CN114014774A - 一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。本发明的氟胺酮人工半抗原最大程度地保留了氟胺酮的特征结构，且经过化学修饰具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可获得氟氨酮人工抗原；进一步制备获得的氟胺酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗氟胺酮抗体；该抗原抗体可用于免疫层析技术，具有灵敏度高、特异性强、易于操作、经济快速等优点，可用于氟氨酮滥用的初筛。

Description

一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
氟胺酮（F-Ketamine）化学名称为2-邻氟苯基-2-甲胺基环己酮，与氯胺酮同属苯环己哌啶类物质，分子结构也与氯胺酮高度相似。初步药理实验表明氟胺酮具有与氯胺酮类似的麻醉活性，是一种新的麻醉活性物质。其临床特征有僵直状、浅镇静、遗忘、显著镇痛、进入梦境、出现幻觉等。
近年来，国内氯胺酮的来源越来越少，而氟胺酮作为其代替品被吸毒人员滥用，国内各地陆续都有查到含该物质成分的疑似毒品。2020年有关机构共检出含氟胺酮的样品79份，占新精神活性物质样品总数的比例达28.5%，是检出比例最高的单一物质。因此对该物质检测的需求与日剧增。
目前，对氟胺酮的检测主要依靠气相色谱-质谱联用法（GC-MS)、液相色谱四级杆飞行时间质谱仪（Q-TOF LC/MS）、核磁共振氢谱（H NMR）、核磁共振碳谱（13C NMR）、核磁共振氟谱（19F NMR）、红外光谱（IR）等方法，但都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作的缺点，不能达到现代检测对快速、准确的要求。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。
免疫层析试纸快速检测技术则可以弥补以上所有缺点，该技术具有特异性强、灵敏度高、简便、经济等特点。它不需要专业技能和昂贵复杂的仪器设备即可实现对抗原、半抗原、抗体等各种分析物的定性和半定量检测。它广泛应用于激素、肿瘤标记物、兽药、农药、毒品等物质的检测。因此有必要提供一种有效的氟氨酮人工抗原、氟氨酮多克隆抗体的制备方法。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中对氟胺酮的检测方法均存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作的缺点，提供了一种氟胺酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用以克服上述不足之处。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种氟胺酮人工半抗原，
其分子结构式如（Ⅰ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
本发明中的氟胺酮人工半抗原是在氟胺酮的基础上，在氟胺酮的亚氨基上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能较大程度地保留氟胺酮的特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点。
与采用环状的连接臂相比，本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可能的降低免疫时T细胞对连接臂识别度，这样免疫得到的抗体对氟胺酮的特异性和亲合力更强。
作为优选，所述氟胺酮人工半抗原的分子结构式如（Ⅰ-Ⅰ）所示：
Figure 931637DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅰ-Ⅰ）。
本发明中的优选的氟胺酮人工半抗原中采用具有戊二酸结构的连接臂，经过筛选之后发现，这种戊二酸结构的连接臂其具有更好的反应活性，同时在与蛋白载体偶联制备成人工抗原后，其效价更强，对于氟胺酮的检测更为灵敏。
一种氟胺酮人工半抗原的制备方法，
包括以下步骤：以游离的氟氨酮和二酸酐为原料，进行反应，得到氟氨酮人工半抗原。
本发明中的所涉及到的氟胺酮人工半抗原的制备方法的关键因素在于在氟氨酮分子结构的仲胺基团上引入具有羧基的活性手臂。本发明在经过多种合成方案筛选后，选着采用二酸酐作为原料，通过酸酐基团与氨基之间的缩合反应制备得到，本发明中的这种制备方法具有工艺简单有效，无需高温高压的制备条件。
作为优选，游离的氟氨酮与二酸酐的摩尔比为1: (1～3)；
反应温度为90~110℃，反应时间为15~24h。
作为优选，所述游离的氟氨酮的制备方法如下：将氟氨酮盐酸盐溶于纯化水中，并调节溶液至碱性，经有机溶剂萃取分离后，得到游离的氟氨酮。
进一步优选，氟氨酮溶于水后使用氨水调节氟氨酮盐酸盐溶液的pH值，pH值在8.0~10.0之间。
进一步优选，氨水调节氟氨酮盐酸盐溶液的pH=9。
一种氟胺酮人工抗原，
其分子结构式如（Ⅱ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（Ⅱ）；
其中，式（Ⅱ）中，BSA为牛血清蛋白；n的范围为1~4。
进一步优选，氟胺酮人工抗原的分子结构式如（Ⅱ-Ⅰ）所示：
Figure 520881DEST_PATH_IMAGE004
（Ⅱ-Ⅰ）。
一种氟胺酮人工抗原的制备方法，
所述氟胺酮人工抗原通过所述的氟胺酮人工半抗原与牛血清蛋白偶联得到。
本发明选用的牛血清蛋白（BSA）作为大分子载体，与其他载体蛋白相比，具有以下优点：①BSA具有583个氨基酸残基，较容易与氟胺酮半抗原发生偶联，可制得不同偶联比的氟胺酮人工抗原，且具有较高的免疫原性；②BSA经济实惠，成本低；③BSA的化学性质比较稳定，在酸性和弱碱性的环境下也有很好的溶解度和稳定性，适合长期储存。
作为优选，所述制备方法具体包括：
（a）将氟胺酮人工半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺溶于有机溶剂中，发生反应，得到含有活化的氟胺酮人工半抗原的反应液；
