CN104892445A - 一种高特异性的金刚烷胺人工抗原的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种高特异性的金刚烷胺人工抗原的制备方法及应用，属于生物化工技术领域。本发明将金刚烷胺，6-溴已酸加入到甲苯中，氮气保护下升温至130℃回流48h；减压浓缩，加水，水相用盐酸调pH后加乙酸乙酯萃取，饱和NaCl溶液洗涤，干燥浓缩得产品半抗原。将半抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到人工抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达81000，检测限为0.1ng/mL，半抑制浓度为1ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体具有广阔的应用前景。

Description

一种高特异性的金刚烷胺人工抗原的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高特异性的金刚烷胺人工抗原的制备方法及应用，属于生物化工技术领域。

背景技术

金刚烷胺可以抑制病毒繁殖，临床上用于预防和治疗各种A 型流感病毒的感染。但由于经济利益驱使和疫病防控的压力，我国目前家禽饲养中存在滥用金刚烷胺的现象。金刚烷胺的残留蓄积会对食用者产生嗜睡、失眠、眩晕、抑郁、恶心等症状；2012 年12 月，央视调查中称，一些养殖户为进一步缩短养殖周期，让原本已经是速成品种的白羽鸡长得更快，偷偷喂食违禁药物，其中包括金刚烷胺等抗病毒药品。“速成鸡”事件的爆发引发了全国消费者对禽肉食品安全的广泛关注和担忧，对建立快速、灵敏、准确的检测技术提出了迫切需求。目前，对金刚烷胺的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）、质谱法（MS）等，但是存在仪器昂贵，检测费时的缺陷，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。

免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。

金刚烷胺分子结构式为：

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种新型的金刚烷胺半抗原和人工抗原合成方法及其应用，使得制备高特异性的金刚烷胺单克隆抗体成为可能。

本发明的技术方案，一种小分子化合物，其结构简式如式I所示：

式I 。

一种高特异性的金刚烷胺人工抗原，是由所述小分子化合物（式I）与载体蛋白的偶联产物。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种。

所述小分子化合物（式I）的制备方法，步骤为：将金刚烷胺0.66mmol，6-溴已酸0.8mmol加入到甲苯中，氮气保护下升温至130℃回流48h；减压浓缩，加水10 mL，水相用盐酸调pH 2-3后加乙酸乙酯萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤，干燥浓缩得产品。

所述高特异性的金刚烷胺人工抗原的制备方法，步骤如下：

（1）金刚烷胺半抗原（I）的制备：将式I所示小分子化合物，用超纯水溶解，然后取NHS、EDC，使式I所示小分子化合物、NHS、EDC三者的摩尔比依次为1: 2: 2，在室温25℃下搅拌反应12h，得到金刚烷胺半抗原（I）；

（2）活化：按金刚烷胺半抗原（I）与载体蛋白的摩尔比为80:1配料，用0.1M pH 9.6 碳酸盐缓冲液溶解，使得溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，得到活化的金刚烷胺半抗原（I）溶液；

（3）金刚烷胺人工抗原的制备：将活化的金刚烷胺半抗原（I）溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到金刚烷胺人工抗原。

所述高特异性的金刚烷胺人工抗原的又一种制备方法，步骤如下：

（1）金刚烷胺半抗原（Ⅱ）的制备：将式I所示小分子化合物，用超纯水溶解，然后取三正丁胺, 氯甲酸异丁酯，使式I所示小分子化合物、三正丁胺、氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1.5: 1.5,  0℃反应1h，得金刚烷胺半抗原（Ⅱ）；

（2）活化：按金刚烷胺半抗原（Ⅱ）与载体蛋白的摩尔比为60:1配料，用 0.1M pH 9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，使得溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，得到活化的金刚烷胺半抗原（Ⅱ）溶液；

（3）金刚烷胺人工抗原的制备：在0℃条件下，将活化的金刚烷胺半抗原（Ⅱ）溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到金刚烷胺人工抗原。

所述的高特异性的金刚烷胺人工抗原的应用，将其免疫动物得到金刚烷胺抗体。

所述高特异性的金刚烷胺人工抗原的应用，所述金刚烷胺抗体在检测金刚烷胺中的应用。

上述金刚烷胺半抗原或人工抗原化合物在制备金刚烷胺抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

上述金刚烷胺人工抗原化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

上述金刚烷胺半抗原或人工抗原化合物或抗体在检测金刚烷胺中的应用也属于本发明保护的范围。

本发明的有益效果：本发明是全新的金刚烷胺抗原合成方法，人工抗原呈现出的特异性的金刚烷胺抗原决定簇，使得筛选出高特异性的金刚烷胺单克隆抗体成为可能。

实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达81000，检测限为0.1ng/mL，半抑制浓度为1ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的金刚烷胺的残留。

附图说明

图1 金刚烷胺人工抗原合成路线图。

图2 金刚烷胺抗原电泳图。1、实施例2 EDC 方法合成免疫原；2、实施例3混合酸酐方法合成免疫原。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 一种小分子化合物（即金刚烷胺半抗原）的制备

