CN103777019A - 抗ca50单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备 - Google Patents
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Abstract
抗CA50单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备制备,属于免疫分析医学领域。本发明提供了一种特异性识别CA50的单克隆抗体,产生该单克隆抗体的杂交瘤,以及使用该单克隆抗体检测CA50的高灵敏度的方法;还提供了CA50化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法,该试剂盒包括:CA50检测反应板、酶结合物、发光底物、标准品、质控品、浓缩洗涤液。本发明用细胞融合和杂交瘤技术研发出灵敏度高、特异性好的抗体;同时用自主研发抗体将免疫学与化学发光技术相结合,研制出检测范围宽、灵敏度高、操作方便、生产成本低的试剂盒。CA50主要用于胰腺癌、结直肠癌、胃癌的辅助诊断。
Description
【技术领域】
本发明涉及CA50单克隆抗体产生的杂交瘤及检测血清中CA50含量的试剂盒,可广泛应用在医学和及生物化学技术领域。
【背景知识】
CA50是一种广谱的肿瘤标志物,主要分布于糖脂及高分子蛋白中,不同肿瘤血清CA50阳性率不同。胰腺、肝脏、结肠、直肠等消化道恶性肿瘤患者中CA50阳性率较高。CA50在血清中的含量与肿瘤组织的大小、转移与否及病情严重程度有直接的定量关系,是用于胰腺癌早期诊断的一个有效指标。CA50广泛存在于上皮组织肿瘤中,CA50在血清中的含量与肿瘤组织的大小、转移及病情的严重程度有着直接的定量关系,是胰腺癌早期诊断的一种有效手段。有研究表明,胰腺癌患者血清CA50的含量明显高于正常组,而且其特异性较高。
CA50与CA199同属糖类蛋白抗原,与CA199有交叉免疫性,胰腺癌患者CA50检出率约为50%。约10%的胰腺癌患者不产生CA199,仅产生CA50,CA50和CA199联合检测可修正部分CA199的假阴性结果。相关研究结果显示,联合检测的敏感性和特异性均高于单一检测。因此,CA50和CA199联合检测可提高胰腺癌的检出率,有助于胰腺癌的早期诊断、疗效观察及复发预测。此外CA50和CA199与其他肿瘤标志物CEA及CA242的联合检测对胰腺癌诊断的特异性和敏感性高,具有较高临床价值。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种抗CA50单克隆抗体产生的杂交瘤以及建立一种简单且具高灵敏度的检测CA50的方法,并将该方法应用胰腺癌的早期筛查。以解决现有的单克隆抗体检测CA50的灵敏度不够或价格昂贵,不适合临床大规模的应用的缺点。
本发明的另一目的在于提供一种CA50化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂盒的制备方法。利用该试剂盒分析检测灵敏度高、特异性强。
本发明获得了能够产生特异性识别CA50的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株11-1与杂交瘤细胞株2-1,此2株细胞株分别在2014年1月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址是,中国.武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:C201417与CCTCC NO:C201418。此外,经过鉴定,两株单克隆抗体分别识别CA50的两个不同表位,通过11-1与2-1的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法,其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。
因此,本发明提供了下面所述的1至7的内容:
1.抗CA50的杂交瘤细胞株,其保藏号分别为CCTCC NO:C201417和CCTCC NO:C201418。
2.抗CA50的单克隆抗体,分别由保藏号为CCTCC NO:C201417和CCTCC NO:C201418的杂交瘤细胞系所分泌,所述单克隆抗体命名为11-1和2-1。
3.如权利要求2所述的抗CA50单克隆抗体的应用,即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CA50,夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C201417杂交瘤分泌的抗体11-1和保藏号为CCTCC NO:C201418杂交瘤分泌的抗体2-1,其步骤包括:
(1)以所述的两两配对的单克隆抗体11-1包被;
