CN103755802B - 一种结构特异性沙丁胺醇完全抗原的合成方法 - Google Patents

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Abstract

一种结构特异性沙丁胺醇完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：2-溴-1-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙-1-酮溶解于丙酮，加入碳酸钾后，与二苄基胺反应生成化合物B，在氢化铝锂催化下，生成化合物C，再在Pd/C催化下和氢气生成化合物D，再与乙酰丙酸乙酯还原胺化反应生成化合物E，在碱性条件下水解，并于酸性条件下重结晶后生成沙丁胺醇半抗原，名称为4-((2-羟基-2-(4-羟基-3-(羟甲基)苯基)乙基)氨基)戊酸。将此半抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联得到完全抗原。实验结果表明，用该完全抗原免疫动物得到的抗血清效价达81000，检测限为0.3ng/mL，半抑制浓度为3.2ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高；该抗原或抗体具有广阔的应用前景。

Description

一种结构特异性沙丁胺醇完全抗原的合成方法
技术领域
一种结构特异性的沙丁胺醇完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
沙丁胺醇（salbutamol），是一种短效β2肾上腺素能受体激动剂，用作平喘药。添加微量沙丁胺醇于牲畜饲料内，可以增加牲畜的瘦肉量及换肉率、减少脂肪，但是其毒性远高于具有相同功能的沙丁胺醇类似物。2002年9月10日起在中国境内禁止在饲料和动物饮用水中使用沙丁胺醇。
目前我国对沙丁胺醇的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是沙丁胺醇检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。
影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。传统的沙丁胺醇人工抗原一般通过琥珀酸酐与沙丁胺醇分子上的羟基偶联，衍生出羧基再与蛋白偶联。由于沙丁胺醇上有三个羟基，都能参与反应，因此使用琥珀酸酐法得到的羧基衍生物是一个混合物，最终通过免疫动物得到的抗体是针对这种混合物的，抗体的特异性和灵敏度会受到很大影响。同时，由于β2激动剂的其它药物，如克伦特罗，溴布特罗，特步他林，马步特罗，班布特罗等结构都有与沙丁胺醇一样的叔丁基侧链，因此通过羟基偶联的抗原，暴露出的位点是这几种β2激动剂的共有基团，相应免疫出的抗体不可避免的会与这些β2激动剂有交叉反应。
本发明的半抗原是在沙丁胺醇分子的叔丁基侧链一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的沙丁胺醇羧基衍生物，该衍生物为沙丁胺醇半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联最后形成完全抗原。
发明内容
本发明的目的：针对现有沙丁胺醇抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的结构特异性沙丁胺醇半抗原和完全抗原合成方法，使得制备高特异性的沙丁胺醇单克隆抗体成为可能。
本发明的技术方案：一种沙丁胺醇完全抗原的合成方法，其合成路线为：
工艺步骤为：
（1）沙丁胺醇半抗原的制备：
合成一种小分子化合物作为沙丁胺醇半抗原，名称为4-((2-羟基-2-(4-羟基-3-(羟甲基)苯基)乙基)氨基)戊酸，其分子结构式如式I所示：
式I；
制备步骤：将2-溴-1-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙-1-酮溶解于丙酮，加入碳酸钾后，与二苄基胺反应生成化合物B，在氢化铝锂催化下，生成化合物C，再在Pd/C催化下和氢气生成化合物D，再与乙酰丙酸乙酯还原胺化反应生成化合物E，在碱性条件下水解，最后于酸性条件下重结晶后生成式I所示沙丁胺醇半抗原；
（2）沙丁胺醇完全抗原的制备：
方案A：将沙丁胺醇半抗原，用DMF溶解，与NHS、EDC反应，式I所示化合物:NHS:EDC的摩尔比为1: 1.5: 2，在4℃下、避光搅拌反应1h，再在室温下反应12h；取载体蛋白，沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原；
或方案B：将沙丁胺醇半抗原，用DMF溶解，与三正丁胺、氯甲酸异丁酯反应，半抗原: 三正丁胺: 氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1.2: 1.2，0℃反应1h；取载体蛋白，半抗原与载体蛋白的摩尔比为80:1，用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原。
所述的沙丁胺醇完全抗原的合成方法，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS之一种。
所述的沙丁胺醇完全抗原的应用，在制备沙丁胺醇抗体中的应用，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，所述抗体在检测沙丁胺醇中的应用。
将完全抗原透析，然后进行紫外鉴定（图1）。
所述的2-溴-1-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙-1-酮，6-氨基己酸纯度均大于95%。
上述沙丁胺醇半抗原或完全抗原化合物在制备沙丁胺醇抗体中的应用也属于本发明的保护范围。
上述沙丁胺醇完全抗原化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围，所述抗体为多克隆抗体和单克隆抗体。
上述沙丁胺醇半抗原或完全抗原化合物或抗体在检测沙丁胺醇中的应用也属于本发明保护的范围。
本发明的有益效果：本发明是新型的沙丁胺醇完全抗原合成方法，完全抗原呈现出的特异性的沙丁胺醇抗原决定簇，使得筛选出高特异性的沙丁胺醇单克隆抗体成为可能。
实验结果表明，用本发明的完全抗原免疫动物得到的抗血清效价可达81000，检测限为0.3ng/mL，半抑制浓度为3.2ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的沙丁胺醇残留。
附图说明
图1、沙丁胺醇完全抗原紫外光谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 沙丁胺醇半抗原的制备
2-溴-1-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙-1-酮500mg，溶解于20mL丙酮，加入560mg碳酸钾，混匀，再加入430μL二苄基胺60℃回流反应12h，生成化合物B；-20℃下，加入230mg氢化铝锂反应12h，生成化合物C；在Pd/C催化下，通氢气反应生成化合物D；加入0.3mL乙酰丙酸乙酯，0.6mL三乙胺，430mg乙酰氧基硼氢化钠反应12h，生成化合物E；加入6mL 1mol/L的NaOH溶液水解4h，旋蒸，加入10mL水溶解，调节反应液pH至3.0，4℃下，静置重结晶，得到白色沉淀，离心烘干即为沙丁胺醇半抗原。
实施例2、沙丁胺醇完全抗原的制备
取25mg 沙丁胺醇半抗原，加入2mL DMF溶解，再分别加入NHS，EDC（半抗原: NHS: EDC的摩尔比为1: 1.5: 2），4℃下，避光混匀，搅拌反应60min，再在室温25℃下反应12h。取75mg 牛血清蛋白（半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80:1），加入10mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液。将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原。
实施例3、沙丁胺醇完全抗原的制备
取25mg 沙丁胺醇半抗原，加入2mL DMF溶解，0℃预冷30min。0℃下，分别加入三正丁胺、氯甲酸异丁酯（半抗原:三正丁胺: 氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1.2: 1.2）, 0℃反应1h。取75mg 牛血清蛋白（半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80:1），加入10mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液，0℃预冷30 min。在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原。
实施例4、沙丁胺醇抗血清的制备
以实施例2制得的抗原为免疫原，选用6-8周龄，雌性BALB/C小鼠为免疫动物，采用弗氏佐剂进行免疫，免疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。
实施例5、沙丁胺醇抗血清的测定
一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：
1)包被：将实施例3中的抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
2)洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
3)封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
4)加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反应1h；
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
6)终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
7)结果判读：以OD450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测
具体操作步骤如下：
1)用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度；
2)包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL/孔，37℃反应2h；
3)洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法；
4)配制沙丁胺醇标准溶液：将沙丁胺醇标准品用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液配制成1mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度；
5)加样：每孔加入50μL倍比稀释的沙丁胺醇各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃反应1h；
6)显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
7）终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
8）数据处理：以沙丁胺醇各浓度的对数为横坐标，以沙丁胺醇各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50，即OD450值从零标准溶液对应的A0下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对沙丁胺醇是否具有特异性；
9）将沙丁胺醇的标准品换成莱克多巴胺、马步特罗、克伦特罗按上述方法测定IC50值，并计算交叉反应率：
交叉反应率（%）= IC50（沙丁胺醇）/ IC50（类似物）
实验设3次重复，结果取平均值；结果显示，四免后，小鼠抗血清效价可达81000，检测限为0.3ng/mL，沙丁胺醇IC50为3.2ng/mL，各类似物的交叉反应率均小于0.1。

