CN103018454B - 一种磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即磺胺类母核与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括：磺胺类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、磺胺类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高、检测药物种类多的特点，与传统的比色ELISA法比较，操作时间大幅度减少；可用作检测动物组织(猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝)、水产品(鱼肉、虾肉)、鸡蛋、牛奶和奶粉中17种磺胺类类药物残留检测。

Description

一种磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测磺胺类的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测动物组织(肌肉、肝脏)、水产品(鱼、虾)、鸡蛋、牛奶和奶粉中的磺胺类药物含量或残留量。属于免疫学检测领域。

背景技术

磺胺类药物的基本结构为对氨基苯磺酰胺，具有芳氨基和磺酞胺基，多为两性化合物，药物具有一定酸性。磺胺类药物的抑菌作用是由于磺胺类药物中能分解出对氨基苯磺酰胺，其分子的大小和形状与组成叶酸中的对氨基苯甲酸相近，化学性质也类似。由于细菌对二者缺乏选择性，大量的对氨基苯磺胺替代了对氨基苯甲酸而被细菌吸收，干扰细菌叶酸的合成而影响其生长繁殖，从而可抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌。磺胺类药物应用较广，具有一定疗效的就有几十种。

磺胺类药物作为兽药和饲料添加剂，在食源性动物的饲养中被广泛应用，在动物疾病的防治方面具有显著的疗效。例：针对动物的肠炎、乳房炎、肺炎、脑膜炎等疾病。同时，这类药物具有显著的毒副作用，影响人的泌尿系统功能，引起结晶尿，血尿，尿痛，尿少等症状，或产生一些皮炎、发热等过敏反应以及致癌性作用。如果这类药物不按规定或要求使用与停药，动物体内的药物残留会随着食物链影响人体的健康。因此，国内外对磺胺类药物残留均有限量要求，我国以及美国、欧盟等国家规定动物性食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量(MRLs)为0.1mg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM₂)的MRLs为0.025mg/kg。

目前，针对磺胺类兽药残留的检测方法有薄层色谱法(TLC)、高压液相色谱(HPLC)法、液质联用(HPLC/MS)、气相色谱法(GC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和毛细管电泳法(HPCE)等。由于复杂的仪器设备和繁琐的前处理过程，仪器分析方法不适合现场监控和大量样本的筛选，其中ELISA方法作为一种新型的动物源性食品中磺胺类药物残留筛选方法已被使用，但是大部分只能针对磺胺类其中一种或者少数几种药物进行检测，不利于磺胺类药物的全面检测。

化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6～18个月)等优点，其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量级。化学发光进口仪器与试剂性能较好，而国外的技术垄断导致化学发光仪、发光底物液和试剂盒价格居高不下，而且试剂或试剂盒与仪器相匹配，进口试剂常常不能在国产仪器中使用，造成化学发光免疫方法无法在基层普及。化学发光底物液是化学发光酶免疫检测方法的关键试剂，配制出低成本且性能良好，适合国产仪器使用的的发光底物液，可降低化学发光方法的使用成本，有利于在基层的普及。建立稳定的磺胺类药物多残留化学发光酶免疫检测分析方法，也是进行商品化学发光试剂盒的研制的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种磺胺类的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。

一种磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有以磺胺类药物母核与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：磺胺类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、磺胺类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液。

所述酶标板优选乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

所述酶标板的各孔包被有以磺胺类药物母核与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；其中所述包被抗原浓度优选10μg/mL。

所述磺胺类系列标准溶液从磺胺类纯品中稀释得到，稀释液为含有10％甲醇的0.05mmol/L，pH＝7.4的PBS，磺胺类标准品浓度分别是0ng/mL，1.0ng/mL，3.0ng/mL，9.0ng/mL，27.0ng/mL和81.0ng/mL，所述百分比为体积百分比。

所述磺胺类单克隆抗体是由磺胺类药物母核与牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单克隆抗体，其工作浓度优选为1∶64000。

所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O32.6g的水溶液。

所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠的溶液(CB)，pH＝9.5。

所述封闭溶液是每升洗涤溶液中含10g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也称鸡卵清白蛋白或鸡卵白蛋白，由385个氨基酸残基组成，分子量约45kDa)且加入质量为5‰NaN₃的溶液，所述百分比为质量百分比。

本发明溶液的配制：

本发明试剂盒中涉及的磺胺类标准溶液、磺胺类单克隆抗体溶液、化学发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：