(2)加入待测样品孵育;
(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体2-1作为二抗,加入反应体系;
(4)洗涤后加入酶反应底物,以450nm读取OD值;
(5)结果表明检测的灵敏度很高。
4.一种检测血清中CA50含量的试剂盒,包括:包被有抗CA50单克隆抗体11-1的不透明聚苯乙烯板;CA50抗原系列标准品;酶标记的CA50单克隆抗体2-1;上述酶所作用的化学发光底物A液和B液以及洗涤液。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被单克隆抗体11-1,包被液是碳酸盐缓冲液;另一株CA50单克隆抗体2-1和辣根过氧化酶偶联形成酶标记抗体,采用的是改良的过碘酸钠法进行标记;CA50抗原系列标准品以小牛血清为基质,加入CA50抗原纯品配置而成;发光底物A、B为HRP-Luminol发光体系。
6.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:标记抗体所用的标记酶是辣根过氧化酶,用的是高碘酸钠氧化法,所得酶标记抗体最佳的工作浓度是1:4000;包被有抗CA50抗体的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被;发光液A液用硼砂7.99g,硼酸3.46g,鲁米诺0.28g,对碘苯酚0.07g,加工艺用水定容至700mL,避光保存;发光底物B液由下列成分组成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,过氧化脲0.07g加工艺用水定容至700mL。
7.如权利要求4-6所述试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)标准品的配制和浓度的校正
将CA50抗原纯品,加入标准品稀释液,配制一高浓度标准品浓液,采用逐低稀释的方法稀释到各浓度,配制成0、5、20、100、250、500U/mL的系列标准品,标准品用国家标准品校正。
(2)包被
采用0.2mol/L,pH值为9.5的碳酸盐缓冲液与CA50单抗混合成抗体浓度是2μg/mL包被液,以100μL/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上,4℃孵育过夜;
(3)洗板
用PBS-T洗液洗板孔2次;
(4)封闭
封闭液包含NaCl8.00g,KCl0.20g,Na2HPO4·12H2O2.90g,KH2PO40.20g,蔗糖20.00g,proclin3001.00mL,BSA20.00g,封闭液的PH值为7.3-7.5,150μL/孔封闭,湿盒放置孵育3h;
(5)干燥
去除封闭液,过夜干燥。
(6)组装为成品
将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂,密封保存。
上述的抗CA50的单克隆抗体,是由下列的方法所制备,步骤包括:
(1)用蛋白量为5KU/只的CA50抗原与弗氏完全佐剂混合免疫小鼠;经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫;再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫;10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度,用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫;3天后取脾细胞进行融合;
(2)将免疫小白鼠脾细胞与小白鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5:1-10:1的比例,用50%PEG作为融合剂融合;
(3)用含HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的无血清培养基,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养10天,常规间接ELISA方法筛选阳性孔;
(4)筛选出的特异性强阳性孔用有限稀释法克隆,获得单抗细胞株进一步扩大培养;
(5)收集培养上清液,亲和层析法纯化单克隆抗体,即为抗CA50单克隆抗体;
(6)检测单克隆抗体的效价,选取效价高的一株进行HRP标记,并对标记好的单克隆抗体进行滴度测定;
(7)标记好的单克隆抗体与其他未标记的单克隆抗体进行竞争ELISA反应,选取没有竞争的一株进行夹心ELISA反应,确定最佳条件。
本发明的单克隆抗体可直接用于检测样品中的CA50含量,通过大量培养单抗细胞株,即可获得大量的单克隆抗体,与多克隆抗体相比,具有纯度高,专一性强、重复性好等优点。
