CN104447619A - 一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原及其制备方法，属于生物化工技术领域。本发明将氢氯噻嗪溶解于甲醇，加入碳酸钾后，与6-溴已酸乙酯反应，萃取分离得氢氯噻嗪半抗原。将氢氯噻嗪半抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到氢氯噻嗪完全抗原。实验结果表明，用本发明的氢氯噻嗪完全抗原免疫动物得到的抗血清效价可达81000，检测限为0.01ng/mL，半抑制浓度0.1ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体具有广阔的应用前景。

Description

一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原及其制备方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
氢氯噻嗪为利尿药、抗高血压药，其结构如化学式Ⅰ所示。主要适用于心原性水肿、肝原性水肿和肾性水肿：如肾病综合征、急性肾小球肾炎、慢性肾功能衰竭以及肾上腺皮质激素与雌激素过多引起的水肿；高血压；尿崩症。在降压类药物、保健食品中非法添加氢氯噻嗪，造成化学药品的用法用量无法控制，容易造成药物滥用带来的不良反应，甚至造成药害，国家明令禁止在中成药和保健食品中添加化学成分。患者在不知情的情况下服用，也会影响医生正确指导患者用药。
 
化学式Ⅰ
目前我国氢氯噻嗪片的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是氢氯噻嗪检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。
本发明的氢氯噻嗪半抗原是在氢氯噻嗪的亚氨基一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的氢氯噻嗪羧基衍生物，该衍生物为氢氯噻嗪半抗原，将氢氯噻嗪半抗原与载体蛋白偶联，形成氢氯噻嗪完全抗原。
发明内容
本发明的目的是针对现有的检测技术的空白，提供一种氢氯噻嗪半抗原和完全抗原的制备方法，使得制备高特异性的氢氯噻嗪单克隆抗体成为可能。
本发明的技术方案，一种氢氯噻嗪半抗原，结构简式如下：。
所述氢氯噻嗪半抗原制备的完全抗原，将氢氯噻嗪半抗原化合物与载体蛋白偶联后得到氢氯噻嗪完全抗原；
所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种。
所述氢氯噻嗪半抗原的制备方法，步骤为：取氢氯噻嗪0.24mmol，溶解于20mL二甲基甲酰胺DMF中，加入碳酸钾0.48mmol，混匀，再加入6-溴已酸乙酯0.48mmol，60℃回流反应12h，再加入20mL超纯水和20mL乙酸乙酯，分离有机相；用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得氢氯噻嗪半抗原。
氢氯噻嗪半抗原其合成路线的反应方程式为：
。
所述氢氯噻嗪完全抗原的制备方法，步骤为：
（1）氢氯噻嗪半抗原的活化：将氢氯噻嗪半抗原用DMF溶解，加入NHS、EDC，其中氢氯噻嗪半抗原︰NHS︰EDC的摩尔比为1︰1.5︰1.5，在4℃下搅拌反应6h，再在室温25℃下反应12h；
（2）载体蛋白的溶解：取载体蛋白，其中氢氯噻嗪半抗原︰载体蛋白的摩尔比为80︰1，用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的载体蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的比例为5︰1；
（3）氢氯噻嗪完全抗原的制备：将步骤（1）所得活化的氢氯噻嗪半抗原溶液慢速滴加到步骤（2）所得载体蛋白溶液中；室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。
所述氢氯噻嗪完全抗原的另一种制备方法，步骤为：
（1）氢氯噻嗪半抗原的活化：将氢氯噻嗪半抗原用DMF溶解，0℃预冷30min，0℃下加入三正丁胺和氯甲酸异丁酯，其中氢氯噻嗪半抗原︰三正丁胺︰氯甲酸异丁酯的摩尔比为1︰2︰2，在0℃反应1h；
（2）载体蛋白的溶解：取载体蛋白，其中氢氯噻嗪半抗原︰载体蛋白的摩尔比80︰1，用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的载体蛋白浓度大于3mg/mL；
（3）氢氯噻嗪完全抗原的制备：在0℃条件下，将步骤（1）所得活化的氢氯噻嗪半抗原溶液在0℃条件下慢速滴加到步骤（2）所得载体蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。
所述氢氯噻嗪完全抗原的应用，将氢氯噻嗪完全抗原免疫动物得到多克隆抗体和/或单克隆抗体，用于检测氢氯噻嗪。
本发明的有益效果：本发明是新型的氢氯噻嗪完全抗原合成方法，氢氯噻嗪完全抗原呈现出的特异性的氢氯噻嗪抗原决定簇，使得筛选出高特异性的氢氯噻嗪单克隆抗体成为可能。
实验结果表明，用本发明的氢氯噻嗪完全抗原免疫动物得到的抗血清效价可达81000，检测限为0.01ng/mL，半抑制浓度为0.1ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测中成药和保健食品中的氢氯噻嗪含量。
附图说明
图1氢氯噻嗪完全抗原紫外光谱图。
具体实施方式
下述实例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 氢氯噻嗪半抗原的制备
氢氯噻嗪71mg（约0.24mmol），溶解于20mL二甲基甲酰胺（DMF），加入66mg碳酸钾(约0.48mmol)，混匀，再加入107μL 6-溴已酸乙酯（约0.48mmol）60℃回流反应12h，加入20mL超纯水和20mL乙酸乙酯，分离有机相。用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得氢氯噻嗪半抗原。
实施例2 氢氯噻嗪完全抗原的制备
取15mg氢氯噻嗪半抗原，加入2mL DMF溶解，再分别加入NHS，EDC（氢氯噻嗪半抗原、NHS、EDC的摩尔比为1︰1.5︰1.5），4℃下条件下搅拌反应6h，再在室温下反应12h。取30mg牛血清蛋白（氢氯噻嗪半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80︰1），加入6mL 0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5︰1。将活化的氢氯噻嗪半抗原溶液慢速滴加到载体蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。
实施例3 氢氯噻嗪完全抗原的制备
取15mg氢氯噻嗪半抗原，加入2mL DMF溶解，0℃预冷30min。0℃下，分别加入三正丁胺, 氯甲酸异丁酯（氢氯噻嗪半抗原、三正丁胺、氯甲酸异丁酯的摩尔比为1︰2︰2），0℃搅拌反应1h。取30mg牛血清蛋白（氢氯噻嗪半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80︰1），加入6mL 0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL。在0℃条件下，将活化的氢氯噻嗪半抗原溶液慢速滴加到载体蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。
实施例4 氢氯噻嗪抗血清的制备
以实施例2制得的氢氯噻嗪抗原为免疫原，选用6-8周龄，雌性BALB/C小鼠为免疫动物，采用弗氏佐剂进行免疫，免疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。
实施例5 氢氯噻嗪抗血清的测定
一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：
（1）包被：将实施例3中的氢氯噻嗪抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从0.5μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h；洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清从1︰1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入100μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
（7）结果判读：以OD450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测
具体操作步骤如下：
用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
（1）包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法；
（3）配制氢氯噻嗪标准溶液：将氢氯噻嗪标准品用DMF溶液配制成5mg/mL的母液，然后，在加样前再用0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度；
（4）加样：每孔加入50μL倍比稀释的氢氯噻嗪各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；
（5）显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
（7）数据处理：以氢氯噻嗪各浓度的对数为横坐标，以氢氯噻嗪各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50，即OD450值从零标准溶液对应的A0下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对氢氯噻嗪是否具有特异性。