1、磺胺类标准溶液：以常规方法将磺胺类药物纯品用含有10％甲醇的0.05mmol/L，pH＝7.4的PBS配制成浓度分别为0ng/mL，1.0ng/mL，3.0ng/mL，9.0ng/mL，27.0ng/mL和81.0ng/mL的磺胺类标准溶液，所属百分比为体积百分比。

2、酶标羊抗鼠抗体溶液：酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1∶2000的工作浓度。

3、磺胺类单克隆抗体溶液：磺胺类单克隆抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，将所得磺胺类单克隆抗体用洗涤溶液稀释成1∶64000的工作浓度。

4、化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。

5、浓缩磷酸盐缓冲液：NaH₂PO₄·2H₂O5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O32.6g溶于1L去离子水中。

6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0.05％将吐温-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。

7、包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH＝9.5。

8、封闭溶液配制：10gOVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN₃。

本发明酶标板的包被：

本发明中包被酶标板采用将磺胺类药物母核-OVA偶联物置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被。

本发明包被液采用的是pH＝9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的磺胺类药物母核-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被抗原浓度为10μg/mL。

包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN₃防止变质。

磺胺类单克隆抗体溶液的制备：

本发明中磺胺类单克隆抗体溶液是决定本发明中磺胺类酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。

本发明中涉及的磺胺类单克隆抗体溶液可以用洗涤溶液稀释成1∶64000的工作浓度。

按照上述磺胺类单克隆抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到0ng/mL～81.0ng/mL)和很好的灵敏度(1.0ng/mL)。

化学发光溶液的配制：

本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺-过氧化氢系统。

所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。

本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在动物性食品(如奶、奶粉、动物组织、水产品、蜂蜜、尿样)中的磺胺类药物残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为磺胺类母核半抗原合成反应式。

图2为本发明化学发光反应式。

图3为本发明磺胺类药物抗体的工作曲线。

具体实施方式

实施例1：母核半抗原、免疫原、包被原及单克隆抗体的制备

(1)磺胺母核半抗原合成：

A，于25ml单口瓶中加入6-氨基烟酸0.87g，乙醇20ml，盐酸(12mol/L)，3.7ml，加热回流，反应8h，TLC监测，反应毕，减压除去溶剂，溶于饱和NaHCO3水溶液，乙酸乙酯萃取，无水NaS2O4干燥，柱层析(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)纯化，收率85％。

B，于25ml单口瓶中加入6-氨基烟酸乙酯0.89g，Et3N1.6ml，CH2Cl210ml，搅拌溶解后，加入催化量DMAP。缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，TLC监测，5h，反应完毕，后处理，干燥，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)，收率为80％。

C，于25ml单口瓶中加入上述产物1g，2mol/LNaOH水溶液120ml，加热回流，TLC监测，反应10h，反应毕，调节PH4～5，有固体析出，收率约70％。

(2)免疫原合成

A，取12mg磺胺类母核半抗原，溶解于1mLDMF中，取15EDC用0.2ml水充分溶解后于加入(1)中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。

B，称取BSA40mg，使之充分溶解在3mLPBS(PH7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/lPBS4度透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

称取30mgOVA和12mg磺胺类母核半抗原，按上述步骤反应，合成SAs-OVA，供包被用。

(3)磺胺类单克隆抗体的制备

A，动物免疫：用上述制备出的免疫原(SAs-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/2时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，邻苯二胺(OPD)进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的磺胺类药物等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代磺胺类药物作对照，其余步骤同上。若经磺胺类阻断后的OD_450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

D，单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

实施例2：ELISA检测方法的建立

(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)

纵向用每种包被抗原按160.0μg/mL，80.0μg/mL，40.0μg/mL，20.0μg/mL，10.0μg/mL，5.0μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL的系列稀释度包被酶标板，100μL/孔，置于37℃恒温箱2h后，拍干；以150μL/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50μL/孔一系列稀释的磺胺类单克隆抗体(1∶1000至1∶512000)，再加入50μL/孔用洗涤溶液配制成1∶2000的酶标羊抗鼠抗体工作浓度。室温(20～25℃)孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；加入100μL/孔的化学发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。

(2)抗体灵敏度的测定

根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为1∶64000，包被抗原浓度为10μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：

A，包被：用0.05MpH＝9.6的碳酸盐包被溶液将包被抗原配成10μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，37℃恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍干。

B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，150μL/孔，37℃恒温箱2h然后洗板一次，拍干。

