CN108508215A - 一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有四环素类药物半抗原‑载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述微孔试剂中冻干有荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体。本发明还提供了该试纸条的制备方法及应用上述试纸条检测样品中四环素类药物的方法。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能够实现对大批量样品中四环素类药物的快速检测和现场监控。

Description

一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其 制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全中非法添加物检测领域，具体涉及一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

技术背景

四环素类药物(TCs)具有广谱高效的杀菌抗生功效，可以与大多数药物或饲料添加剂混用，已被广泛应用于畜禽生产中。但过量使用不可避免地造成了严重的药物残留，成为严重危害人类健康的食品安全隐患之一，为此世界各国对TCs残留的检测十分关注。我国规定了牛奶中土霉素、四环素、金霉素残留限量为100μg/L；欧盟第675/92号令中初步规定在肌肉及牛奶中的四环素族化合物的总量不得超过100μg/kg，在肾脏、肝脏及鸡蛋中分别不得超过600μg/kg、300μg/kg及200μg/kg；日本肯定列表制度规定奶和鸡蛋中四环素类化合物的总量分别不得超过100ng/mL和400ng/mg。因此，加强对四环素类药物检测技术的研究和快速检测技术的发展是非常有必要的。

目前，检测四环素类药物比较经典的方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。另外，目前常用的还有酶联免疫法(ELISA)。但由于以上方法均需先进的检测仪器，检测费用昂贵、步骤繁琐耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。胶体金免疫层析法具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优点，是目前国内外检测四环素类药物的主要监控方法，但仍存在一些缺陷，如稳定性较差、灵敏度较低、无法实现定量检测、基质效应明显背景干扰大，且颜色单一，难以实现多检和联检。

荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。但是相比胶体金等传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点。

发明内容

本发明的一个目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、操作简便、检测快速、价格低廉的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条；本发明的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法；本发明的再一个目的是提供上述试纸条在检测四环素类药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采取的一个技术方案是：

提供一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，它包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述微孔试剂中冻干有荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体。

所述四环素类药物单克隆抗体是以四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物是由四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述四环素类药物半抗原是由四环素与N-(4-氨苯基)马来酰亚胺反应得到，其分子结构式为：

所述荧光微球是直径为100～300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团，所述荧光物质为镧系元素。

本发明采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条的方法，它包括如下步骤：

1)微孔试剂的制备：用荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后放于微孔中，经真空冷冻干燥后备用；

2)硝酸纤维素膜的制备：将四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；

3)组装和剪切：在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度，配套微孔试剂即为时间分辨荧光免疫层析试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)将四环素与N-(4-氨苯基)马来酰亚胺反应，制备四环素类药物半抗原；

2)将四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联，制备四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌四环素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)分别将四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜的检测区范围(T)和质控区范围(C)；

6)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH 7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

7)用荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后放于微孔中，经真空冷冻干燥后备用；

8)在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度，配套微孔试剂即为时间分辨荧光免疫层析试纸条。

本发明采取的另一个技术方案是提供一种上述检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条在检测四环素类药物中的应用，它包括如下步骤：

1)样品前处理；

2)用所述的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条进行检测；

3)用荧光检测仪分析检测结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)特异性强、灵敏度高：本试纸条采用将荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体冻干在微孔试剂中，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，降低成本，增加整个体系的反应灵敏度。

(2)时间分辨荧光具有较大stock位移，减少了由激发光引起的特异杂散光对检测的干扰，提高荧光检测稳定性；其寿命长，消除了环境中荧光物质对待测物的干扰；其激发波长较宽，发射光谱范围较窄，降低了本底荧光强度，提高了分辨率。

(3)荧光微球表面包裹了聚苯乙烯，实现了对荧光物质镧系元素的保护，减少了外界环境的干扰，增加了荧光微球的稳定性及荧光寿命。

(3)荧光微球表面修饰活性基团—COOH，采用化学偶联的方法来标记抗体，形成抗体与微球的稳定结合。

附图说明

图1为时间分辨荧光免疫层析试纸剖面结构示意图；

图2为时间分辨荧光免疫层析试纸俯视图；

图3为微孔试剂图；

图4为四环素类药物半抗原合成路线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条的构成

一、试纸(图1、图2)

