CN103575890A - 一种莱克多巴胺的化学发光试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种莱克多巴胺（RAC）的化学发光酶联免疫（CLEIA）检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗莱克多巴胺抗体；所述试剂包括：酶标莱克多巴胺抗原浓缩液，酶标莱克多巴胺抗原稀释液，莱克多巴胺系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测动物组织（猪肉、羊肉、牛肉、肝脏）、饲料和尿液中莱克多巴胺残留检测。

Description

一种莱克多巴胺的化学发光试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测莱克多巴胺的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测动物组织（猪肉、羊肉、牛肉、肝脏）、饲料、尿液中的莱克多巴胺含量或残留量。属于免疫学检测领域。
背景技术
莱克多巴胺（Ractopamin,RAC）名雷托帕明、舒喘灵、权莱克、金莱多巴、Paylean，化学成分为1-(4-羟基苯基)-2[1-甲基-3-(4-羟基苯基)-丙氨基]-乙醇盐酸盐，分子式为C18H23NO3Cl，属于β-兴奋剂。β-兴奋剂是营养重分配剂的一种，是一类结构和功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，它能改善脂肪型动物的肉与脂肪的比例，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率，并能加速动物生长，而被添加于动物饲料中。常见的β2-兴奋剂有克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇等。随着我国对克伦特罗(俗称“瘦肉精”)监管力度的加大，克伦特罗的使用逐渐减少，其他β2-兴奋剂的使用逐渐增加。由于莱克多巴胺有类似于克伦特罗的作用，在动物组织中残留，从而对人体产生不利影响。
我国农业部、卫生部和国家药品监督管理局共同发布的176公告中明确规定，禁止在饲料中使用β2-兴奋剂药物。176公告中明确规定的此类药物除莱克多巴胺、盐酸克仑特罗外，还有沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西吗特罗、硫酸特布他林等。商务部、海关总署公告2009年第110号，公布自2009年12月9日起，禁止进出口莱克多巴胺和盐酸莱克多巴胺。因此，做好莱克多巴胺残留检测，对于保障食品安全至关重要。
目前，检测莱克多巴胺的方法主要有：微生物法、薄层色谱法( TLC)、放射免疫法，高效液相色谱法(HPLC )、色/质联用分析法(LC-MS)、液/质联用分析法(LC-MS/MS)。微生物法的缺陷是:费时而且缺乏特异性。薄层色谱法的缺陷是:操作过程复杂，时间长；操作人员需要经过专业培训;影响分析的干扰因素较多，结果重复性差。薄层色谱法、放射免疫法，高效液相色谱法、色/质连用分析法、液/质联用分析法这些理化方法的缺陷是仪器设备昂贵，样品前处理复杂，费时，费力，不易普及，检测费用高，特别是放射免疫法还需要配备放射源，有一定危险性。鉴于此，建立一种有效、快速、简单、灵敏的检测莱克多巴胺的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点，可用于动物组织（猪肉、羊肉、牛肉、肝脏）、饲料、尿液等样品中莱克多巴胺的残留量检测。
为实现上述目的，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中莱克多巴胺含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中莱克多巴胺含量越少，发光强度越高。
本发明的检测莱克多巴胺的化学发光免疫检测试剂盒含有盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂。 具体含有以下成分：
包被有抗莱克多巴胺抗体的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发光板。
应用pH=7.4 0.05 mol/L的PBS溶液稀释莱克多巴胺纯品得到的莱克多巴胺系列标准品溶液，浓度范围至少包含了0.05~4.05ng/mL的浓度区间。
酶标抗原浓缩液。是由莱克多巴胺与卵清蛋白偶合制成的人工抗原与辣根过氧化物酶偶联制备得到。
酶标抗原稀释液。pH7.6的0.01M的磷酸钠、0.25M的NaCl溶液。
发光底物液。发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。
浓缩复溶液。浓缩复溶液具体为2倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于样品前处理。
浓缩洗涤液。浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20（Tween-20）缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。
本发明溶液的配制：
本发明试剂盒中涉及的莱克多巴胺标准品溶液、酶标莱克多巴胺抗原溶液、化学发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：
1、莱克多巴胺标准溶液：以常规方法将莱克多巴胺纯品用0.05 mol/L，pH=7.4的PBS配制成浓度分别为0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL的莱克多巴胺标准溶液。
2、酶标莱克多巴胺抗原溶液：用莱克多巴胺与偶联蛋白偶联制备的人工抗原与辣根过氧化物酶偶联制备得到，将所得酶标莱克多巴胺抗原用酶标莱克多巴胺稀释液稀释成1:4000的工作浓度。
3、酶标抗原稀释液：为pH7.6的磷酸钠为0.01M、NaCl为0.25M的缓冲溶液。
4、化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。
5、浓缩复溶工作液：NaH2PO4·2H2O 5.74g、Na2HPO4·12H2O 32.6g溶于1L的去离子水中。
6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0.05%将吐温-20添加至pH=7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。
7、包被溶液：1.59 g碳酸钠和2.53 g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH=9.5。
8、封闭溶液配制：10 g BSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN3。
本发明化学发光板的包被：
本发明中包被化学发光板采用将抗莱克多巴胺抗体置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被。
本发明采用的是pH=9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的抗莱克多巴胺抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的抗体包被浓度为5.0μg/mL。
包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA，需加入NaN3防止变质。
酶标莱克多巴胺抗原溶液的制备：
本发明中酶标莱克多巴胺抗原溶液浓度是决定本发明中莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
