CN101565464A

CN101565464A - 一种快速检测三聚氰胺(Melamine)含量的ELISA试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN101565464A
Application number: CNA2009100616385A
Authority: CN
Inventors: 华权高
Original assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Current assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2009-10-28

Abstract

本发明涉及一种食品安全相关的小分子添加剂三聚氰胺或其类似物的抗原、抗体制备及对各种可能存在三聚氰胺或其类似物样品进行半定量或定量的方法。本发明基于抗原抗体的特异性反应原理，利用三聚氰胺特异性抗体使用阻断ELISA法检测样品中三聚氰胺或其类似物的浓度。所述抗原为人工制备具有反应原性和免疫原性的三聚氰胺免疫原及包被原，使用免疫原免疫实验动物制备抗体，利用阻断ELISA原理，建立三聚氰胺的检测方法。本发明提供的三聚氰胺抗原具有很好的免疫原性，所得包被原有很好的活性。所建立的检测方法可检测乳、乳制品、饲料中的三聚氰胺含量，且不与乳、乳制品、饲料的其他成分发生非特异性反应。

Description

一种快速检测三聚氰胺(Melamine)含量的ELISA试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测，特别是涉及小分子的抗原、抗体制备及其检测方法的建立。本发明具体涉及通过阻断ELISA检测样品中三聚氰胺含量的方法及基于该方法的ELISA试剂盒的制备。

背景技术

小分子化合物，在组织化学上被称为半抗原，仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞的免疫反应性，而无免疫原性。对于半抗原的检测一般采用气相色谱、高压液相色谱、质谱等手段，但是免疫学检测方法在半抗原的检测上逐渐显示出其不可替代的优势。免疫学检测法不像传统的色谱和质谱等方法那样需要复杂、昂贵的设备，此外还具有易操作，前处理过程简单，成本低，检测快速、准确、灵敏，可实现高通量、自动化检测等优点，因此具有极为广泛的应用前景。

由于小分子化合物不具有免疫原性，所以小分子化合物的免疫学检测方法中至关重要的一步就是如何设计合成同时具有免疫原性和反应原性的小分子载体偶联物。通常将小分子化合物与分子量比较大的载体蛋白偶联制备完全抗原(免疫原)，借助载体蛋白的T细胞表位获得免疫原性，以刺激机体产生抗体。制备完全抗原时常用的载体有牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚赖氨酸(PLL)等。

本发明中的三聚氰胺(Melamine)(化学式：C₃H₆N₆)，俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为[1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基]，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水(3.1g/L常温)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。

食品工业中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以常用一种叫做凯氏定氮法的方法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺(含氮量66％)与蛋白质(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象，从而造成诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件等严重的食物安全事故。

中国国家食品质量监督检测中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，故暂未设定像农药般的残留标准限制。10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。含乳15％以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。有鉴于此，三聚氰胺含量检测成为目前国内食品安全检测的焦点。

三聚氰胺属于小分子化合物，与其他很多小分子化合物一样，一般采用GC、MS、LC-UV法、高效液相色谱法等测定三聚氰胺含量，相关检测机构建立的方法也少有报道。农业部标准NY/T 1372-2007中建立的饲料中三聚氰胺的测定方法是HPLC法和GC-MS法。最近国家质检总局与国家标准化管理委员会联合发布的《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T 22388-2008)中也是采用HPLC法、LC-MS/MS法、GC-MS和GC-MS/MS法。但以上方法存在过程冗长、需要衍生、试剂用量较大及灵敏度低等缺点。

目前三聚氰胺免疫学检测方法也有报道，但是市面上能够有效检测三聚氰胺的试剂盒不多。本专利根据三聚氰胺小分子化合物的特点，设计抗原，制备特异性抗体，研制出的检测三聚氰胺的阻断酶联免疫(ELISA)试剂盒，能快速、特异性的检测出样品中的三聚氰胺，根据试剂盒内说明书操作能计算出三聚氰胺的含量；是一种高效、快速、经济的高科技产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种小分子抗原及抗体制备方法，利用酶联免疫吸附原理，建立一种能快速、特异性检测出样品中小分子物质(三聚氰胺)含量的ELISA方法。