所述试纸包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

所述样品吸收垫1、硝酸纤维素膜2和吸水垫3依次按顺序搭接粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

所述硝酸纤维素膜上固定有检测区4和质控区5，检测区喷涂有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物(四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物)，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体；

所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸。

二、微孔试剂(图3)

所述微孔试剂7中冻干有荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体，所述微孔试剂具有微孔塞8。

将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。

实施例2检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备

检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)微孔试剂的制备：用荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后放于微孔中，经真空冷冻干燥后备用；

2)硝酸纤维素膜的制备：将四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；

3)组装和剪切：在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度，配套微孔试剂即为时间分辨荧光免疫层析试纸条。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

四环素类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

(1)四环素类药物半抗原的合成

N-(4-氨苯基)马来酰亚胺0.25g，加水2mL，加1mol/L盐酸3.98mL，搅拌，溶解澄清，0～5℃搅拌30min，加亚硝酸钠0.11g，继续搅拌2h，得到重氮盐溶液A液；取四环素0.5g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，0～5℃搅拌4h；停止反应，用6mol/L盐酸调节pH到7，加乙酸乙酯100mL×3，萃取三次，合并有机相，浓缩蒸干，无水乙醇重结晶，得到四环素类药物半抗原。

(2)免疫原的制备——四环素类药物半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成

取牛血清白蛋白(BSA)100mg，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液8mL溶解，加二硫苏糖醇6.9mg，室温搅拌4h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到蛋白活化液A液；取四环素类药物半抗原37mg，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)2mL溶解，得到B液；将B液滴加到A液中，室温搅拌24h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到四环素类药物半抗原-牛血清白蛋白偶联物(免疫原)，-20℃保存，备用。

(3)包被原的制备——四环素类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成

取卵清蛋白(OVA)50mg，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液4mL溶解，加二硫苏糖醇4.2mg，室温搅拌4h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到蛋白活化液A液；取四环素类药物半抗原17mg，加DMF 1mL溶解，得到B液；将B液滴加到A液中，室温搅拌24h，0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3d，每天换液3次，得到四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物(包被原)，-20℃保存，备用。

(4)四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定

将四环素类药物半抗原、载体蛋白、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到四环素类药物半抗原、载体蛋白、四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。

2、四环素类药物单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

3、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

4、荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体的制备

(1)活化：取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于900μL活化缓冲液中，于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬微球于1mL活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温震荡活化10min；

(2)偶联：将(1)所述混悬液于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入10～20μL四环素类药物单克隆抗体溶液(蛋白浓度1mg/mL)，混匀后室温震荡偶联120min；

(3)封闭：将(2)所述混悬液于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬于封闭缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温震荡封闭30min；

(4)贮存：将(3)所述混悬液于4℃10000r/min离心10min后弃上清，重悬于贮存缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。

所述活化缓冲液为pH 5.5～6.5、0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液。

所述活化剂为水溶性碳二亚胺，其中摩尔质量比EDC∶NHS∶COOH＝(1.5～3)∶(8～20)∶1，临用前用活化缓冲液稀释至所需浓度。

所述偶联缓冲液为pH 7.5～8.5、0.05mol/L的硼酸盐缓冲液(避免使用存在游离胺的溶剂)。

所述封闭缓冲液为含0.1～0.4mol/L伯胺(盐酸羟胺、乙醇胺或氨基乙醇)、1％～10％BSA的pH 7.4的PB缓冲液。

所述贮存缓冲液为含0.01％NaN₃、0.1％BSA的pH 7.4的PB缓冲液。

5、将荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体冻干到微孔试剂上

将贮存的荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体以贮存缓冲液稀释后，向微孔试剂微孔板中加入50μL，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体的微孔试剂，密封保存。

6、硝酸纤维素(NC)膜的制备

用0.05mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液将四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到100μg/mL，用Isoflow点膜仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其喷涂于NC膜上的质控区(C)，喷膜量为1.0μL/cm。将制备好的NC膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

7、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH 7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h，备用。

(二)试纸条的组装

将样品吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样品吸收垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用机器切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。