本发明中涉及的酶标莱克多巴胺抗原溶液可以用酶标莱克多巴胺稀释液稀释成1:4000的工作浓度。
按照上述酶标莱克多巴胺抗原溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到0.05~4.05 ng/mL)和很好的灵敏度(IC50为0.065 ng/mL)。
化学发光溶液的配制：
本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺-过氧化氢系统。
所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在动物性食品(如猪肉、羊肉、牛肉、肝脏)、饲料和尿液中的莱克多巴胺残留检测中发挥重要作用。
附图说明
图1 为莱克多巴胺半抗原合成反应式。
图2 为本发明化学发光反应式。
图3 为本发明化学发光试剂盒工作曲线。
具体实施方式
实施例1：半抗原、抗原及单克隆抗体的制备
（1）莱克多巴胺半抗原合成
取莱克多巴胺1.0 g、邻苯二甲酸酐0.50 g和吡啶2 mL 加入至20mL DMSO中，混匀，在80℃下搅拌反应12小时，加热蒸除溶剂，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单莱克多巴胺酯，即为莱克多巴胺半抗原。
（2）免疫原（RAC-BSA）的合成
A，取10mg半抗原，溶解于1mL DMF中；
B，取30mg EDC和NHS用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A；
C，称取BSA50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS（PH 7.2）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h；
D，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
E，分装，于-20℃保存备用。
称取半抗原10mg和OVA 50mg，按上述步骤反应制备包被抗原，供酶标用。
（3）莱克多巴胺单克隆抗体的制备
A，动物免疫：用上述制备出的免疫原(RAC-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被化学发光板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的RAC等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的化学发光板中。同时用PBS取代RAC作对照，其余步骤同上。若经RAC阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
D，单克隆抗体制备：将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
实施例2：酶标抗原的制备
A，称取2 mg HRP溶解于0.5 mL双蒸水中；加入0.5 mL新配制的0.06 mol/L NaIO4溶液，4℃避光作用30 min；
B，加入160 m mol/L的乙二醇0.5 mL，室温作用30 min；
C，加入RAC-OVA2 mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000 mL的0.05 m mol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；
D，透析液吸至10 mL的离心管中，加0.25mL新配的5g/L NaBH4液，混匀后置4℃2 h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30 min，在4℃下3000 rpm离心25 min，弃上清；
E，将沉淀溶于1.5mL 0.02 mol/L pH 7.4 PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜(中途更换PBS 3次)；
F，将透析液中液体吸至微量离心管中，4℃下10000rpm离心30 min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。
实施例3：CLEIA检测方法的建立
(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵法)
纵向用每种包被抗体按80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 μg/mL的系列稀释度包被化学发光板，100μL/孔，置于37℃恒温箱2h后，拍干；以150μL/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50μL/孔一系列稀释的酶标RAC抗原(1:1000至1:512000)，室温（20~25℃）孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；分别加入50 μL/孔的化学发光A、B液，测定发光强度值。以发光强度值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
 (2)抗体灵敏度的测定
根据上述对包被抗体及酶标抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定酶标抗原浓度为1:4000，包被抗体浓度为5.0μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：
A，包被：用0.05 M pH=9.6的碳酸盐包被溶液将抗RAC抗体配成5.0μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板化学发光板反应孔中加100μL，37℃恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍干。
B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的化学发光板，150μL/孔，37℃恒温箱2h然后洗板一次，拍干。
C，加样：加不同浓度的莱克多巴胺标准品溶液50μL/孔，再加入50μL/孔稀释的酶标莱克多巴胺抗原(1:4000)于上述已封闭的反应孔中，室温（20~25℃）避光孵育15min，然后洗板五次，最后一次拍干。
D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100μL/孔，反应3min后用化学发光免疫分析仪检测。
E，检测结果以抑制率计算：
相对发光强度（%）=RLU/RLU0，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU0是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
实施例4：检测莱克多巴胺的化学发光酶联免疫试剂盒
(1)检测莱克多巴胺的化学发光酶联免疫试剂盒的组成
A，包被有RAC单克隆抗体的固相载体(化学发光板)；
B，莱克多巴胺标准品溶液：0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/mL。
C，浓缩酶标RAC-OVA溶液：用人工抗原（RAC-OVA）与辣根过氧化物酶偶联制备得到，使用时用稀释液稀释至工作浓度。
D，酶标RAC-OVA稀释液：磷酸钠、NaCl缓冲溶液。
E，发光溶液：A液为鲁米诺、对甲苯酚溶液，B液过氧化氢脲溶液，使用时A液、B液等体积混匀，现配现用。
F，2倍浓缩复溶液，使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
G，20倍浓缩洗涤溶液：使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
 (2)化学发光板的制备
