CN104862284A

CN104862284A - 一株抗四溴双酚a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN104862284A
Application number: CN201510186226.XA
Authority: CN
Inventors: 匡华; 胥传来; 余丽; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 宋珊珊; 吴晓玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2035-04-20
Also published as: CN104862284B

Abstract

一株抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。本发明一株抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株P，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.9805。抗四溴双酚A单克隆抗体，由所述保藏编号为 CGMCC No.9805的杂交瘤细胞株P所分泌产生。此细胞株P分泌的单克隆抗体，对四溴双酚A具有非常好的特异性，检测灵敏度IC₅₀值为0.45ng/mL，可用于食品接触相关材料中四溴双酚A的迁移量检测。

Description

一株抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术

四溴双酚A(TetrabromobisPhenolA,TBBPA)是目前全球产量和使用量最大的一种溴系阻燃剂，广泛存在于我们的生活用品中，如汽车、家具和电脑。其结构如下所示：

随着四溴双酚A使用量的增加，其在环境中的累积量越来越高，开始存在于空气、土壤、河水、海洋、野生生物，甚至连人体中都有存在。

四溴双酚A（TBBPA）和六溴环十二烷（HBCDD）作为常见的溴类阻燃剂，其污染危害是显而易见的。其污染能力很高且具有持久性，非常容易积累在人体内。主要危害有如下：首先，长期接触溴化阻燃剂会妨碍大脑和骨骼发育；其次，它在被焚化处理时，会释放出溴化的二恶英和呋喃，这两种物质都是极易致癌物质。

目前对四溴双酚A的分析依然是通过高效液相色谱法、气相色谱法、LC-MS、LC-MS/MS、GC/MS等手段，现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一株抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对四溴双酚A具有较好的特异性和检测灵敏度，可以用来建立四溴双酚A的免疫学检测方法，或四溴双酚A免疫亲和柱的制备。

本发明的技术方案，一株抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株P，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.9805。

所述抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株P的制备，步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：四溴双酚Ａ类似物4,4-双（3,5-二溴-4-羟基苯基）戊酸（T3）通过碳二亚胺法与蛋白载体相连，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将抗原与福氏免疫佐剂混合均匀后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。免疫过程总共六次：前五次用T3完全抗原与等量福氏佐剂混合均匀后免疫，最后一次用T3完全抗原，不含佐剂，腹腔冲刺免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇PEG4000法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株P；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：IC₅₀值、交叉反应率和特异性的测定通过ELISA法。

通过抗四溴双酚A单克隆抗体由所述保藏编号为CGMCC No.9805的杂交瘤细胞株P分泌产生抗四溴双酚A单克隆抗体。

所述抗四溴双酚A单克隆抗体的应用，其在用于食品接触相关材料中四溴双酚A的迁移量检测。将抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株P通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于四溴双酚A的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）用碳酸盐缓冲液CBS稀释好的0.1μg/mL T3-OVA作为包被原，包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃ 包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；

（2）用含0.01%明胶的碳酸盐缓冲液CBS进行封闭，每孔200μL，37℃ 封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；

（3）用含10%甲醇的磷酸盐缓冲液PBS分别配制0，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5μg/L的四溴双酚A标准溶液；

（4）加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰4000稀释的抗四溴双酚A单克隆抗体，37℃反应0.5小时后，洗板拍干；

（5）每孔加入100μL用含0.01% 明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5小时后，洗板拍干；

（6）每孔加入100μL TMB显色液，37℃ 显色15 min后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液，450 nm测吸光值。

溶液的配置如下：

碳酸盐缓冲液CBS：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液PBS：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH 7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60 mg TMB 溶于100mL乙二醇中；A、B液按1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

本发明的有益效果：本发明获得的抗四溴双酚Ａ单克隆抗体细胞株P，仅对四溴双酚A有较好的检测灵敏度和特异性，IC₅₀值为0.45ng/mL。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株P，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.9805，保藏日期2014年10月15日。

附图说明

图1 细胞株P单克隆抗体对四溴双酚Ａ的标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将T3完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了仅对四溴双酚A有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株P。

实施例1 杂交瘤细胞株P的制备

1、完全抗原的合成

取1mg T3（M=601.9），加入1mL DMF，使其溶解，再加入 0.38mg EDC和 0.23mg NHS，室温搅拌反应4h；另取6mg BSA溶解于2mL、0.01 M、pH 7.4的PBS溶液中；将上述活化后的T3溶液慢速逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，-20℃分装保存。

2、动物免疫

选择健康的6～8周龄的Balb/C小鼠进行免疫。取T3完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂混合均匀后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。每次免疫均为T3-BSA，三免后7天采血检测，使用间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。

3、细胞融合

在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用四溴双酚A为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对四溴双酚A有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株P。

实施例2 单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，经透析后获得的单抗置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行免疫球蛋白的亚型鉴定，其亚型鉴定结果为IgG1型。

使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对四溴双酚A的IC₅₀为：0.64ng/mL，说明对四溴双酚A有很好的灵敏度和特异性，可用于四溴双酚A免疫分析检测。

实施例3 抗体应用

将杂交瘤细胞株P通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于四溴双酚A的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.1μg/mL T3-OVA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃ 包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干。

用含0.01%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃ 封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干。

用含10%甲醇的磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5μg/L的四溴双酚A标准溶液。

加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰4000稀释的抗四溴双酚A单克隆抗体，37℃反应0.5小时后，洗板拍干。

每孔加入100 μL 用含0.01%明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5小时后，洗板拍干。

每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液，450nm测吸光值。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄.12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按1：5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

单克隆抗体的试剂盒亚型鉴定如表1所示。

表1

亚型	OD值
		IgA	0.098
IgG1	1.559
		IgG2a	0.094
IgG2b	0.1
		IgG3	0.098
IgM	0.118

细胞株P单克隆抗体对TBBPA的标准曲线如图1所示。

单克隆抗体对双酚A、双酚酸、双酚C、和己烯雌酚交叉反应率如表2所示。

表2

	IC₅₀	交叉反应率
			四溴双酚A	0.55	100.00%
双酚A	>500	<0.1%
			双酚酸	>500	<0.1%
双酚C	>500	<0.1%
			己烯雌酚	>500	<0.1%

Claims

1.一株抗四溴双酚A单克隆抗体杂交瘤细胞株P，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.9805。

2.抗四溴双酚A单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为CGMCC No.9805的杂交瘤细胞株P所分泌产生。

3.权利要求2所述的抗四溴双酚A单克隆抗体的应用，其特征在于：其在用于食品接触相关材料中四溴双酚A的迁移量检测。