将试纸卡与微孔试剂组装成四环素类药物时间分辨荧光免疫层析试纸条，在2～8℃阴凉避光干燥保存，有效期为12个月。

实施例3检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条的应用

1、样品前处理

准确称取1g±0.01g组织样品至10mL离心管中，加入3mL样本提取液，涡动2min充分混匀；3000r/min离心5min，取上清(若有上层漂浮物则拨开取上清)待检。

2、用试纸条检测

用微量移液器准确吸取100μL待检样品溶液于微孔中，小心抽吸至充分与微孔中试剂混匀，室温(20～25℃)作用3min；吸取孔内混合液全部量(约100μL)垂直滴加于试纸卡加样孔(S孔)中，液体流动时开始计时，室温反应5min；将试纸卡插入KFT-100A型荧光检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下“开始检测”按键，荧光检测仪将自动对试纸卡进行扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取或打印检测结果。

3、检测结果分析

(1)定量检测

测试完成后，仪器获得试纸卡上检测区时间分辨荧光强度与质控区时间分辨荧光强度的比值，基于预先内置的试纸卡上检测区时间分辨荧光强度与质控区时间分辨荧光强度的比值与四环素类药物浓度的关系曲线，获得待测样品提取液中四环素类药物的含量，最后经换算即得待测样品中四环素类药物的含量。

(2)半定量检测

测试完成后，仪器将根据检测得到的检测区时间分辨荧光强度与质控区时间分辨荧光强度的比值，自动计算出提取液中四环素类药物的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。

阴性(－)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示样本中不含有四环素类药物或其浓度低于检测限。

阳性(+)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示样本中四环素类药物浓度等于或高于检测限。

无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸卡已失效。

实施例4样品检测实例

1、检测限试验

向空白猪肉、鸡肉样品中分别添加四环素类药物标准品至终浓度为：四环素15、30、60μg/kg，金霉素30、60、120μg/kg，土霉素20、40、80μg/kg，强力霉素40、80、160μg/kg，用时间分辨荧光免疫层析试纸条进行检测，结果为：四环素浓度为15μg/kg，金霉素浓度为30μg/kg，土霉素浓度为20μg/kg，强力霉素浓度为40μg/kg时，荧光检测仪结果显示为阴性；四环素浓度为30、60μg/kg，金霉素浓度为60、120μg/kg，土霉素浓度为40、80μg/kg，强力霉素浓度为80、160μg/kg时，荧光检测仪结果显示为阳性，表明本试纸条对猪肉、鸡肉等动物组织样品中四环素类药物的检测限为：四环素30μg/kg、金霉素60μg/kg、土霉素40μg/kg、强力霉素80μg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取空白猪肉、鸡肉样品，及添加四环素类药物至检测限浓度的阳性猪肉、鸡肉样品各20份，用3个批次生产的时间分辨荧光免疫层析试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1。

表1检测阳性、阴性样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样品时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测阴性样品时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条可以对动物组织样品中四环素类药物残留进行快速检测。

3、特异性试验

用检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条检测500μg/L的磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、氯霉素等药物，结果全为阴性。说明本试纸条对500μg/L的磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、氯霉素等药物无交叉反应，特异性较好。

Claims (5)

1.一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：所述微孔试剂中冻干有荧光微球标记的四环素类药物单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体；所述四环素类药物单克隆抗体是以四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物是由四环素类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述四环素类药物半抗原是由四环素与N-(4-氨苯基)马来酰亚胺反应得到，其分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光微球是直径为100～300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团。

3.根据权利要求2所述的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光物质为镧系元素。

4.一种权利要求1-3任一项所述的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)微孔试剂的制备：用荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后放于微孔中，经真空冷冻干燥后备用；

2)硝酸纤维素膜的制备：将四环素类药物半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；

3)组装和剪切：在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度，配套微孔试剂即为时间分辨荧光免疫层析试纸条。

5.一种权利要求1-3任一项所述的检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条的应用，其特征在于：包括以下步骤：

1)样品前处理；

2)用权利要求1-3任一项所述的时间分辨荧光免疫层析试纸条进行检测；

3)用荧光检测仪分析检测结果。