CN104387431A - 一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：利巴韦林溶解于无水DMF和无水吡啶的混合液中，加入琥珀酸酐，在60℃水浴条件下反应，并于酸性条件下重结晶生成利巴韦林半抗原。将半抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到完全抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达81000，检测限为0.1ng/mL，半抑制浓度为1ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明弥补了现有利巴韦林抗原合成技术的空白，得到了一种高特异性的利巴韦林人工抗原的抗原或抗体，具有广阔的应用前景。

Description

一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法
技术领域
一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
利巴韦林为抗病毒药物，是广谱强效的抗病毒药物，由于其毒副作用强，易引起免疫系统损伤和致畸。早在2005年农业部就明确规定禁止利巴韦林等抗病毒兽药的销售和使用。
2012年底媒体曝出了“速生鸡”事件，某些肉鸡养殖企业违反国家兽药管理条例，在养殖过程中喂食利巴韦林等人用抗病毒药品，引起了人们极大的关注。目前我国对于动物源性食品中利巴韦林残留量检测的相关研究报道甚少，更未制定或立项国家标准和行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。因此，建立快速检测利巴韦林在动物组织中残留量的方法已迫在眉睫。
利巴韦林的化学结构式如式I所示。
 
(式I),
目前我国对利巴韦林的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是利巴韦林检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。
本发明的半抗原是在利巴韦林分子的5-号位羟基一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的利巴韦林羧基衍生物，该衍生物为利巴韦林半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联最后形成完全抗原。
发明内容
本发明的目的：针对现有利巴韦林抗原合成技术的空白，提供一种新型的利巴韦林半抗原和完全抗原合成方法，使得制备高特异性的利巴韦林单克隆抗体成为可能。
本发明提供的利巴韦林半抗原化合物，具有式Ⅱ所示分子结构。
本发明的技术方案：
合成路线及方案如下：一种利巴韦林半抗原，其分子结构式如式Ⅱ所示
（式Ⅱ），
利巴韦林半抗原合成反应方程式为：
其是由利巴韦林为原料，在利巴韦林分子的5-号位羟基一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的利巴韦林羧基衍生物，该衍生物为利巴韦林半抗原。
一种利巴韦林完全抗原，是所述利巴韦林半抗原与载体蛋白的偶联物。
所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS中的一种。
所述的利巴韦林半抗原的制备方法，包括如下步骤：100mg利巴韦林溶解于5mL无水DMF和5mL无水吡啶的混合液中，加入50mg琥珀酸酐后，60℃水浴反应12h，最后于pH3酸性条件0℃下重结晶生成利巴韦林半抗原。
所述的利巴韦林完全抗原的制备方法，包括如下步骤：
（1）将利巴韦林半抗原，用超纯水溶解，与NHS，EDC按摩尔比为1: 2: 2混合，在室温25℃下搅拌反应12h进行活化；取牛血清蛋白，利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL；将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原；
或（2）将利巴韦林半抗原，用超纯水溶解，与三正丁胺, 氯甲酸异丁酯按摩尔比为1: 1.5: 1.5混合,  0℃反应1h进行活化；取牛血清蛋白，利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为60:1，用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL；在0℃条件下，将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原。
所述利巴韦林完全抗原的制备方法，所述载体蛋白牛血清白蛋白BSA被替换为匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS之一种。
所述利巴韦林完全抗原的应用，在制备利巴韦林抗体中的应用，免疫动物得到抗体。
所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。
所述抗体在检测利巴韦林中的应用。
得到的利巴韦林完全抗原，将利巴韦林完全抗原透析，然后进行丙烯酰胺凝胶电泳鉴定（图1）。
所述的载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA、阳离子化的牛血清白蛋白cBSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA。
上述利巴韦林半抗原或完全抗原化合物在制备利巴韦林抗体中的应用也属于本发明的保护范围。
上述利巴韦林完全抗原化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围，所述抗体为多克隆抗体和单克隆抗体。
上述利巴韦林半抗原或完全抗原化合物或抗体在检测利巴韦林中的应用也属于本发明保护的范围。
本发明的有益效果：
本发明是全新的利巴韦林完全抗原合成方法，完全抗原呈现出的特异性的利巴韦林抗原决定簇，使得筛选出高特异性的利巴韦林单克隆抗体成为可能。
实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达81000，检测限为0.1ng/mL，半抑制浓度为1ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的利巴韦林的残留。
附图说明
图1、利巴韦林完全抗原电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1利巴韦林半抗原的制备
利巴韦林100mg，溶解于5mL无水DMF和5mL无水吡啶，加入50mg琥珀酸酐，60℃回流反应12h，并于pH约为3，0℃条件下重结晶后生成利巴韦林半抗原。静置重结晶，得到白色沉淀，离心烘干得利巴韦林半抗原。
实施例2、利巴韦林完全抗原的制备
取10mg利巴韦林半抗原，加入2mL 超纯水溶解，再分别加入NHS，EDC（半抗原、NHS、EDC的摩尔比为1: 2: 2），室温下，混匀，在室温25℃下反应12h进行活化。取25mg 牛血清蛋白（半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80:1），加入5mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液。将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原。
实施例3、利巴韦林完全抗原的制备
取9mg利巴韦林半抗原，加入2mL超纯水溶解，0℃预冷30min。0℃下，分别加入三正丁胺, 氯甲酸异丁酯（半抗原、三正丁胺、氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1.5: 1.5）, 0℃反应1h。取30mg 牛血清蛋白（半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为60:1），加入5mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液，0℃预冷30min。在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原。
实施例4、利巴韦林抗血清的制备
以实施例3制得的抗原为免疫原，选用6-8周龄，雌性BALB/C小鼠为免疫动物，采用弗氏佐剂进行免疫，免疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。
实施例5、利巴韦林抗血清的测定
一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：
1)       包被：将实施例3中的抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
2)       洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
3)       封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
4)       加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL /孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反应1h。
5)       显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100ul的TMB显色液，37℃避光反应15min。
6)       终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
7)       结果判读：以OD450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测
具体操作步骤如下：
1)       用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
2)       包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL /孔，37℃反应2h。
3)       洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。
4)       配利巴韦林标准溶液：将利巴韦林标准品用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液配制成5mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度。
5)       加样：每孔加入50μL倍比稀释的利巴韦林各浓度标准品，然后再加入50μL /孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反应1h。
6)       显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。
7）终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
8）数据处理：以利巴韦林各浓度的对数为横坐标，以利巴韦林各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50，即OD450值从零标准溶液对应的A0下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对利巴韦林是否具有特异性。
结果显示，四免后，小鼠抗血清效价可达81000，检测限为0.1ng/mL，利巴韦林 IC50为1ng/mL。

