CN105277536A - 一种检测牛奶中三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒 - Google Patents

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陆苇
易重任
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王大敏
李乾
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Abstract

本发明公开了一种检测牛奶中三聚氰胺(MEL)的化学发光酶联免疫(CLEIA)试剂盒，其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗三聚氰胺抗体；所述试剂包括：酶标三聚氰胺抗原浓缩液，酶标三聚氰胺抗原稀释液，三聚氰胺系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、特异性好、简便快速、准确度高的特点，与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少，可用作牛奶中三聚氰胺的检测。

Description

一种检测牛奶中三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测牛奶中三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒，用于检测牛奶中三聚氰胺的含量。属于免疫学检测领域。
背景技术
三聚氰胺（Melamine），化学式C3H6N6，IUPAC命名为：1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是一种低毒、无味的纯白色单斜棱晶体，形似蛋白粉，广泛应用于塑料、染料、化肥的生产和纺织工业，含氮量高达66%，且慢性毒性不容易发现，故经常被人为地添加到食品和动物饲料中以提高N含量，从而造成蛋白质水平虚高。三聚氰胺本身低毒，但其在酸性或碱性条件下，生成三聚氰酸，三聚氰胺和其共存物三聚氰酸通过氢键在肾脏内形成不溶性结晶，动物实验结果表明，三聚氰胺的摄入可能会导致繁殖障碍、膀胱癌、慢性肾炎、肾结石，甚至是膀胱癌，长期摄入高浓度的三聚氰胺，会导致肾衰竭甚至死亡，特别是对儿童和青少年危害甚大。
联合国负责制定食品安全标准的国际食品法典委员会为牛奶中三聚氰胺含量设定了新标准，每公斤液态婴儿牛奶中三聚氰胺含量不得超过0.15毫克。我国禁止人为添加三聚氰胺到食品中，婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。
现检测三聚氰胺的方法主要有：高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法）和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法（GC-MS法），气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS法）]。
高效液相色谱（HPLC）是最常用的检测方法，具有高效、快速、灵敏度高、假阳性低等特点，定量限为2mg/kg。但该方法前处理复杂，所需仪器昂贵，操作繁琐，需要专业技术人员进行操作，不适合三聚氰胺的快速检测。
液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法），该方法灵敏度高、假阳性率低等特点，样品不需要衍生化处理，可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样品进行检测，定量限为0.01mg/kg。但存在检测仪器造价昂贵，操作步骤繁琐，对操作人员专业素养要求高等问题，难以满足现场快速检测的要求。
气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS法），灵敏度很高，假阳性率低,定量限为0.05mg/kg。该方法的主要缺点是样品需要衍生化这样复杂的前期处理。虽然经过衍生化处理的样品能在质谱中给出更多的结构信息，但是衍生化会产生多个不同的产物并导致样品的部分丢失，造成实验结果的偏差。而且检测仪器造价昂贵，操作步骤繁琐，样本前处理复杂、耗时，需要专业检测技术人员进行操作等缺点，无法满足现场快检要求。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术不足，提供一种检测牛奶中三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒，具有快速、灵敏度高、特异性好、重复性好、操作简便、检测成本低等优点，从而满足现场快速检测的要求。
本发明的另一个目的在于，提供一种牛奶中三聚氰胺的检测方法，该方法操作简单，灵敏度高、特异性好。
本发明主要利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现。化学发光免疫分析方法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，故其同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中三聚氰胺含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中三聚氰胺含量越少，发光强度越高。
本发明一种检测牛奶中三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒，包含以下成份：
包被有抗三聚氰胺抗体的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发光板。
应用pH7.0-7.50.2-0.4%NaN3,0.2-0.3mol/L硼酸盐缓冲液溶液稀释三聚氰胺纯品，得到的三聚氰胺系列标准品溶液，浓度范围至少包含了：0.01-0.81ng/ml的浓度区间。
酶标抗原浓缩液：是由三聚氰胺与牛血清蛋白偶合制成的人工抗原与辣根过氧化物酶偶联制备得到。
酶标抗原稀释液：0.01-0.02M磷酸盐缓冲液，pH7.0-8.0,0.5-1%的牛血清蛋白。
