CN103804491B - 1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂 - Google Patents
1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及1,5-脱水山梨醇免疫检测领域，具体涉及一种1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂。本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。本发明的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，特异性高，与1,5-脱水山梨醇的结合力强，敏感度远高于现有的抗1,5-脱水山梨醇抗体。本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原及抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体用于制备1,5-脱水山梨醇检测试剂，可以方便、准确地确定样品中的1,5-脱水山梨醇含量。
Description
技术领域
本发明涉及1,5-脱水山梨醇免疫检测领域，具体涉及一种1,5-脱水山梨醇免疫原及其特异性抗体及检测试剂。
背景技术
1,5-脱水山梨醇（1,5-anhydro glucitol，1,5-AG），其结构式如式（III）所示：
1,5-脱水山梨醇(1,5-anhydro glucitol，1,5-AG)又称为1,5-脱水葡萄糖醇，是一种具有吡喃环结构的六碳单糖。1,5-AG的结构与葡萄糖十分相似，两者区别仅在于葡萄糖C-1位置上的羟基被氢所取代。1,5-AG主要存在于人体血液、脑脊液及各组织器官中，血清中1,5-AG浓度一般为12-40mg/L，其代谢较稳定。当患有糖尿病时血清1,5-AG浓度会显著降低，其机理是：糖尿病患者大量葡萄糖由尿中排出竞争性的抑制了1,5-AG经肾小管的重吸收，使1,5-AG大量经尿排出，导致血液中1,5-AG浓度下降，且下降程度与糖尿病的严重程度显著相关。研究表明：血液中1,5-AG与葡萄糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbAlc)、果糖胺(FMN)都呈显著的负相关，其水平可反映近一周内的血糖和尿糖情况，是糖尿病诊断与治疗的灵敏指标，日本于上世纪九十年代初就把1,5-AG作为糖尿病诊断和疗效检测的重要指标。此外，1,5-AG还有其它多种临床应用价值，例如，1,5-AG能反映餐后高血糖峰值，可作为非糖尿病人群监测餐后高血糖相关的心血管危险发生率的指标；血浆或尿中的1,5-AG浓度还能很好的反映慢性肾功能衰竭病人的肾小管重吸收功能，因为1,5-AG重吸收系统比葡萄糖重吸收系统更容易受损。
检测1,5-脱水山梨醇的方法有很多，如高效液相色谱法、微柱层析法、化学发光法等，各有其优缺点。其中高效液相色谱法操作比较复杂，且试剂需现用现配，不能长期保存，因此不适合大批量临床检测使用；微柱层析法、化学发光法均需昂贵的专用仪器，操作繁琐，也不适合用于临床常规检验。目前适用于自动化分析仪的1,5-AG测定方法主要是酶法，包括ADP-HK-NADPH方法和GK-PROD方法。但是，现有的酶法测定试剂盒成本较高、价格昂贵，且大多为干粉试剂，稳定性、灵敏度、特异性等方面均不能满足临床检验的要求。
直接用1,5-脱水山梨醇免疫动物无法获得抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的1,5-脱水山梨醇检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种免疫原性强的1,5-脱水山梨醇免疫原。
本发明的另一个目的在于提供使用本发明1,5-脱水山梨醇免疫原制备得到的特异性强的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。
本发明的另一个目的在于提供一种1,5-脱水山梨醇衍生物。
本发明的再一个目的在于提供一种1,5-脱水山梨醇免疫原的制备方法。
本发明的又一个目的在于提供一种1,5-脱水山梨醇免疫原及抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体在制备1,5-脱水山梨醇检测试剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
1,5-脱水山梨醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：
式中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n是1至20之间的整数，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。
前述的1,5-脱水山梨醇免疫原，R为-(CH2)4-COO-。
一种抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，由所述的1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物后生产得到。
前述的一种抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，所述的抗体为完整的抗体分子，或者为，保留与1,5-脱水山梨醇特异性结合的能力的抗体片段或抗体衍生物。
一种1,5-脱水山梨醇衍生物，其结构式如式（II）所示：
上述R为连接基团-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