Claims (9)

1.一种利巴韦林半抗原，其分子结构式如式Ⅱ所示
（式Ⅱ），
其是由利巴韦林为原料，在利巴韦林分子的5-号位羟基一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的利巴韦林羧基衍生物，该衍生物为利巴韦林半抗原。
2.一种利巴韦林完全抗原，其特征在于：是权利要求1所述利巴韦林半抗原与载体蛋白的偶联物。
3.根据权利要求2所述的利巴韦林完全抗原，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS中的一种。
4.权利要求1所述的利巴韦林半抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：100mg利巴韦林溶解于5mL无水DMF和5mL无水吡啶的混合液中，加入50mg琥珀酸酐后，60℃水浴反应12h，最后于pH为3，0℃条件下重结晶生成利巴韦林半抗原。
5.权利要求2所述的利巴韦林完全抗原的制备方法，其特征在于：将利巴韦林半抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到利巴韦林完全抗原，步骤如下：
（1）将利巴韦林半抗原，用超纯水溶解，与NHS，EDC按摩尔比为1: 2: 2混合，在室温25℃下搅拌反应12h进行活化；取牛血清蛋白，利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL；将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原；
或（2）将利巴韦林半抗原，用超纯水溶解，0℃预冷30min，0℃下与三正丁胺, 氯甲酸异丁酯按摩尔比为1: 1.5: 1.5混合,  0℃反应1h进行活化；取牛血清蛋白，利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为60:1，用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL；在0℃条件下，将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：所述载体蛋白牛血清白蛋白BSA被替换为匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS之一种。
7.权利要求2所述利巴韦林完全抗原的应用，其特征在于在制备利巴韦林抗体中的应用，免疫动物得到抗体。
8.根据权利要求7所述的利巴韦林完全抗原的应用，其特征在于：所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。
9.权利要求8所述抗体在检测利巴韦林中的应用。
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