本发明针对临床实验室建立了一种既可以手工操作,又可以用于标准全自动检测仪器的检测手段,建立了检测人血清CA50的定量检测方法。本发明的CA50定量检测试剂盒(化学发光法)可以专一的检测出人血清中的CA50的含量,主要用于用于相关恶性肿瘤的辅助诊断、对已确诊的恶性肿瘤患者进行动态监测以辅助判断疾病的进程或治疗效果等。它具有简便、快速、灵敏、稳定的优点,本发明的试剂盒,包被的抗体11-1与酶标记的抗体2-1及被测样品中的CA50形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构,所以本发明采用的是“双抗夹心一步法”的反应模式。利用辣根过氧化酶催化发光底物,发光底物发生化学反应释放大量的能量,产生激发态的中间体,当其回到稳定的基态时,可以发射出光子,利用发光仪器测量光量子的产额,该光量子的产额和样品中的检测物质的量成正比,由此建立标准曲线并计算出样品中待测物质的含量。试剂盒检测方法具有灵敏度高,检测范围宽,操作方便、对实验人员无伤害,同时生产成本低,减轻了医患双方的负担,因此更有利于临床胰腺癌的早期筛查。
【附图说明】
图1显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗CA50单克隆抗体在ELISA方法中效价测定结果;
图2显示的是标记HRP的抗CA50单克隆抗体滴度测量结果;
图3显示的是夹心法ELISA系统的检测灵敏度;
图4显示的是所制备的试剂盒的标准品线形图。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外,应理解,在阐述了本发明的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改,这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。
实施例1:动物免疫
选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠,抗原是蛋白量为5KU/只的CA50抗原与弗氏完全佐剂、PBS混合,完全乳化后,采取背部多点,及腋下、腹股沟免疫。免疫程序:经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫;再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫;10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴 度,用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫;3天后取脾细胞进行融合。
实施例2:杂交瘤的构建
1、骨髓瘤细胞株的培养及制备
(1)本发明采用的是SP2/0骨髓瘤细胞,该细胞株生长及融合效率均佳,倍增时间为10-12h。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养,使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期);
(2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中,离心,弃上清,悬起,加10mL的培养基,吸取少量10倍稀释后,计数。
2、脾细胞的制备
(1)将小鼠放在密封袋中,充CO2使其窒息死亡;
(2)将小鼠消毒固定在解剖板上,在超净工作台中取脾,放在12mL培养基的培养皿中,剥掉粘连组织,研磨脾脏,直至剩白色组织为止,吸管全部吸起,再缓慢打出使组织块粘连的管壁上,离心,弃上清,加10mL的红细胞裂解液裂解10min,再加20-25mL的培养基终止其反应,离心后,弃上清,加10mL的培养基,吸取少量10倍稀释后,计数。
3、细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1:10混和,通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞,命名为11-1和2-1。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中,然后加入到96孔板中,在37℃,5%CO2的培养箱中封闭培养12天。
实施例3:单克隆抗体的制备及筛选
1、单克隆抗体的制备
从实施例2中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液,选取在ELISA方法中与抗原多肽反应的单克隆抗体。
2、单克隆抗体的筛选
(1)将100uL浓度为10U/ml的CA50到96孔板的每个孔格中,于4℃过夜后使其固定于固相;
(2)用150uL浓度为1%的牛血清白蛋白进行封闭2h;