所述小分子抗原制备方法指：将无免疫原性或弱免疫原性小分子(三聚氰胺)偶联到特殊载体上，使其同时具有免疫原性和反应原性。

具体为：将三聚氰胺小分子分别偶联到特殊载体BSA和OVA上，成为同时具有免疫原性和反应原性的抗原小分子。得到的三聚氰胺-BSA偶联物为包被原，三聚氰胺-OVA偶联物为免疫原。

所述小分子抗体的制备方法指：将三聚氰胺-OVA偶联物，经过免疫学方法得到三聚氰胺-OVA偶联物的抗体，经过抗体亲和层析，得到纯化的三聚氰胺的特异性抗体。

所述ELISA检测试剂盒在本专利中为：三聚氰胺阻断包被在微孔反应板上的三聚氰胺-BSA偶联物跟HRP酶标记的三聚氰胺抗体结合，经过酶和底物显色，通过标准三聚氰胺样品和相应的OD值得到标准曲线，来检测样品中的三聚氰胺含量。

所述快速指：应用此试剂盒检测时间不超过1小时。

所述特异性指：本试剂盒可检测乳、乳制品、饲料中的三聚氰胺，且不与乳、乳制品、饲料的成分反应。

附图说明

图1：显示三聚氰胺抑制试验结果。其中横坐标代表标准品中三聚氰胺的含量，纵坐标代表光密度值(OD₄₅₀)，抑制试验具体结果数值如下表所示。

三聚氰胺含量(ng/ml)	500	250	125	62.5	31.2	15.6	7.8	0
三聚氰胺含量(ng/ml)	500	250	125	62.5	31.2	15.6	7.8	0	光密度值(OD₄₅₀)	0.182	0.480	0.626	0.677	0.711	0.741	0.871	0.885

专利具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，使其更明确，但决不用来限制本发明的范围。

实施例1抗体的制备和纯化

1.抗原的制备：根据三聚氰胺的性质及结构特点，设计合成三聚氰胺衍生物，偶联载体，制备包被抗原三聚氰胺-BSA和免疫抗原三聚氰胺-OVA。

2.免疫动物制备抗体

将三聚氰胺-OVA偶联物作为免疫原注射实验用日本大耳白兔，每次注射0.5mg免疫原，并加等体积佐剂。第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后使用弗氏不完全佐剂。共免疫四次，颈动脉取血或心脏取血得到抗血清。

3.三聚氰胺亲和层析柱制备

用CNBr-activated+Sepharose+4B作为柱胶加入三聚氰胺制作亲和层析柱。

4.抗体纯化

(1)平衡层析柱至中性。

(2)加入抗血清4ml，循环至少6次，使血清中的三聚氰胺抗体与柱中三聚氰胺结合。

(3)清洗层析柱除去杂质。

(4)将弱酸性溶液加入层析柱，洗脱抗体并收集。

(5)调节抗体洗脱液pH值至中性。

(6)平衡层析柱至中性，透析浓缩得到纯化的抗体。

实施例2三聚氰胺ELISA试剂盒的制备

1.包被有三聚氰胺-BSA偶联物的微孔反应板，1块(96T或48T)。

2.三聚氰胺标准品(500ng/ml 300μl，2瓶或1瓶)。

3.HRP酶标的三聚氰胺抗体1×60μl/瓶或1×30μl/瓶(1∶100)。

4.浓缩洗涤液1×20ml/瓶或1×10ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

5.底物1×10ml/瓶或1×5ml/瓶。

6.反应终止液1×10ml/瓶或1×5ml/瓶(2N H₂SO4)。

7.样品稀释液1×20ml/瓶(2瓶或1瓶)

实施例3样品中三聚氰胺的含量测定

1.样品处理

液态样品直接用样品稀释液稀释1000倍，固态样品处理方法：取1g样品，加入10ml甲醇充分混合。5000g以上离心10分钟。取上清1ml于试管中，吹干。加入2.5ml含10％甲醇的PBS溶液充分溶解，取150μl用于分析。

2.检测

(1)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品50μl，注意不要有气泡，将样品加于酶标板孔底部，然后在标准孔、待测样品孔中加入50μl稀释好的酶标物工作液(空白孔不加)。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(2)酶标板加上盖或覆膜，37℃反应30分钟。

(3)温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。

(4)依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色20分钟。(此时肉眼可见标准品的后3-4孔有明显的梯度蓝色，前3-4孔颜色不明显，即可终止)。