发光底物液。发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。
浓缩复溶液。浓缩复溶液具体为2倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于样品前处理。
浓缩洗涤液。浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20（Tween-20）缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。
本发明溶液的配制：
本发明试剂盒中涉及的三聚氰胺标准品溶液、酶标三聚氰胺抗原溶液、化学发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法如下：
1、三聚氰胺标准溶液：以常规方法将三聚氰胺纯品用pH=7.0-7.50.2-0.4%NaN3,0.2-0.3mol/L硼酸盐缓冲液配置，浓度分别为：0ng/ml,0.01ng/ml,0.03ng/ml,0.09ng/ml,0.27ng/ml,0.81ng/ml的三聚氰胺标准溶液。
2、酶标三聚氰胺抗原溶液：用三聚氰胺与偶联蛋白偶联制备的人工抗原与辣根过氧化物酶偶联制备得到，将所得酶标三聚氰胺抗原用酶标三聚氰胺稀释液稀释成1:4000的工作浓度。
3、酶标抗原稀释液：0.01-0.02M磷酸盐缓冲液，pH7.0-8.0,0.5-1%的牛血清蛋白。
4、化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO42.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。
5、浓缩复溶工作液：NaH2PO4·2H2O5.74g、Na2HPO4·12H2O32.6g溶于1L的去离子水中。
6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0.05%将吐温-20添加至pH7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。
7、包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH9.5。
8、封闭溶液配制：10gBSA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN3。
本发明化学发光板的包被：
本发明中包被化学发光板采用将抗三聚氰胺抗体置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被。
本发明采用的是pH9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的抗三聚氰胺抗体在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的抗体包被浓度可以从5mg/ml-20mg/ml。
包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA，需加入NaN3防止变质。
酶标三聚氰胺抗原溶液的制备：
本发明中酶标三聚氰胺抗原溶液浓度是决定本发明中三聚氰胺酶联免疫检测试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。
本发明中涉及的酶标三聚氰胺抗原溶液可以用酶标三聚氰胺稀释液稀释成1:4000的工作浓度。
按照上述酶标三聚氰胺抗原溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到0.01-0.81ng/mL)和很好的灵敏度(IC50为0.019ng/mL)。
化学发光溶液的配制：
本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺-过氧化氢系统。
所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g,无水Na2HPO42.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。
本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。
本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望对牛奶中三聚氰胺残留检测发挥重要作用。
本发明的有益效果如下：
1）本发明检测试剂盒，可对牛奶中的三聚氰胺进行特异性检测，对其他药物无交叉。
2）本发明检测时间盒检测时间短，检测时间在30min内。
3）本发明检测试剂盒，灵敏度高，对三聚氰胺的检测灵敏度可达10ng/ml。
具体实施方式
实施例1半抗原、抗原及单克隆抗体的制备
（1）三聚氰胺半抗原合成
取0.5g(3.97mmol)三聚氰胺于干燥的50ml圆底烧瓶中，加35mlDMF搅拌溶解，取0.44g(7.93mmol)KOH、0.12g无水NaI加至上述溶液中，滴加0.646ml溴乙酸叔丁酯，充分混合后，加热升温65℃反应10h。反应结束后，冷却至室温，加水稀释，用乙酸乙酯萃取，干燥，旋蒸，得黄色油状物，乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1过柱得三聚氰胺半抗原。
（2）免疫原(MEL-BSA)的合成
A，取10mg半抗原，溶解于1mLDMF中；
B，取30mgEDC和NHS用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；
C，称取BSA50mg，使之充分溶解在3.8mLpH7.0-7.50.2-0.4%NaN3,0.2-0.3mol/L硼酸盐缓冲液，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；
D，用pH7.0-7.50.2-0.4%NaN30.2-0.3mol/L硼酸盐缓冲液4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
E，分装，于-20℃保存备用。
称取半抗原10mg和BSA50mg，按上述步骤反应制备包被抗原，供酶标用。
（3）三聚氰胺单克隆抗体的制备