(3)将100uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中,于37℃反应2h,然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37℃反应1h;
(4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min;
(5)添加50uL浓度为0.2N的硫酸终止反应后,测量450nm的吸光度;
(6)选出吸光度大约为3的11-1和2-1,并通过有限稀释法进行亚克隆。
3、单克隆抗体的大量制备及和纯化
将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养,约20天后,收集上清,用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为11-1与2-1。
4、单克隆抗体效价的测定
所筛选出的2株单克隆抗体的效价通过ELISA方法来测定。分别加入11-1、2-1(10ug/mL),在反应后,使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色,结果如图1所示两株单克隆抗体的效价达到10-9以上。
实施例4:单克隆抗体的标记及滴度的测定
将纯化出的抗体按常规方法进行HRP标记,标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定,将浓度为10U/mL的CA50固定在96孔微板上(100uL/孔)。使用1%的牛血清白蛋白进行封闭2h,加标记的单克隆抗体(第一孔100倍稀释),从第二孔开始4倍稀释,于室温下反应1h。添加TMB后,反应在室温下进行20min,用0.2N的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度,HRP标记的单克隆抗体的滴度结果如图2所示。
实施例5:双抗体夹心ELISA检测CA50方法的建立
(1)以所述的两两配对的单克隆抗体11-1包被,2ug/ml的单克隆抗体以100uL/孔加到微孔板上,于4℃孵育24h固定于固相;
(2)微孔板使用含有0.1%Tween-20的pH值为7.4的20mM PBS以200uL/孔的量洗2次。以150uL/孔的量加入1%牛血清白蛋白进行封闭2h。
(3)微孔板用PBST以200uL/孔的量洗4次,加入由起始浓度10ug/ml连续4倍稀释CA50,于室温温育2h,然后加入标记HRP的另一株抗体2-1(1:4000;100uL/孔)并于室温温育2h。
(4)添加TMB后,反应在室温下进行20min,加入0.2N的硫酸中止反应并测量450nm的吸光度。
(5)检测结果见附图3所示。
实施例6:制备本发明的CA50定量测定试剂盒(化学发光法)
(一)高碘酸钠氧化法标记辣根过氧化酶
(1)酶的氧化(全过程避光)
a、称取3-5mg HRP溶解于600μL ddH2O2中;
b、加入新鲜配制的150uL0.1M高碘酸钠(NaIO4)(MW:213.89g/mol,取0.22g溶解于10mL10mM pH7.0磷酸钠缓冲液中);
c、混匀,室温,避光孵育20min;
d、将溶液用透析管透析,3000rpm/min,4℃,20min,溶液为1.0mM pH4.0醋酸钠缓冲液,换3-4次;
e、最后透析至800μL,至EP管中;
(2)抗体的准备和标记(避光)
a、取准备好的3mg单抗,用离心管浓缩成500μL-1000μL体积,吸出于新的15mL离心管中;
b、加入500μL0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液,混匀,检测pH值在9.0~9.5;
c、立即将透析好的HRP溶液与单抗溶液混合,室温摇晃2h,避光;
d、加入80μL新鲜配制的NaBH4(4.0mg/mL,取40mg溶解于10mL ddH2O2中);
e、混匀(避光),4℃孵育1.5h;
f、用PBS透析至体积为2mL;
g、加入等体积甘油,1mL/管,-20℃保存
(二)酶标抗体工作液的配制
(1)酶标稀释液的配制
按照标准配方准确称取三羟甲基氨基甲烷7.27g,加工艺用水800.0mL,搅拌使充分溶解后,加入浓盐酸适量,搅拌均匀,使用数显酸度计测量液体的pH值为7.1~7.3,再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中,充分搅拌溶解后,使用工艺用水定容至1200.0mL,按《316L SGP150K型不锈钢钹式液体精密过滤器标准操作规程》进行除菌过滤,过滤后液体2~8℃保存备用。
(2)酶标抗体工作液的配制
经试验证明,酶标抗体的最佳工作浓度是1:4000,用(1)所述的稀释液将酶标抗体稀释到所需要的工作浓度。
检验合格的酶结合物缓冲液按照所用抗体的稀释比例添加CA50-HRP,顺时钟方向搅拌30min充分混合均匀后2~8℃保存备用,分装时按96人份:11.0mL/瓶,有效期18个月。
