、500、1000ng/ml的一系列标准品以及100、500ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM/L PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:1800的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：
向15mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.2）中分别添加：0.02%EDTA二钠、1%牛γ蛋白、0.1%PEG2000（聚乙二醇2000）、0.1%BRIJ-35和0.01%硫柳汞，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备：
底物A：向10mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加25%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向10mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加10%的TMB，充分混匀；
终止液：1.5M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入1%Triton-X100，充分混匀；
如附图7所示为本实施例的标准曲线图，表7为本实施例质控品、样本检测结果。
表7质控品、样本检测结果
实施例9：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：
将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用PH值为8.0的45mM/L磷酸钠缓冲液稀释到浓度为45μg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4℃包被18小时；移去包被液，然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含1.0%牛血清白蛋白的PH8.0的45mM/L磷酸钠缓冲液：300ul/孔，37℃封闭2.5小时；甩去凹孔中的封闭液，37℃烤干4.5小时，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：
用含有5%鸡血清、0.3%硫柳汞、8%海藻糖、0.5%PEG4000（聚乙二醇4000）的20mM/L磷酸钠缓冲溶液（PH7.8）将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0、50、100、250、500、1000ng/ml的一系列标准品以及100、500ng/ml的质控品；然后用冻干机冻干成粉末状，4℃保存；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：
(1)先称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM/L PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化好的辣根过氧化物酶PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg特异性的抗髓过氧化物酶抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)向反应体系加入0.1ml新配的4mg／ml NaBH4溶液，置4℃混匀2小时。
(6)将上述反应体系装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)将透析袋中的酶标记物与甘油等体积混匀，-20℃保存备用；
(8)将酶标抗体按照1:1800的比例进行稀释。
样本缓冲液的制备：
向35mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.5）中分别添加：0.05%EDTA四钠、3%甘油、0.1%PEG4000（聚乙二醇4000）、0.15%BRIJ-35和0.01%硫酸庆大霉素，充分混匀。
底物A、底物B、终止液和浓缩洗液的制备：
底物A：向15mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加45%的过氧化氢，充分混匀；
底物B：向15mM/L柠檬酸钠缓冲液（PH4.0）中添加20%的TMB，充分混匀；
终止液：1.5M的硫酸溶液；
浓缩洗液：向0.2M磷酸钠盐缓冲液（PH7.4）中加入0.5%Span-20，充分混匀；
如附图8所示为本实施例的标准曲线图，表8为本实施例质控品、样本检测结果。
表8质控品、样本检测结果
实施例10：
本发明髓过氧化物酶（MPO）定量检测试剂盒的操作使用方法如下：
1.将标准品和质控品用去离子水复溶混匀，分别向微孔板中加入标准品100ul/孔、质控和样本各10ul和90ul样本缓冲液/孔，放在摇床上室温反应45min；
2.用洗板机洗板四次，拍干；
3.向微孔板中加入酶结合物100ul/孔，放在摇床上室温反应45min；
4.用洗板机洗板四次，拍干；
5.底物A、底物B等体积混匀，向微孔板中加入100ul/孔，37℃反应15min；
6.向微孔板中加入终止液100ul/孔；
7.利用酶标仪在450nm处读取各反应孔的OD值；
8.将标准品的浓度值和OD值进行二次曲线回归拟合出标准曲线，再将样本的OD值带入标准曲线中，即可得出样本中MPO的浓度值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测样本中髓过氧化物酶浓度的试剂盒，其特征在于：包括包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板、髓过氧化物酶系列标准品和质控品、辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体、样本缓冲液、过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液、四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲溶液、1-2M的硫酸溶液、含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微孔板为96孔聚苯乙烯微孔板，里面包被有1-50μg/孔的抗髓过氧化物酶单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的髓过氧化物酶系列标准品和质控品都是用髓过氧化物酶纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的标准品稀释液，是在PH7.0-8.0、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10%质量分数的动物血清、0.01-0.5%质量分数的防腐剂、1-10%质量分数的蛋白保护剂、0.05-1%质量分数的表面活性剂混合而成。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样本缓冲液是在PH4.0-5.0、浓度为10-100mM的柠檬酸缓冲液中，分别加入0.1-3mM的金属离子络合剂、1-10%质量分数的蛋白保护剂、0.01-1%质量分数的表面活性剂、0.01-0.5%质量分数的防腐剂混合而成。
6.根据上述任意一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为曲达通X-100、吐温20、布里杰-35、吐温40、吐温60、吐温80、十二烷基磺酸钠、斯盘20、烷基酚聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为Proclin300、叠氮钠、硫柳汞、硫酸庆大霉素。
8.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述的金属离子络合剂为乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸四钠。
9.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述的蛋白保护剂为牛血清白蛋白、牛γ蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。
10.制备如权利要求1所述的试剂盒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
包被有抗髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备：将特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释到浓度为1-50μg/ml，分别加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中进行包被；然后用洗板机将微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；甩去凹孔中的封闭液，烤干，真空袋封装，4℃存放；
髓过氧化物酶系列标准品和质控品的制备：用含有动物血清、防腐剂、蛋白保护剂、表面活性剂的磷酸盐缓冲液将髓过氧化物酶纯品配制成标示浓度为0-1000ng/ml的一系列标准品以及80-500ng/ml的质控品；
辣根过氧化物酶标记的抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备：将被过碘酸钠氧化好的辣根过氧化物酶与特异性的抗髓过氧化物酶单克隆抗体混合交联，然后用硼氢化钠还原，再透析后即得髓过氧化物酶的酶标抗体；将酶标记物与甘油等体积混合，-20℃保存备用；
样本缓冲液的配制：将金属离子络合剂、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂分别加入到柠檬酸盐缓冲液中，搅拌均匀；
过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液的制备：将过氧化氢加入到柠檬酸盐缓冲液中，配制成过氧化氢终浓度为20-50%的柠檬酸盐混合溶液；
四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲溶液的制备：将四甲基联苯胺加入到柠檬酸盐缓冲液中，配制成四甲基联苯胺最终浓度为5-20%的柠檬酸盐混合溶液；
1-2M的硫酸溶液的制备：将浓硫酸加水稀释；
含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液的制备：把表面活性剂加到磷酸盐缓冲液中，然后混匀。
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