用包被液将抗RAC单克隆抗体稀释成5.0 μg/mL，每孔加入100μL，37℃恒温箱放置2h，倾去包被液，拍干，然后每孔加入封闭液150μL，37℃恒温箱放置2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤一次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
实施例5：检测莱克多巴胺的化学发光酶联免疫试剂盒的应用
(1)试剂的配制
A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1:19倍稀释后使用。
B，复溶工作液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1:1倍稀释后使用。
C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1:1混匀。
D，酶标抗原工作液：将酶标抗原稀释液和酶标抗原浓缩液按10:1体积比混合并混匀。
 (2)样品前处理
A，尿液
取50μL清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或3000rpm以上，15℃离心10min直至清亮），暂不使用的样本应冷冻保存。
B，猪肉
称取2.0±0.05g匀浆样本至50mL聚苯乙烯离心管中；分别加入1mL 5%三氯乙酸，1 mL0.1M HCL，1 mL甲醇，振荡5min；称取2g酸性氧化铝，加入到振荡均匀的样品中；继续振荡5min；3000g以上，室温（20~25℃）离心5min；取上清液0.5mL加入0.5mL复溶工作液混匀；取50μL用于分析。
C，羊肉、牛肉、肝脏
称取2.0±0.05g匀浆样本至50mL聚苯乙烯离心管中；分别加入1mL 6%三氯乙酸，1 mL 0.1M HCL，1 mL 甲醇，振荡5min；称取2g酸性氧化铝，加入到振荡均匀的样品中；继续振荡5min；3000g以上，室温（20~25℃）离心5min；取上清液0.5mL加入0.5mL复溶工作液混匀；取50μL用于分析。
D，饲料
称取1.0±0.05g样本至50mL聚苯乙烯离心管中；称取1.0±0.05g酸性氧化铝加入到样品中；再加入4mL丙酮，6mL甲醇，振荡5min；3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；移取1mL上层有机相至10mL干净玻璃试管中，于50~60℃水浴氮气/空气流下吹干；加入1mL复溶工作液，涡动3min；取50μL用于分析。
(3)检测步骤
A，加样：加标准品/样本50μL到对应的微孔中，再加入酶标抗原工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。
B，洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤7次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；
C，加发光溶液：每孔加入新配制的发光底物100μL，震荡约30秒左右，用盖板膜盖板后室温放置3min。
D，检测：直接放入微孔板发光分析仪内测量读数。
(4)结果判断
所获得的标准品和样品发光强度值的平均值除以第一个标准(0标准)的发光强度值再乘以100，以抑制率为纵坐标，莱克多巴胺浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
相对发光强度（%）=RLU/RLU0，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU0是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
实施例6：试剂盒特异性试验
以RAC作为标准，设RAC的交叉反应率为100%，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与RAC结构或者功能相似的β2-兴奋剂药物：RAC、多巴酚丁胺、克伦特罗、特布他林、沙丁胺醇。按试剂盒步骤操作，但加入的竞争物分别为不同的莱克多巴胺类似物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50％抑制浓度(IC50)。交叉反应率(％CR)即为抗体对RAC的IC50与抗体对RAC竞争物的IC50之比的百分数，按下式进行计算：
结果列于表1：
表1    莱克多巴胺试剂盒特异性试验
竞争物 IC50（ng/mL） 交叉反应率（%）
RAC 0.065 100.0
多巴酚丁胺 6.512 1.0
克伦特罗 66.145 <0.1
特布他林 69.929 <0.1
沙丁胺醇 78.216 <0.1
实施例7：试剂盒精密度和准确度试验
分别以不同浓度的RAC添加猪肉、羊肉、牛肉、猪肝、饲料、猪尿样本进行添加回收试验，计算不同药物在不同样本中得回收率，从而确定试剂盒的准确度，每个样本添加3个浓度，每个浓度添加5个样本，抽取3个批次试剂盒进行试验。
根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算，结果见下表2。
表2    莱克多巴胺试剂盒准确度试验
从上述测定结果看，猪肉样本的回收率在74.4~82.8%之间；羊肉样本的回收率在71.8~83.3%之间；牛肉样本的回收率在74.6~84.8%之间；猪肝样本的回收率在74.7~84.6%之间；饲料样本的回收率在74.9~86.8%之间；猪尿样本的回收率在83.0~96.0%之间。总体批内变异系数在4.5~14.8%之间，批间变异系数在8.2~12.6之间。表明本试剂盒有很好的精密度和准确度。

Claims (9)

1.一种莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗莱克多巴胺抗体；所述试剂包括：酶标莱克多巴胺抗原浓缩液，酶标莱克多巴胺抗原稀释液，莱克多巴胺系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。
2.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板。
3.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述抗体包被浓度为5.0 μg/mL。
4.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标莱克多巴胺抗原的工作浓度为1:4000。
5.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述莱克多巴胺抗体是由莱克多巴胺与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。
6.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述莱克多巴胺系列标准品溶液浓度分别为：0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/mL。
7.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含NaH2PO 4·2H2O 5.74 g、Na2HPO4·12H2O 32.6 g的水溶液。
8.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH=7.4，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1所述莱克多巴胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。 
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