C，加样：加不同浓度的磺胺类溶液50μL/孔，再加入50μL/孔以稀释的磺胺类单克隆抗体((1∶64000)与用洗涤溶液配制成的酶标羊抗鼠抗体工作液(1∶2000)按体积比10∶1比例配置的酶-抗体溶液于以上述已封闭的反应孔中，室温(20～25℃)避光孵育15min，然后洗板五次，最后一次拍干。

D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100μL/孔，反应3min后用化学发光免疫分析仪检测。

E，检测结果以抑制率计算：

相对发光强度(％)＝RLU/RLU₀，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU₀是空白(浓度为0的标准溶液)的发光强度值。

计算50％抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。

实施例3：检测磺胺类的化学发光酶联免疫试剂盒

(1)检测磺胺类的化学发光酶联免疫试剂盒的组成

A，包被有包被原(SAs-OVA)的固相载体(酶标板)。

B，磺胺类标准溶液：0ng/mL，1.0ng/mL，3.0ng/mL，9.0ng/mL，27.0ng/mL和81.0ng/mL。

C，磺胺类抗体溶液：用人工免疫抗原(SAs-BSA)免疫动物制备所得的单克隆抗体，将所得磺胺类抗体用洗涤溶液稀释成1∶64000工作浓度。

D，发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。

E，浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O32.6g的水溶液；

F，浓缩洗涤溶液：含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

(2)酶标板的制备

用包被液将包被抗原稀释成10μg/mL，每孔加入100μL，37℃恒温箱放置2h，倾去包被液，拍干，然后每孔加入封闭液150μL，37℃恒温箱放置2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤一次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例4：检测磺胺类的化学发光酶联免疫试剂盒的应用

(1)试剂的配制

A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1∶19倍稀释后使用。

B，磷酸盐缓冲液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1∶1倍稀释后使用。

C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1∶1混匀。

(2)样品前处理

A，动物组织(猪肉、鸡肉)、水产品(鱼、虾等)：

——称取2.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入200μL0.1MNaOH，再加入3.8mL乙腈和2mL乙酸乙酯，立即振摇3min，3000g以上离心5min；

——取3mL上清液至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，加入1mL磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动10s后转入2mL离心管中，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——除去上层正己烷相，取下层水相50μL用于分析。

B，鸡蛋：

——用均质器均质鸡蛋样本，使蛋清和蛋黄充分混合；

——称取1.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入8mL乙酸乙酯，立即振摇3min，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——取4mL上清液至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动1min溶解干燥残留物，再加入1mL磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动20s，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——除去上层正己烷相，取下层水相50μL用于分析。

C，牛奶：

——移取1mL新鲜牛奶样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入8mL乙酸乙酯，立即振摇3min，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——取4mL上清液至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动1min溶解干燥残留物，再加入1mL磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动20s，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——除去上层正己烷相，取下层水相50μL用于分析。

D，奶粉：

——称取0.5.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL甲醇，用振荡器振荡5min，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——移取1mL上层有机相至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加1mL磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动30s后转入2mL离心管中，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——除去上层有机相，取下层50μL用于分析。

E，鸡肝、猪肝：

——称取2.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入200μL0.1MNaOH，再加入3.8mL乙腈和2mL乙酸乙酯，立即振摇3min，3000g以上离心5min；

——取1mL上清液至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，加入1mL磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动10s后转入2mL离心管中，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——除去上层正己烷相，取下层水相50μL用于分析。

(3)检测步骤

A，加样：加不同浓度的磺胺类溶液50μL/孔，再加入50μL/孔以稀释的磺胺类单克隆抗体((1：64000)与用洗涤溶液配制成的酶标羊抗鼠抗体工作液(1∶2000)按体积比10∶1比例配置的酶-抗体溶液于以上述已封闭的反应孔中，室温(20～25℃)避光孵育15min。

B，洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250μL，洗涤5次，拍干；

C，加发光溶液：每孔加入发光溶液100μL，反应3min；

D，检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。

(4)结果判断

所获得的标准品和样品发光值的平均值除以第一个标准((0标准)的发光值再乘以100，以抑制率为纵坐标，磺胺类浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。

相对发光强度(％)＝RLU/RLU₀，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU₀是空白(浓度为0的标准溶液)的发光强度值。

实施例5：试剂盒特异性试验

以磺胺甲氧异恶唑作为标准，设定磺胺甲氧异恶唑的交叉反应率为100％，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与磺胺甲氧异恶唑结构或者功能相似的磺胺类药物：磺胺甲氧异恶唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺多辛，磺胺喹恶啉，磺胺甲基嘧啶，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯哒嗪，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺苯酰，磺胺对甲氧嘧啶，磺胺二甲基异恶唑，酞酰磺噻唑，磺胺林，磺胺甲噻二唑，磺胺噻唑，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺硝苯。按试剂盒程序操作，但加入的竞争物分别为不同的磺胺类类似物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50％抑制浓度(IC₅₀)。交叉反应率(％CR)即为抗体对磺胺甲氧异恶唑的IC₅₀与抗体对竞争物的IC₅₀之比的百分数，按下式进行计算：