(三)CA50标准品的配制
按照标准配方内容准确称取上述各组分,加入工艺用水800.0mL搅拌充分溶解后,使用数显酸度计测量液体的pH值应为7.1~7.3,用工艺用水定容至1000.0mL,混合均匀,将CA50抗原纯品,加入标准品稀释液,配制一高浓度标准品浓液,采用逐低稀释的方法稀释到各浓度,配制成0、5、20、100、250、500U/mL的系列标准品,2~8℃保存备用。
检验合格的CA50标准品分装时,0.3mL/瓶,有效期18个月。
(四)CA50单克隆抗体包被聚苯乙烯板
(1)将0.05mol/L,pH9.6的磷酸氢二钾溶液和CA50单克隆抗体11-1混合制成包被液,将其包被于聚苯乙烯板上,放置湿盒中,过夜包被;
(2)洗涤:用PBS-Tween洗液洗板孔2次;
(3)封闭:
封闭液的配制:
准确称量NaCl8.00g,KCl0.20g,Na2HPO4.12H2O2.90g,KH2PO40.20g,搅拌均匀,使用数显酸度计测量液体的pH值为7.3~7.5,再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中,充分搅拌溶解后,使用工艺用水定容至1000.00mL,2~8℃保存备用,有效期15天。使用时150μL/孔,湿盒孵育2h,甩掉封闭液,在干净的吸水纸上拍干;
(4)干燥:将聚苯乙烯板放置在冻干机上冻干2h,真空封袋,贴签后置2-8℃保存。
(五)化学发光底物液
本发明所使用的辣根过氧化酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法是:
化学发光底物A的配制方法:
准确称取上述各组分,加入纯化水600.0mL,搅拌充分溶解后定容至700.0mL,测定溶液的pH应为9.1~9.4,2~8℃避光保存备用。
按检验合格后按96人份:6.0mL/瓶分装,有效期18个月。
化学发光底物B的配制方法:
准确称取上述各组分,加入纯化水600.00mL,搅拌充分溶解后定容至700.00mL,测定溶液的pH应为9.1~9.4,2~8℃保存备用。
检验合格后按96人份:6.0mL/瓶分装,有效期18个月。
使用方法:使用前将A液和B液按1:1比例混合使用。
(六)10×洗涤液
准确称取上述各组分,加入工艺用水定容至800.00mL,搅拌充分溶解后,加工艺用水定容至1000.00mL,测定溶液的pH应为7.1~7.4,室温保存备用。
检验合格后按照96人份,30.00mL/瓶分装,有效期18个月。
(七)半成品及成品的组成
上述步骤所得的各种半成品组成及产品说明书等各种附件组装成CA50定量测定试剂盒(化学发光法)。
试剂盒中的固相抗体是提前包被好的,不需要现场包被,使用方便且节时;校准品是液体;酶标记物是已经稀释到工作浓度的液体,也可以直接使用。
实施例7:本发明CA50定量测定试剂盒(化学发光法)操作方法如下:
(一)准备
将要待检血清样品和检测试剂盒恢复至室温(18-25℃)(大约15min),本发明的试剂盒中的不透明的聚苯乙烯板已经将CA50抗体固定在板孔中,可直接使用,不用现时包被,使用非常方便。
(二)操作方法:
1、将所需要量的已包被的板条放置在支架上;
2、在包被孔中分别加入10μL的标准品和血样;
3、每孔加入100μL的酶标记物,稍微振荡使其混合均匀;置湿盒中孵育1h;
4、弃去孔内液体,用稀释后的洗涤液,自动洗板机或者手工洗板4次,最后在干净的吸水纸上扣干;
5、将发光底物A、B等比例混合至本次所用的体积,每孔加入混合后的发光底物100μL,稍微振荡使其混合均匀,避光室温反应3min;
6、化学发光仪检测相对发光值(RLU),测量时间是0.1-1秒/孔;
7、分别对标准品浓度和相对发光值(RLU)取对数值,建立标准曲线(见附图4),以待测血清RLU的值在标准曲线查出血清中CA50的浓度值,计算检测结果;
8、统计分析检测结果。
以本发明的上述试剂盒按照上述步骤进行测定所用的时间短、仅需要一个多小时就可全
部完成,方便快速。
实施例八本发明的试剂盒测定时的方法学指标如下:
1、检测范围:0-500U/mL;
2、灵敏度:最小检出限是1U/mL;
3、精密度:分析内精密度(检测低、中、高三组样品(n=10)均小于15%,分析间的精密度(检测低、中、高三组样品(n=10)均小于15%,高于国家标准,说明本发明的试剂盒在检测试验中具有良好的重复性;
4、线性:r≥0.99;
5、特异性:和CA153、CA125、CA724、CA199等常见肿瘤标志物无交叉反应。
本发明的试剂盒所用的血清量少,只需要10μL,体外检测对患者没有任何的副作用;同时本发明用的是化学发光免疫分析方法,各项指标也优于酶联免疫吸附分析方法(ELISA),因此本发明为临床检测CA50提供了一种更简便、快速、准确的方法,更能满足临床上的需求。
实施例九本发明的试剂盒临床血样测值