将金刚烷胺（100mg，0.66mmol），6-溴已酸（130mg，0.8mmol）加入到甲苯中，氮气保护下升温至130℃回流48h。减压浓缩，加水（10 mL），水相用盐酸调pH 2-3后加乙酸乙酯萃取，饱和NaCl溶液洗涤，干燥浓缩得金刚烷胺半抗原产品。

实施例2 金刚烷胺人工抗原的制备（EDC 方法合成免疫原）

取10mg金刚烷胺半抗原，加入2mL 超纯水溶解，再分别加入NHS，EDC（半抗原、NHS、EDC的摩尔比为1: 2: 2），室温下混匀，在室温25℃下反应12h。 取25mg 牛血清白蛋白（半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1），加入5mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液。将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到金刚烷胺人工抗原。

实施例3 金刚烷胺人工抗原的制备（混合酸酐方法合成免疫原）

取9mg金刚烷胺半抗原，加入2mL超纯水溶解。0℃下，分别加入三正丁胺, 氯甲酸异丁酯（半抗原、三正丁胺、氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1.5: 1.5），0℃反应1h。取30mg 牛血清白蛋白（半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为60:1），加入5mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液，0℃预冷30min。在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到金刚烷胺人工抗原。

实施例4 金刚烷胺抗血清的制备

以实施例3制得的抗原为免疫原，选用6-8周龄，雌性BALB/C小鼠为免疫动物，采用弗氏佐剂进行免疫，免疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。

实施例5 金刚烷胺抗血清的测定

一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：

（1）包被：将实施例3中的抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL /孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。

二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测

具体操作步骤如下：

用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD₄₅₀值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。

（1）包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL /孔，37℃反应2h；

（2）洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法；

（3）配金刚烷胺标准溶液：将金刚烷胺标准品用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液配制成5mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度；

（4）加样：每孔加入50μL倍比稀释的金刚烷胺各浓度标准品，然后再加入50μL /孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反应1h；

（5）显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）数据处理：以金刚烷胺各浓度的对数为横坐标，以金刚烷胺各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC₅₀，即OD₄₅₀值从零标准溶液对应的A₀下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对金刚烷胺是否具有特异性。

结果显示，四免后，小鼠抗血清效价可达81000，检测限为0.1ng/mL，金刚烷胺 IC₅₀为1ng/mL。

Claims (8)

1.一种小分子化合物，其特征在于其结构简式如式I所示：

式I 。

2.一种高特异性的金刚烷胺人工抗原，其特征在于是由权利要求1所述小分子化合物与载体蛋白的偶联产物。

3.如权利要求2所述高特异性的金刚烷胺人工抗原，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种。

4.权利要求1所述小分子化合物的制备方法，其特征在于步骤为：将金刚烷胺0.66mmol，6-溴已酸0.8mmol加入到甲苯中，氮气保护下升温至130℃回流48h；减压浓缩，加水10 mL，水相用盐酸调pH 2-3后加乙酸乙酯萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤，干燥浓缩得产品。

5.权利要求2所述高特异性的金刚烷胺人工抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）金刚烷胺半抗原（I）的制备：将式I所示小分子化合物，用超纯水溶解，然后取NHS、EDC，使式I所示小分子化合物、NHS、EDC三者的摩尔比依次为1: 2: 2，在室温25℃下搅拌反应12h，得到金刚烷胺半抗原（I）；

（2）活化：按金刚烷胺半抗原（I）与载体蛋白的摩尔比为80:1配料，用0.1M pH 9.6 碳酸盐缓冲液溶解，使得溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，得到活化的金刚烷胺半抗原（I）溶液；

（3）金刚烷胺人工抗原的制备：将活化的金刚烷胺半抗原（I）溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到金刚烷胺人工抗原。

6.权利要求2所述高特异性的金刚烷胺人工抗原的又一种制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）金刚烷胺半抗原（Ⅱ）的制备：将式I所示小分子化合物，用超纯水溶解，然后取三正丁胺, 氯甲酸异丁酯，使式I所示小分子化合物、三正丁胺、氯甲酸异丁酯三者的摩尔比为1: 1.5: 1.5,  0℃反应1h，得金刚烷胺半抗原（Ⅱ）；

（2）活化：按金刚烷胺半抗原（Ⅱ）与载体蛋白的摩尔比为60:1配料，用 0.1M pH 9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，使得溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，得到活化的金刚烷胺半抗原（Ⅱ）溶液；

（3）金刚烷胺人工抗原的制备：在0℃条件下，将活化的金刚烷胺半抗原（Ⅱ）溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到金刚烷胺人工抗原。

7.权利要求5或6任意之一所述的高特异性的金刚烷胺人工抗原的应用，其特征是：将其免疫动物得到金刚烷胺抗体。

8.如权利要求7所述高特异性的金刚烷胺人工抗原的应用，其特征是：所述金刚烷胺抗体在检测金刚烷胺中的应用。