（b）将含有活化的氟胺酮人工半抗原的反应液滴加到牛血清蛋白溶液中，发生偶联反应，得到氟胺酮人工抗原。
作为优选，所述步骤（a）中：氟胺酮人工半抗原Ⅰ、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺三者的摩尔比为1∶(1.35~1.5)∶(1.35~1.5)；室温搅拌反应12~24h；
所述步骤（b）中：反应温度为3~6℃，反应时间10~18h。
进一步优选，本发明中牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于磷酸根离子浓度为0.01mol/L的PBS（pH=7.2-7.4）缓冲液中制成的。
进一步优选，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5。
本发明还提供了所述抗氟胺酮人工抗原在对体液样本或者组织样本中氟胺酮进行免疫检测中的应用。
本发明还提供了所述氟胺酮人工抗原在制备抗氟胺酮抗体中的应用。
一种抗氟胺酮抗体，其为由所述氟胺酮人工抗原经动物免疫得到的、可与氟胺酮发生特异性免疫反应的球蛋白。
试验发现，将所述氟胺酮人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1∶80000。表明本发明的氟胺酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗氟胺酮抗体，该抗氟胺酮抗体可用于氟胺酮的免疫检测和分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的氟胺酮人工半抗原最大程度地保留了氟胺酮的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的氟胺酮人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗氟胺酮抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1∶80000，可用于对氟胺酮进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为本发明实施例1中氟胺酮人工抗原Ⅱ-Ⅰ的制备流程图；
其中BSA表示牛血清蛋白，下同。
图2为本发明氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的液相色谱图；
其中，mAU表示毫吸光度单位，min表示分钟。
图3为本发明氟胺酮半抗原Ⅰ-Ⅰ的ESI-MS分析谱图；
其中，Intens.表示信号强度；m/z表示质荷比。
图4为牛血清蛋白（BSA）、氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅰ、氟胺酮人工抗原Ⅱ-Ⅰ的紫外扫描图；
其中，Abs表示紫外-可见吸收光谱，WL表示波长。
图5为本发明实施例2中氟胺酮人工抗原Ⅱ-Ⅱ的制备流程图。
图6为本发明实施例3中氟胺酮人工抗原Ⅱ-Ⅲ的制备流程图。
图7为对比例1氟胺酮人工抗原Ⅳ的制备流程图。
图8为对比例2氟胺酮人工抗原Ⅴ的制备流程图；
其中，BGG表示牛丙种球蛋白，下同。
图9为对比例3氟胺酮人工抗原Ⅵ的制备流程图。
图10为对比例4氟胺酮人工抗原Ⅶ的制备流程图。
图11为对比例5氟胺酮人工抗原Ⅷ的制备流程图。
图12为对比例6氟胺酮人工抗原Ⅸ的制备流程图。
图13为对比例7氟胺酮人工抗原Ⅹ的制备流程图。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图1），包括以下步骤：
人工半抗原的制备：
①称取氟氨酮盐酸盐200mg（0.777mmol）溶于20ml纯化水中，逐滴加入氨水调节溶液pH=9，此时溶液为白色浊液，用20ml*3的二氯甲烷萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤、减压蒸干得无色油状物A 165mg（0.747mmol）；
对该无色油状物A进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯：石油醚=1∶1（v/v），产物Rf =0.3。
②将上步无色油状物A165mg（0.747mmol）溶于5ml吡啶中，加入一颗搅拌子，再加入170mg（1.491mmol）戊二酸酐，在100℃的油浴中搅拌回流反应18小时；
反应结束，减压蒸干溶剂，用10ml无水乙醇共沸。加入30ml二氯甲烷溶解残渣，再用20ml*3纯化水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤、减压蒸干得棕黑色油状物，薄层色谱（层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10：8：1：1（v/v），洗脱剂为无水乙醇，产物Rf=0.3）分离产物得棕黄色油状物163mg（0.487mmol），即氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅰ。
对该棕黄色油状物Ⅰ-Ⅰ进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10：8：1：1（v/v），产物Rf=0.3；
氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的液相色谱图见图2（紫外检测器，波长268nm）。
从图2可以得出经过纯化得到的氟胺酮人工半抗原的纯度达到99.9%以上。
氟胺酮半抗原Ⅰ的ESI-MS分析谱图见图3。从图3可以看出本实施例1得到的氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅰ的分子离子峰的质荷比（m/z）为335，与其理论分子量吻合，可以确定步骤②得到的最终化合物就是本发明所设计的氟胺酮人工半抗原。
（2）氟胺酮人工抗原的制备：