Claims (6)

1.一种氢氯噻嗪半抗原，其特征在于结构简式如下：
。
2.用权利要求1所述氢氯噻嗪半抗原制备的完全抗原，其特征在于：将氢氯噻嗪半抗原化合物与载体蛋白偶联后得到氢氯噻嗪完全抗原；
所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种。
3.权利要求1所述氢氯噻嗪半抗原的制备方法，其特征在于步骤为：取氢氯噻嗪0.24mmol，溶解于20mL二甲基甲酰胺DMF中，加入碳酸钾0.48mmol，混匀，再加入6-溴已酸乙酯0.48mmol，60℃回流反应12h，再加入20mL超纯水和20mL乙酸乙酯，分离有机相；用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得氢氯噻嗪半抗原。
4.权利要求2所述氢氯噻嗪完全抗原的制备方法，其特征在于步骤为：
（1）氢氯噻嗪半抗原的活化：将氢氯噻嗪半抗原用DMF溶解，加入NHS、EDC，其中氢氯噻嗪半抗原︰NHS︰EDC的摩尔比为1︰1.5︰1.5，在4℃下搅拌反应6h，再在室温下反应12h；
（2）载体蛋白的溶解：取载体蛋白，其中氢氯噻嗪半抗原︰载体蛋白的摩尔比为80︰1，用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的载体蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5︰1；
（3）氢氯噻嗪完全抗原的制备：将步骤（1）所得活化的氢氯噻嗪半抗原溶液慢速滴加到步骤（2）所得载体蛋白溶液中；室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。
5.权利要求2所述氢氯噻嗪完全抗原的另一种制备方法，其特征在于步骤为：
（1）氢氯噻嗪半抗原的活化：将氢氯噻嗪半抗原用DMF溶解，0℃预冷30min，0℃下加入三正丁胺和氯甲酸异丁酯，其中氢氯噻嗪半抗原︰三正丁胺︰氯甲酸异丁酯的摩尔比为1︰2︰2，在0℃搅拌反应1h；
（2）载体蛋白的溶解：取载体蛋白，其中氢氯噻嗪半抗原︰载体蛋白的摩尔比80︰1，用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的载体蛋白浓度大于3mg/mL；
（3）氢氯噻嗪完全抗原的制备：在0℃条件下，将步骤（1）所得活化的氢氯噻嗪半抗原溶液在0℃条件下慢速滴加到步骤（2）所得载体蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到氢氯噻嗪完全抗原。
6.权利要求2所述氢氯噻嗪完全抗原的应用，其特征在于：将氢氯噻嗪完全抗原免疫动物得到多克隆抗体和/或单克隆抗体，用于检测氢氯噻嗪。
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