1,5-脱水山梨醇免疫原的制备方法，由载体和所述的1,5-脱水山梨醇衍生物连接而成，取n=4时，其特征在于：1,5-脱水山梨醇衍生物的制备步骤如下：
n=4时，1,5-脱水山梨醇衍生物的制备在合成化合物4时选用了1-溴戊酸乙酯为合成原料，故所得的最终产物1,5-脱水山梨醇衍生物的链接基团R为-(CH2)4-COO-，选用其它1-溴戊酸乙酯类似物进行实验时，除n取值不同外，合成方法完全一致。
前述的1,5-脱水山梨醇免疫原的制备方法，载体与1,5-脱水山梨醇衍生物的连接步骤为：
（1）将载体蛋白200mg溶解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；
（2）将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的1,5-脱水山梨醇衍生物、3.5ml二甲基酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
（3）将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到1,5-脱水山梨醇免疫原。
1,5-脱水山梨醇免疫原及抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体在制备1,5-脱水山梨醇检测试剂中的应用。
本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。免疫原性高与所合成的1,5-脱水山梨醇衍生物分子结构及所选载体种类有关，现有技术中1,5-脱水山梨醇免疫原的免疫原性较弱，所产抗体的特异性、与1,5-脱水山梨醇的结合力，敏感度都不如本发明。
本发明的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，特异性高，与1,5-脱水山梨醇的结合力强，敏感度远高于现有的抗1,5-脱水山梨醇抗体。
本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原及抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体用于制备1,5-脱水山梨醇检测试剂，可以方便、准确地确定样品中的1,5-脱水山梨醇含量。
附图说明
图1是1,5-脱水山梨醇ELISA检测反应曲线；
图2是1,5-脱水山梨醇均相酶免疫反应曲线。
具体实施方式
本发明所采取的技术方案是：
1,5-脱水山梨醇免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：
式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。优选的，载体为具有免疫原性的蛋白质。免疫原性载体一般是蛋白质或多肽；虽然其他足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但通常情况下选用蛋白质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。
R优选为-(CH2)n-COO-，n是1至20之间的整数，特别的，R为-(CH2)4-COO-。
一种抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，由上述1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物后生产得到。
本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子，也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以是为多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过现有技术制备得到。获得多克隆抗体的典型方法是使用单一的免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制作。
一种1,5-脱水山梨醇检测试剂，含有上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体、1,5-脱水山梨醇酶标偶联物和酶的底物。
1,5-脱水山梨醇检测试剂盒，含有上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体以及检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体和1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂。
指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指示试剂由1,5-脱水山梨醇酶标偶联物和酶的底物所组成。
优选的，上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
下面结合实施例，进一步说明本发明。
实施例一：1,5-脱水山梨醇衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的1,5-脱水山梨醇衍生物化学结构如式（IV）所示：
该1,5-脱水山梨醇衍生物的合成路线如下：
具体的合成步骤如下：
化合物2的合成