A，动物免疫：用上述制备出的免疫原(MEL-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被化学发光板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的MEL等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的化学发光板中。同时用硼酸盐缓冲液取代MEL作对照，其余步骤同上。若经MEL阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
D，单克隆抗体制备：将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
实施例2：酶标抗原的制备
A，称取2mgHRP溶解于0.5mL双蒸水中；加入0.5mL新配制的0.06mol/LNaIO4溶液，4℃避光作用30min；
B，加入160mmol/L的乙二醇0.5mL，室温作用30min；
C，加入MEL-OVA2mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0.05mmol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；
D，透析液吸至10mL的离心管中，加0.25mL新配的5g/LNaBH4液，混匀后置4℃2h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min，在4℃下3000rpm离心25min，弃上清；
E，将沉淀溶于1.5mL0.02mol/LpH7.0-7.50.2-0.4%NaN30.2-0.3MOL/L硼酸盐缓冲液中，吸入透析袋内，在0.02mol/LpH=7.0-7.50.2-0.4%NaN30.2-0.3mol/L硼酸盐缓冲液透析，4℃过夜(中途更换硼酸盐缓冲液3次)；
F，将透析液中液体吸至微量离心管中，4℃下10000rpm离心30min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。
实施例3：CLEIA检测方法的建立
(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵法)
纵向用每种包被抗体按100.0、50.0、25.0、12.5、6.3、3.2、1.6、0.8μg/mL的系列稀释度包被化学发光板，100μL/孔，置于37℃恒温箱2h后，拍干；以150μL/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50μL/孔一系列稀释的酶标MEL抗原(1:1000至1:512000)，室温（20~25℃）孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；分别加入50μL/孔的化学发光A、B液，测定发光强度值。以发光强度值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
(2)抗体灵敏度的测定
根据上述对包被抗体及酶标抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定酶标抗原浓度为1:4000，包被抗体浓度为5.0μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：
A，包被：用0.05MpH=9.6的碳酸盐包被溶液将抗MEL抗体配成5.0μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板化学发光板反应孔中加100μL，37℃恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍干。
B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的化学发光板，150μL/孔，37℃恒温箱2h然后洗板一次，拍干。
C，加样：加不同浓度的三聚氰胺标准品溶液50μL/孔，再加入50μL/孔稀释的酶标三聚氰胺抗原(1:4000)于上述已封闭的反应孔中，室温（20~25℃）避光孵育15min，然后洗板五次，最后一次拍干。
D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100μL/孔，反应3min后用化学发光免疫分析仪检测。
E，检测结果以抑制率计算：
相对发光强度（%）=RLU/RLU0，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU0是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
实施例4：检测三聚氰胺的化学发光酶联免疫试剂盒
(1)检测三聚氰胺的化学发光酶联免疫试剂盒的组成
A，包被有MEL单克隆抗体的固相载体(化学发光板)；
B，三聚氰胺标准品溶液：0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81ng/mL。
C，浓缩酶标MEL-OVA溶液：用人工抗原（MEL-OVA）与辣根过氧化物酶偶联制备得到，使用时用稀释液稀释至工作浓度。
D，酶标MEL-OVA稀释液：磷酸钠、NaCl缓冲溶液。
E，发光溶液：A液为鲁米诺、对甲苯酚溶液，B液过氧化氢脲溶液，使用时A液、B液等体积混匀，现配现用。
F，2倍浓缩复溶液，使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
G，20倍浓缩洗涤溶液：使用时用双蒸水稀释至工作浓度。
(2)化学发光板的制备
用包被液将抗MEL单克隆抗体稀释成5.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃恒温箱放置2h，倾去包被液，拍干，然后每孔加入封闭液150μL，37℃恒温箱放置2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤一次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
实施例5：检测三聚氰胺的化学发光酶联免疫试剂盒的应用
(1)试剂的配制
A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1:19倍稀释后使用。
