CN104017774A - 一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。本发明的一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9304。通过百菌清完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。将高效价IC50的小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株D号。此细胞株D号分泌的单克隆抗体，对百菌清具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为1.5μg/L），可以用于食品安全中百菌清的残留检测。

Description

一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术

百菌清是一种广谱有机氯杀菌剂，对各种农作物及各种绿化草坪等的真菌病害具有预防作用。百菌清没有内吸传导作用，但一但喷到植物体上之后，就能在其体表具有良好的黏着性，不易被雨水冲刷掉，因此药效期较长，再加上其广泛使用，因此，百菌清及其代谢产物在植物与土壤都有较大的残留，甚至在北极地区都有检测到。

目前检测百菌清的方法主要是气相色谱法(GC)，液相色谱法(HPLC)，分光光度法、导数同步荧光法、薄层层析-分光光度法、气质联用法等紫外仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的百菌清检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高特异性的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

发明内容

本发明的目的在于提供一株百菌清具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，其对百菌清具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立百菌清的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9304。

所述的抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号分泌的百菌清单克隆抗体，是通过抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号分泌产生百菌清单克隆抗体。

所述百菌清单克隆抗体的应用，将百菌清单克隆抗体应用于百菌清的ELISA添加回收试验，测得其回收率。

（1）半抗原的合成：称取百菌清原药500mg（1.9mmol），KOH 106.6mg（1.9mmol），6-氨基己酸262mg（2mmol），将这三种药物溶于20mL乙醇，60℃反应12h，再90℃反应12h；

将反应物旋转蒸发，再用20mL水溶解，用盐酸调pH至4-5，产生沉淀，将沉淀烘干即为百菌清半抗原CTNH；用液质连用技术进行鉴定与分析；

（2）偶联物CTNH-BSA的制备：称取步骤（1）制备的CTNH 35.8mg，EDC 56.9mg，NHS 35.6mg，用1mL无水DMF溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h；称取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CTNH-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（3）小鼠的免疫：百菌清完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；

第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用百菌清完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株D号；

5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明获得的抗百菌清单克隆抗体细胞株D号，对百菌清有较好的检测灵敏度和特异性（IC₅₀值为1.5μg/L）；本发明提供的一种新的半抗原合成的思路，通过衍生得到半抗原，在用异原包被进行检测，得到灵敏度很好的单克隆抗体细胞株。

生物材料样品保藏：一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9304，保藏曰期为2014年5月28日。

附图说明

图1是单克隆细胞株D号分泌的单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将百菌清完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对百菌清有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株D号。

以下实施例中溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

实施例1 抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号的制备

（1）完全抗原的合成：

称取百菌清原药500mg（1.9mmol），KOH 106.6mg（1.9mmol），6-氨基己酸262mg（2mmol），将这三种药物溶于20mL乙醇，60℃反应12h，再90℃反应12h。将反应物旋转蒸发，再用20mL水溶解，用盐酸调pH至4-5，产生沉淀，将沉淀烘干即为半抗原CTNH，用液质连用技术进行鉴定与分析。

称取35.8mg CTNH，EDC 56.9mg，NHS 35.6mg，用1mL无水DMF溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。称取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CTNH-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

（2）动物免疫

选择健康的6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取步骤（1）制备的百菌清完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。

（3）细胞融合

在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10的比例混合，离心后用体积浓度50%的PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养。

（4）细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用百菌清为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对百菌清标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号。

实施例2 抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号单克隆抗体的制备与鉴定

（1）单抗的制备：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

（2）检测：使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体百菌清的IC₅₀分别为：1.5μg/L，说明对百菌清有很好的灵敏度，可用于百菌清免疫分析检测。

实施例3 单克隆抗体的应用

将实施例1抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于百菌清的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）包被：将包被原CTNH-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从2μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；

（8）添加回收及样品前处理：称取1g粉碎的黄瓜样品置入100mL三角瓶中，分别添加10μg、10μg及2.5μg百菌清。

向样品加入10mL丙酮震荡均匀后，超声提取15min，净置后上清用N₂吹干，再用甲醇溶解，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为109%，109%，110%。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

表1 D号分泌的单克隆抗体的交叉反应率 

Claims (3)

1.一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9304。

2.权利要求1所述的抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号分泌的百菌清单克隆抗体，其特征在于：通过抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号分泌产生百菌清单克隆抗体。

3.权利要求2所述百菌清单克隆抗体的应用，其特征在于：将百菌清单克隆抗体应用于百菌清的ELISA添加回收试验，测得其回收率。