1）称取3.2g（19.5mmol）化合物1（1,5-脱水山梨醇），溶解于100mL二甲基甲酰胺（DMF）中，在氮气（N2）保护下加入12g（300mmol）NaH（纯度60%w/t，溶于矿物油中），将此混合物冷却到0℃，逐滴加入20mL(170mmol)溴化苄（BnBr），室温下搅拌16小时后，缓慢加入100mL甲醇（MeOH），然后加入110mL纯化水，再用HCl(4M)将此溶液的pH值调节至中性；
2）将上述溶液用二氯甲烷（CH2Cl2）萃取，使用水冲洗有机相，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，所得产物通过硅胶柱层析法（流动相：PE/EtOAc=10:1）进行纯化，最后得到8g绿色油状的化合物2，产率78%。
化合物3的合成
1）称取7.0g（13.4mmol）化合物2溶解于185mL干燥的甲苯中，在氮气（N2）保护下逐滴加入140mL二异丁基氢化铝（DIBAL，1M溶于甲苯中），将此混合物温度增加到50℃并搅拌2小时，将溶液放置于冰上，加入185mL HCl（1M），并快速搅拌此混合物30分钟；
2）将上述混合物用乙酸乙酯（EtOAc）稀释后，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取水相，使用卤水冲洗结合的有机相，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，所得产物与甲基叔丁基醚/己烷（MTBE/hexane）一起搅拌，最后得到4.2g白色非晶形固体化合物3，产率75%。
化合物4的合成
1）称取3.8g（8.9mmol）化合物3，溶解于20mL二甲基甲酰胺（DMF）中，在氮气（N2）保护下加入1.78g（43.8mmol）NaH（纯度60%w/t，溶于矿物油中），将此混合物在室温下搅拌1小时，在0℃下逐滴加入7.42g（35.5mmol）1-溴戊酸乙酯，然后再将此混合物在室温下搅拌1小时；
2）将上述混合物用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用卤水冲洗有机相，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，所得产物通过硅胶柱层析法（流动相：PE/EtOAc=10:1）进行纯化，最后得到3.6g无色油状的化合物4，产率75%。
化合物5的合成
1）称取2.6g（4.7mmol）化合物4加入40mL2N的NaOH水溶液中，再加入5mL乙醇，制成混合物，将此混合物回流搅拌2小时；
2）将上述反应混合物冷却至室温后用稀盐酸酸化，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用卤水冲洗有机层，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，最后得到2.3g化合物5，产率93%。
1,5-脱水山梨醇衍生物的合成
1）称取2.3g（4.3mmol）化合物5、1g钯/碳（Pd/C,10%）溶解于50mL甲醇中制成混合物，将此混合物于50℃下搅拌过夜；
2）将上述混合物过滤，再将滤液浓缩得到1g1,5-脱水山梨醇衍生物，产率88%，纯度>98%。
n=4时，1,5-脱水山梨醇衍生物的制备在合成化合物4时选用了1-溴戊酸乙酯为合成原料，故所得的最终产物1,5-脱水山梨醇衍生物的链接基团R为-(CH2)4-COO-，选用其它1-溴戊酸乙酯类似物进行实验时，除n取值不同外，合成方法完全一致。
对上述所得纯化产物进行结构鉴定
1、利用Varian III plus300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(300MHz,CD3OD):δ3.84-3.89(m,1H),3.57-3.72(m,1H),3.40-3.57(m,4H),3.22-3.34(m,4H),3.13(t,J=4.5Hz,1H),2.28(t,J=7.2Hz,2H),1.57-1.69(m,4H)。表征为式（Ⅲ）所示的1,5-脱水山梨醇衍生物。
2、利用色谱/质谱技术（LCMS）对得到的衍生物进行分析鉴定，采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：Welchrom XB-C18(50×4.6mm,5μm)，柱温为30℃，流速为1.5mL/min，检测波长为214nm，流动相为95%水(TFA)-5%乙腈（CH3CN）～40%水(TFA)-60%乙腈（CH3CN），6min，最后在此条件下持续0.5min。LCMS结果显示：纯度>98%，保留时间：2.063min，分子量：264，分子离子：265([M+H]+)。
综合上述结果，可以确定该最终所得化合物为式（IV）所示的1,5-脱水山梨醇衍生物。
实施例二：BSA-1,5-脱水山梨醇衍生物免疫原的合成
BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原由牛血清白蛋白BSA与式（II）所示的1,5-脱水山梨醇衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n=4为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
（1）将牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（200mg）溶解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；
（2）将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的1,5-脱水山梨醇衍生物、3.5ml二甲基酰胺（dimethylformamide，DMF）、3.5ml乙醇、7.0ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS），将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