B，复溶工作液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1:1倍稀释后使用。
C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1:1混匀。
D，酶标抗原工作液：将酶标抗原稀释液和酶标抗原浓缩液按10:1体积比混合并混匀。
(2)样品前处理
A，牛奶样本前处理方法：
取400μl鲜牛奶样本；加入800μl乙腈，涡动1min，取100μl上清液加500μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析，样品稀释倍数：20。
B，奶粉样本前处理方法：
称取1.0±0.05g奶粉样本至10ml离心管中，加入2.5ml去离子水，涡动1min；移取400μl于2ml离心管中，加入400μl乙腈，再加入400μl甲醇，涡动1min，3000g以上，室温(20-25℃)离心3-5min；取100μl上清液加500μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析，样品稀释倍数：20。
(3)检测步骤
A，加样：加标准品/样本50μL到对应的微孔中，再加入酶标抗原工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。
B，洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤7次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；
C，加发光溶液：每孔加入新配制的发光底物100μL，震荡约30秒左右，用盖板膜盖板后室温放置3min。
D，检测：直接放入微孔板发光分析仪内测量读数。
(4)结果判断
所获得的标准品和样品发光强度值的平均值除以第一个标准(0标准)的发光强度值再乘以100，以抑制率为纵坐标，三聚氰胺浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
相对发光强度（%）=RLU/RLU0，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU0是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
实施例6：试剂盒特异性试验
以MEL作为标准，设MEL的交叉反应率为100%，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与MEL结构或者功能相似的药物：三聚氰酸、三嗪、三嗪二胺。按试剂盒步骤操作，但加入的竞争物分别为不同的三聚氰胺类似物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50％抑制浓度(IC50)。交叉反应率(％CR)即为抗体对MEL的IC50与抗体对MEL竞争物的IC50之比的百分数，按下式进行计算：
结果列于表1：
表1三聚氰胺试剂盒特异性试验
药物名称 交叉反应率
三聚氰胺 100%
三聚氰酸 <1%
三 嗪 <1%
三嗪二胺 <1%
实施例7：试剂盒精密度和准确度试验
准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。
按照实施例5的样本提取方法，以1.0ng/g(ml)、2.0ng/g(ml)两个浓度的三聚氰胺分别对牛奶、奶粉样本进行添加回收，每种样本每个浓度各4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度。实验结果见下表。
表2三聚氰胺试剂盒准确度和精密度测定ng/g(ml)
从表可知，牛奶、奶粉样品中三聚氰胺两个浓度均添加的平均回收率范围在90.7-99.1％之间，批内、批间均变异系数小于15％。

Claims (9)

1.一种检测牛奶中三聚氰胺的化学发光酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述化学发光板的各孔包被有抗三聚氰胺抗体；所述试剂包括：酶标三聚氰胺抗原浓缩液，酶标三聚氰胺抗原稀释液，三聚氰胺系列标准品溶液，化学发光底物A、B液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。
2.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光板。
3.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述抗体包被浓度为5.0μg/mL。
4.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标三聚氰胺抗原的工作浓度为1:4000。
5.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述三聚氰胺抗体是由三聚氰胺与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。
6.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述三聚氰胺系列标准品溶液浓度分别为：0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81ng/mL。
7.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩复溶液具体为浓缩磷酸盐缓冲液，是每升含NaH2PO4·2H2O5.74g、Na2HPO4·12H2O32.6g的水溶液。
8.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.0-7.5,0.2-0.4%NaN3,0.2-0.3mol/L硼酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1所述三聚氰胺的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO42.82g，0.75%的过氧化氢脲0.64mL的水溶液，所述百分比为质量百分比。
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