③将163mg（0.487mmol）氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅰ置于50ml单口圆底烧瓶中，加入8.15ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，再加入76mg（0.657mmol）N-羟基琥珀酰亚胺和135mg（0.657mmol）二环己基碳二亚胺，20℃搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑤称取200mg牛血清蛋白溶于40ml步骤④的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑥在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到⑤的牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析7次，透析结束后，离心取上清液即得到人工抗原Ⅱ-Ⅰ：氟胺酮-牛血清蛋白偶联物。
氟胺酮人工抗原Ⅱ-Ⅰ制备前后的紫外扫描图见图4。其中，曲线a为氟胺酮人工半抗原的紫外扫描图，曲线b为氟胺酮人工抗原的紫外扫描图，曲线c为牛血清蛋白的紫外扫描图。氟胺酮人工半抗原的最大吸收波长为268nm，氟胺酮人工抗原的最大吸收波长为272nm，与氟胺酮半抗原、牛血清蛋白相比，氟胺酮人工抗原的最大吸收波长和吸光度都出现明显变化，说明氟胺酮半抗原与牛血清蛋白偶联成功。
实施例2
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图5），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①与实施例1相同。
②将上步无色油状物A183mg（0.826mmol）溶于5ml吡啶中，加入一颗搅拌子，再加入82.6mg（0.826mmol）丁二酸酐，在90℃的油浴中搅拌回流反应24小时；
反应结束，减压蒸干溶剂，用10ml无水乙醇共沸。加入30ml二氯甲烷溶解残渣，再用20ml*3纯化水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤、减压蒸干得棕黑色油状物，薄层色谱（层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10：8：1：1（v/v），洗脱剂为无水乙醇，产物Rf=0.3）分离产物得棕黄色油状物178mg（0.553mmol），即氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅱ。
（2）氟胺酮人工抗原的制备：
③将178mg（0.553mmol）氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅱ置于50ml单口圆底烧瓶中，加入8.15ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，再加入86mg（0.747mmol）N-羟基琥珀酰亚胺和153mg（0.747mmol）二环己基碳二亚胺，20℃搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④~⑦与实施例1相同，最终制备得到人工抗原Ⅱ-Ⅱ。
实施例3
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图6），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①与实施例1相同。
②将上步无色油状物A173mg（0.782mmol）溶于5ml吡啶中，加入一颗搅拌子，再加入300mg（2.346mmol）己二酸酐，在110℃的油浴中搅拌回流反应15小时；
反应结束，减压蒸干溶剂，用10ml无水乙醇共沸。加入30ml二氯甲烷溶解残渣，再用20ml*3纯化水洗涤有机相，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤、减压蒸干得棕黑色油状物，薄层色谱（层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10：8：1：1（v/v），洗脱剂为无水乙醇，产物Rf=0.3）分离产物得棕黄色油状物183mg（0.525mmol），即氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅲ。
（2）氟胺酮人工抗原的制备：
③将183mg（0.525mmol）氟胺酮人工半抗原Ⅰ-Ⅲ置于50ml单口圆底烧瓶中，加入8.15ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，再加入91mg（0.788mmol）N-羟基琥珀酰亚胺和162mg（0.788mmol）二环己基碳二亚胺，20℃搅拌反应20小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④~⑦与实施例1相同，最终制备得到人工抗原Ⅱ-Ⅲ。
对比例1
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图7），包括以下步骤：
（1）人工半抗原的制备：
①称取氟氨酮盐酸盐200mg（0.777mmol）溶于20ml纯化水中，逐滴加入氨水调节溶液pH=9，此时溶液为白色浊液，用20ml*3的二氯甲烷萃取，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤、减压蒸干得无色油状物A160mg（0.724mmol）；
对该无色油状物A进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯：石油醚=1∶1（v/v），产物Rf =0.3。
②将上步无色油状物A160mg（0.724mmol）用16ml丙酮溶解于50ml单口圆底烧瓶中，加入碳酸钾250mg（1.810mmol），再加入对溴甲基苯甲酸甲酯332mg（1.448mmol），置于70℃油浴中搅拌回流16小时；
结束反应，将反应液冷却至室温，过滤、减压蒸干溶剂得黄色油状物。加入30ml纯化水和30ml二氯甲烷萃取，水相再用30ml*2二氯甲烷萃取，收集有机相，分别用50ml纯化水和50ml饱和的食盐水洗，取有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤、减压蒸干得灰白色固体389mg，薄层色谱（层析液为乙酸乙酯：石油醚=1∶1（v/v），洗脱剂为无水乙醇，产物Rf=0.7）分离得黄色油状物B189mg（0.512mmol）。