Claims (3)

1.一种沙丁胺醇完全抗原的合成方法，其特征在于合成路线为：
工艺步骤为：
（1）沙丁胺醇半抗原的制备：
合成一种小分子化合物作为沙丁胺醇半抗原，名称为4-((2-羟基-2-(4-羟基-3-(羟甲基)苯基)乙基)氨基)戊酸，其分子结构式如式I所示：
式I；
制备步骤：将2-溴-1-[4-羟基-3-(羟甲基)苯基]乙-1-酮溶解于丙酮，加入碳酸钾后，与二苄基胺反应生成化合物B；在氢化铝锂催化下，生成化合物C；再在Pd/C催化下和氢气生成化合物D；再与乙酰丙酸乙酯还原胺化反应生成化合物E；在碱性条件下水解，最后于酸性条件下重结晶后生成式I所示沙丁胺醇半抗原；
（2）沙丁胺醇完全抗原的制备：
方案A：将沙丁胺醇半抗原，用DMF溶解，与NHS、EDC反应，式I所示化合物:NHS:EDC的摩尔比为1: 1.5: 2，在4℃下、避光搅拌反应1h，再在室温25℃下反应12h；取载体蛋白，沙丁胺醇半抗原与载体蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原；
或方案B：将沙丁胺醇半抗原，用DMF溶解，与三正丁胺、氯甲酸异丁酯反应，半抗原: 三正丁胺: 氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1.2: 1.2，0℃反应1h；取载体蛋白，半抗原与载体蛋白的摩尔比为80:1，用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与DMF的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换液4次，即得到沙丁胺醇完全抗原。
2.根据权利要求1所述的沙丁胺醇完全抗原的合成方法，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白之一种。
3.权利要求1所述方法合成的沙丁胺醇完全抗原在制备沙丁胺醇抗体中的应用，其特征在于：其在制备沙丁胺醇抗体中的应用，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
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