取用医院临床收集病人血清标本60份,用本发明的试剂盒进行临床检测,其测值如下:
标记 | 计算浓度 | 理论浓度 | 发光值 |
S0 | 0.00 | 0.00 | 7916 |
S1 | 5.21 | 5.00 | 210657 |
S2 | 18.21 | 20.00 | 599623 |
S3 | 105.87 | 100.00 | 2612407 |
S4 | 256.35 | 250.00 | 5472271 |
S5 | 485.09 | 500.00 | 9327738 |
首先对上表中的标准品浓度和相对发光值(RLU)取对数值,建立标准曲线,标准曲线相关系数R值是0.99,并以待测血清RLU的值在标准曲线中查出血清中CA50的浓度值,统计分析检测结果,与临床检测值比较,符合率达到99%。
综上所述,本发明的试剂盒操作简单、价格便宜、对患者无副作用、快速、准确率高等优点,更适于推广使用。
Claims (7)
1.抗CA50的杂交瘤细胞株,其保藏号分别为CCTCC NO:C201417和CCTCC NO:C201418。
2.抗CA50的单克隆抗体,分别由保藏号为CCTCC NO:C201417和CCTCC NO:C201418的杂交瘤细胞系所分泌,所述单克隆抗体命名为11-1和2-1。
3.如权利要求2所述的抗CA50单克隆抗体的应用,即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CA50,夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C201417杂交瘤分泌的抗体11-1和保藏号为CCTCC NO:C201418杂交瘤分泌的抗体2-1,其步骤包括:
(1)以所述的两两配对的单克隆抗体11-1包被;
(2)加入待测样品孵育;
(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体2-1作为二抗,加入反应体系;
(4)洗涤后加入酶反应底物,以450nm读取OD值;
(5)结果表明检测的灵敏度很高。
4.一种检测血清中CA50含量的试剂盒,包括:包被有抗CA50单克隆抗体11-1的不透明聚苯乙烯板;CA50抗原系列标准品;酶标记的CA50单克隆抗体2-1;上述酶所作用的化学发光底物A液和B液以及洗涤液。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被单克隆抗体11-1,包被液是碳酸盐缓冲液;另一株CA50单克隆抗体2-1和辣根过氧化酶偶联形成酶标记抗体,采用的是改良的过碘酸钠法进行标记;CA50抗原系列标准品以小牛血清为基质,加入CA50抗原纯品配置而成;发光底物A、B为HRP-Luminol发光体系。
6.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:标记抗体所用的标记酶是辣根过氧化酶,用的是高碘酸钠氧化法,所得酶标记抗体最佳的工作浓度是1:4000;包被有抗CA50抗体的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被;发光液A液用硼砂7.99g,硼酸3.46g,鲁米诺0.28g,对碘苯酚0.07g,加工艺用水定容至700mL,避光保存;发光底物B液由下列成分组成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,过氧化脲0.07g加工艺用水定容至700mL。
7.如权利要求4-6所述试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)标准品的配制和浓度的校正
将CA50抗原纯品,加入标准品稀释液,配制一高浓度标准品浓液,采用逐低稀释的方法稀释到各浓度,配制成0、5、20、100、250、500U/mL的系列标准品,标准品用国家标准品校正。
(2)包被
采用0.2mol/L,pH值为9.5的0.2M碳酸盐缓冲液与CA50单抗混合成抗体浓度是2μg/mL包被液,以100μL/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上,4℃孵育过夜;
(3)洗板
用PBS-T洗液洗板孔2次;
(4)封闭
封闭液包含NaCl8.00g,KCl0.20g,Na2HPO4·12H2O2.90g,KH2PO40.20g,蔗糖20.00g,proclin3001.00mL,BSA20.00g,封闭液的PH值为7.3-7.5,150μL/孔封闭,湿盒放置孵育3h;
(5)干燥
去除封闭液,过夜干燥。
(6)组装为成品
将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂,密封保存。
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