对该黄色油状物B进行TLC检测，层析液为乙酸乙酯：石油醚=1∶1（v/v），产物Rf =0.7；
③将黄色油状物B189mg（0.512mmol）溶于5.7ml甲醇和5.7ml四氢呋喃中，再加入18.9ml1N的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应16小时；
结束反应，用1N的盐酸调节溶液的pH=3，此时有大量的白色沉淀产生，用30ml*3的乙酸乙酯萃取，收集有机相，分别用30ml纯化水和30ml饱和的食盐水洗，用无水硫酸镁干燥，过滤、减压蒸干得黄色油状物Ⅲ156mg（0.439mmol）即氟胺酮人工半抗原Ⅲ。
对该黄色油状物进行TLC检测，层析液为二氯甲烷：95%乙醇：1，4-二氧六环：氨水=10：8：1：1（v/v），产物Rf =0.4；
（2）氟胺酮人工抗原的制备。
④将156mg（0.439mmol）氟胺酮人工半抗原置于50ml圆底烧瓶中，加入7.8ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，再加入68mg（0.593mmol）N-羟基琥珀酰亚胺和122mg（0.593mmol）二环己基碳二亚胺，25℃搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑥称取0.195g牛血清蛋白溶于39ml 步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原Ⅳ：氟胺酮-牛血清蛋白偶联物。
对比例2
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图8），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①～③分别与对比例1相同。
(2) 氟胺酮人工抗原的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与氟胺酮人工半抗原Ⅲ进行偶联，偶联步骤与对比例1④～⑧相同，得到氟胺酮人工抗原Ⅴ。
对比例3
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图9），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①～③分别与对比例1相同。
(2) 氟胺酮人工抗原的制备：
④称取150mg(0.423mmol) 氟胺酮人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入7.5mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入59μL(0.423mmol)三乙胺和55μL(0.423mmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
⑤-⑧分别与对比例1相同；得到氟胺酮人工抗原Ⅵ。
对比例4
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图10），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①～③分别与对比例1相同。
(2) 氟胺酮人工抗原的制备：
④与对比例3相同。
⑤称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑥称取0.25g牛丙种球蛋白溶于50ml 步骤⑤的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑦在快速搅拌下，将步骤④的上清液缓慢滴加到牛丙种球蛋白溶液中，上清液与牛丙种球蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑧将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤⑤的PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液即得到氟胺酮人工抗原Ⅶ。
对比例5
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图11），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①~②分别与实施例1相同。
（2）氟胺酮人工抗原的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与氟胺酮人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与实例1③～⑦相同，得到氟胺酮人工抗原Ⅷ。
对比例6
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图12），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①~②分别与实施例1相同。
（2）氟胺酮人工抗原的制备：
③称取200mg(0.45mmol) 氟胺酮人工半抗原Ⅲ置于50ml圆底烧瓶中，加入10mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入62μL(0.45mmol)三乙胺和59μL(0.45mmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应18小时，反应结束后离心，取上清液，备用。
④称取14.5g（0.0405mol）十二水磷酸氢二钠，43.875g（0.75mol）氯化钠，1.495g（0.00958mol）二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到磷酸根离子浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液，pH为7.4。
⑤称取0.25g牛血清蛋白溶于50ml 步骤④的PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的牛血清蛋白溶液。