（3）将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到1,5-脱水山梨醇免疫原。
类似的，n取1～20范围内的其他整数时，用同样的方法可以制备出如式（I）所示的1,5-脱水山梨醇免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。
本发明中仅提供连接基团R为-(CH2)n-COO-，且n=4的1,5-脱水山梨醇衍生物的合成实施例并进行了相关后续实验，由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的1,5-脱水山梨醇衍生物分子结构及所选载体种类有关，因此理论上n取1至20之间的任意整数时，实验结果并无显著差异，使用不同n值的1,5-脱水山梨醇衍生物制备的1,5-脱水山梨醇免疫原均具备强免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有优异性能。
实施例三：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的制备
将上述制得的BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
对上述实验动物兔取血，分离纯化得到抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，经测定，该抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的效价为1:30000。
实施例四：1,5-脱水山梨醇ELISA检验
采用制得的抗体进行1,5-脱水山梨醇的ELISA检验。
该检验是利用竞争性免疫分析法来测定液体样本中的1,5-脱水山梨醇含量。
样本中的1,5-脱水山梨醇与偶联的1,5-脱水山梨醇衍生物（HRP-1,5-脱水山梨醇衍生物酶偶联物）竞争结合包被在酶联板中抗体上的有限位点。如果液体样本中几乎没有或没有1,5-脱水山梨醇，HRP酶偶联的1,5-脱水山梨醇衍生物就会与酶标板中的抗体结合。相反的，如果液体样本中含有大量或一定数量的1,5-脱水山梨醇，那么酶-1,5-脱水山梨醇衍生物偶联体就会减少与抗体的结合，从而使显色信号减弱。因此，检验产生的吸光度与液体样本中的1,5-脱水山梨醇含量成反比。其剂量效应曲线如图1所示。
实施例五：1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检验
采用制得的抗体进行1,5-脱水山梨醇的均相酶免疫检验（Homogeneous Enzyme Immunoassay）。
该检验是一种竞争性反应，反应体系中与抗体结合的1,5-脱水山梨醇和游离的1,5-脱水山梨醇不需要通过固相来分离。该检验的基本原理是，液体样本中游离的1,5-脱水山梨醇与偶联在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH）上的1,5-脱水山梨醇衍生物对特异性抗体的结合位点进行竞争。液体样本中的1,5-脱水山梨醇竞争性的取代与抗体结合的1,5-脱水山梨醇酶偶联物，并使其从抗体的结合位点上释放出来，从而使酶恢复活性。因此，液体样本中1,5-脱水山梨醇的含量越多，游离的1,5-脱水山梨醇衍生物-G6PDH酶偶联物就越多，从而能得到更强的信号。
其均相酶免疫检验得到的剂量效应曲线如图2所示。
实施例六：药物干扰试验
选取45种常见药物，调整浓度至10.0μg/ml，进行干扰试验测定。常见的45种药物以及测定结果具体参见表1。
表1常见干扰药物测定结果
测定结果：上述45种常见药物等价于1,5-脱水山梨醇的浓度均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗1,5-脱水山梨醇的特异性抗体。需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (2)
1.1,5-脱水山梨醇免疫原的制备方法，由载体和1,5-脱水山梨醇衍生物连接而成，1,5-脱水山梨醇衍生物的结构式如式(II)所示：
上述R为连接基团-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数；
取n＝4时，其特征在于：1,5-脱水山梨醇衍生物的制备步骤如下：
2.根据权利要求1所述的1,5-脱水山梨醇免疫原的制备方法，其特征在于，载体与1,5-脱水山梨醇衍生物的连接步骤为：
(1)将载体蛋白200mg溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；
(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的1,5-脱水山梨醇衍生物、3.5ml二甲基酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到1,5-脱水山梨醇免疫原。
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| CN102757391A (zh) * | 2012-08-01 | 2012-10-31 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 一种苯巴比妥衍生物及其制备方法和应用 |
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