结果列于表1：

表1磺胺类试剂盒特异性试验

竞争物	IC50(ng/mL)	交叉反应率(％)
			磺胺甲氧异恶唑	2.887	100
磺胺嘧啶	3.396	85
			磺胺二甲基嘧啶	1.899	152
磺胺问二甲氧嘧啶	1.729	167
			磺胺多辛	2.291	126
磺胺喹恶啉	1.094	264
			磺胺甲基嘧啶	1.586	182
磺胺甲氧哒嗪	1.272	227
			磺胺氯哒嗪	0.925	312
磺胺间甲氧嘧啶	0.870	332
			磺胺苯酰	1.698	170
磺胺对甲氧嘧啶	0.694	416
			磺胺二甲基异恶唑	0.496	582
酞酰磺噻唑	1.444	200
			磺胺林	1.193	242
磺胺甲噻二唑	4.511	64
			磺胺噻唑	6.143	47
磺胺醋酰	12.552	23
			磺胺吡啶	72.175	4
磺胺硝苯	57.740	5

实施例6：试剂盒准确度试验

分别以不同的磺胺类药物添加猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝、鸡蛋、牛奶、奶粉、鱼肉和虾肉样本进行添加回收试验，计算不同药物在不同样本中得回收率，从而确定试剂盒的准确度，每个样本添加1个浓度，每个浓度添加6个样本，抽取3个批次试剂盒进行试验。

根据制定的标准曲线的线性方程进行平均回收率的定量计算，结果见下表2。

表2磺胺类试剂盒准确度试验

从上述测定结果看，猪肉样本的回收率在71.0～108.3％之间、鸡肉样本的回收率在81.0～99.7％之间、猪肝样本的回收率在77.1～100.0％之间、鸡肝样本的回收率在85.4～108.3％之间、鸡蛋样本的回收率在70.5～85.0％之间、牛奶样本的回收率在90.5～109.7％之间、奶粉样本的回收率在75.7～99.5％之间、鱼肉样本的回收率在85.5～99.6％之间、虾肉样本的回收率在86.0～110.0％之间。总体回收率在70～110％之间，表明本试剂盒有很好的准确度。

Claims (8)

1.一种磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有以磺胺类药物母核与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：磺胺类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、磺胺类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液，所述磺胺类的单克隆抗体是由磺胺类药物母核与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得，所述磺胺类药物母核与牛血清蛋白偶合制成的偶联物采用EDC先活化磺胺类药物母核上的羧基，再与牛血清蛋白偶联制得；所述磺胺类药物母核是由6-氨基烟酸通过化学反应得到6-氨基烟酸乙酯再与4-乙酰氨基苯磺酰氯通过系列化学反应得到，于25ml单口瓶加入6-氨基烟酸0.87g，乙醇20mL，盐酸12mol/L3.7ml，加热回流，反应8h，TLC监测，反应完毕，减压除去溶剂，溶于饱和NaHCO₃水溶液，乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，柱层析，乙酸乙酯与石油醚的体积比为2:1进行纯化，收率85％；于25mL单口瓶中加入6-氨基烟酸乙酯0.89g，Et₃N1.6ml，CH₂Cl₂10ml，搅拌溶解后，加入催化量DMAP，缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，TLC监测5h，反应完毕后处理，干燥，柱层析纯化，纯化条件为乙酸乙酯与石油醚体积比为1:10，收率80％；于25ml单口瓶中加入上述产品1g，2mol/LNaOH水溶液120ml，加热回流，TLC监测，反应10h，反应完毕，调节pH4～5，有固体析出，收率约70％。

2.根据权利要求1所述磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

3.根据权利要求1所述磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗原浓度为10μg/mL。

4.根据权利要求1所述磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述磺胺类单克隆抗体的工作浓度为1：64000。

5.根据权利要求1所述磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述磺胺类系列标准溶液浓度分别为：0ng/mL，1.0ng/mL，3.0ng/mL，9.0ng/mL，27.0ng/mL和81.0ng/mL。

6.根据权利要求1所述磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O32.6g的水溶液。

7.根据权利要求1所述磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求1所述磺胺类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。