⑥在快速搅拌下，将步骤③的上清液缓慢滴加到牛血清蛋白溶液中，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
⑦将人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤④的PBS缓冲液透析7次，透析结束后离心取上清液即得到氟胺酮人工抗原Ⅸ。
对比例7
本实施一种氟胺酮人工抗原的制备方法（反应历程如图13），包括以下步骤：
(1) 氟胺酮人工半抗原的制备：
①~②分别与实施例1相同。
（2）氟胺酮人工抗原的制备：
采用牛丙种蛋白作载体，与氟胺酮人工半抗原Ⅰ进行偶联，偶联步骤与对比例6③～⑦相同，得到氟胺酮人工抗原Ⅹ。
氟胺酮人工抗原的性能测定
（1）氟胺酮人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的氟胺酮人工半抗原Ⅰ和Ⅲ溶液，通过紫外扫描图可知氟胺酮半抗原Ⅰ和Ⅲ的最大吸收波长为，在最大吸收波长处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数（即摩尔吸收系数）的计算公式为：ε=吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、160μg/ml、200μg/ml的牛血清蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将人工抗原溶液（用PBS缓冲液配制）按一定比例稀释，在655nm处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将偶联物（即氟胺酮人工抗原）用PBS稀释到100μg/ml，在272nm处测得吸光值A1，以PBS为空白测得吸光值A2，则偶联比率γ为：γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)。
其中ε为摩尔吸光系数（L/mol)，65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3 为牛丙种球蛋白浓度（g/L）。
采用牛丙种球蛋白作为载体时，偶联比的计算式为：
γ=[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000)，其中，150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3 为牛丙种球蛋白浓度（g/L）。
表1 各氟胺酮人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表1可见，人工半抗原的结构，人工半抗原的活化方法以及载体蛋白的种类对人工半抗原与载体蛋白交联时的结合比都是有影响的。
（2）动物免疫
将制备的各氟胺酮人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法检测其效价，检测结果见表2。
表2 各免疫血清的效价检测结果
Figure 736837DEST_PATH_IMAGE006
由表2可见，与实施例1~3相比，利用各对比例氟胺酮人工抗原进行动物免疫获得的免疫血清，其效价均偏低，不能用于免疫分析中。而利用氟胺酮人工抗原Ⅱ进行动物免疫获得的免疫血清，其效价达1∶80000，完全可用于免疫分析中，能为氟胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。

Claims (10)

1.一种氟胺酮人工半抗原，其特征在于，
其分子结构式如（Ⅰ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅰ）
其中：n的范围为1~4。
2.一种如权利要求1所述氟胺酮人工半抗原的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：以游离的氟氨酮和二酸酐为原料，进行反应，得到胺酮人工半抗原。
3.根据权利要求2所述的氟胺酮人工半抗原的制备方法，其特征在于，
游离的氟氨酮与二酸酐的摩尔比为1: (1～3)；
反应温度为90~110℃，反应时间为15~24h。
4.一种氟胺酮人工抗原，其特征在于，
其分子结构式如（Ⅱ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
（Ⅱ）；
其中，式（Ⅱ）中，BSA为牛血清蛋白；n的范围为1~4。
5.一种如权利要求4所述氟胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于，
所述氟胺酮人工抗原通过权利要求1中所述的氟胺酮人工半抗原与牛血清蛋白偶联得到。
6.根据权利要求5所述氟胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于，
所述制备方法具体包括：
（a）将氟胺酮人工半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺溶于有机溶剂中，发生反应，得到含有活化的氟胺酮人工半抗原的反应液；
（b）将含有活化的氟胺酮人工半抗原的反应液滴加到牛血清蛋白溶液中，发生偶联反应，得到氟胺酮人工抗原。
7.根据权利要求6所述氟胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于，
所述步骤（a）中：氟胺酮人工半抗原Ⅰ、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺三者的摩尔比为1∶(1.35~1.5)∶(1.35~1.5)；室温搅拌反应12~24h；
所述步骤（b）中：反应温度为3~6℃，反应时间10~18h。
8.权利要求4所述抗氟胺酮人工抗原在对体液样本或者组织样本中氟胺酮进行免疫检测中的应用。
9.权利要求4所述氟胺酮人工抗原在制备抗氟胺酮抗体中的应用。
10.一种抗氟胺酮抗体，其特征在于，其为由权利要求4所述氟胺酮人工抗原经动物免疫得到的、可与氟胺酮发生特异性免疫反应的球蛋白。
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