(5)依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

(6)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。

3.结果处理

以标准品浓度为横坐标X，OD₄₅₀为纵坐标Y，使用统计学软件处理，输入标准品的不同浓度及对应的OD₄₅₀即可作出标准曲线，将样品的OD₄₅₀代入，得出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

表1：三聚氰胺ELISA试剂盒检测三聚氰胺在液态奶中的回收率

血清中添加浓度(ng/ml)	检测浓度(ng/ml)	回收率(％)
血清中添加浓度(ng/ml)	检测浓度(ng/ml)	回收率(％)	0	＜0.0003	0
5	4.658	93.16	0	＜0.0003	0
5	4.658	93.16	20	19.52	97.6
50	48.6	97.2	20	19.52	97.6
50	48.6	97.2	100	98.2	98.2
300	299.6	99.87	100	98.2	98.2
300	299.6	99.87	500	503	100.60

表2：三聚氰胺ELISA试剂盒检测三聚氰胺在固态奶粉中的回收率

血清中添加浓度(ng/g)	检测浓度(ng/g)	回收率(％)
血清中添加浓度(ng/g)	检测浓度(ng/g)	回收率(％)	0	＜0.0002	0
5	4.28	85.6	0	＜0.0002	0
5	4.28	85.6	20	19.23	96.15
50	49.2	98.4	20	19.23	96.15
50	49.2	98.4	100	98.24	98.24
300	302	100.67	100	98.24	98.24
300	302	100.67	500	498.79	99.76

表3：三聚氰胺ELISA试剂盒检测三聚氰胺在饲料中的回收率

血清中添加浓度(ng/g)	检测浓度(ng/g)	回收率(％)
血清中添加浓度(ng/g)	检测浓度(ng/g)	回收率(％)	0	＜0.0002	0
5	4.35	87	0	＜0.0002	0
5	4.35	87	20	19.86	99.3
50	48.37	96.74	20	19.86	99.3
50	48.37	96.74	100	97.68	97.68
300	301.8	100.6	100	97.68	97.68
300	301.8	100.6	500	502.9	100.58

Claims

1、一种小分子的抗原、抗体制备及其检测方法的建立。

2、根据权利要求1所述的小分子指三聚氰胺或者不改变其免疫原性的三聚氰胺衍生物。

3、根据权利要求1所述的小分子抗原，其特征在于，小分子为三聚氰胺或者具备三聚氰胺相似免疫原性的三聚氰胺衍生物并通过化学偶联形成具备免疫原性的完全抗原。

4、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体是使用三聚氰胺或者具备三聚氰胺相似免疫原性的三聚氰胺衍生物偶联后的复合物通过免疫动物获得的多克隆抗体或者单克隆抗体。

5、根据权利要求1所述的检测方法，其特征是，建立在抗原抗体特异性反应原理基础上，通过包括但不限于酶联免疫(ELISA)法的免疫学方法检测样品中三聚氰胺含量。

6、根据权利要求5所述的酶联免疫(ELISA)法，其特征是包括但不限于阻断ELISA。

7、根据权利要求5所述的酶联免疫(ELISA)法，其特征是，三聚氰胺-BSA偶联物预先固相化。样品中的三聚氰胺可以阻断三聚氰胺抗体和固相化的三聚氰胺(或类似物)的结合。

8、根据权利要求5所述的样品包括但不限于液态奶或溶液萃取的奶粉或者饲料以及其他可能存在三聚氰胺的与人畜生活相关的食用品。

9、根据权利要求5所述的酶联免疫(ELISA)法，其特征在于：利用三聚氰胺阻断包被的三聚氰胺-BSA跟HRP酶标记的三聚氰胺抗体的结合，经过酶和底物显色，待测样品中三聚氰胺的浓度越高，酶标记的经纯化的三聚氰胺抗体和包被的三聚氰胺结合就越受到阻断，OD₄₅₀显色的深浅与样本中待测的三聚氰胺含量呈负相关。

10、根据权利要求9所述的固相化，其特征在于，将三聚氰胺偶联物包被到固相支持物上，该支持物可以是，例如用于酶联免疫吸附试验的聚苯乙烯或聚氯乙烯表面，或胶乳(聚苯乙烯)颗粒，或由压缩的聚乙烯颗粒组成的过滤玻璃棒，或多孔消化纤维素基质，或事实上是在免疫化学分析使用中任何合适的支持物。