CN106282125A - 一株分泌抗磺胺类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株NaN‑1及其应用 - Google Patents

Abstract

一株分泌抗磺胺类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株NaN‑1及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明公开了一株能识别二十五种磺胺类抗生素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN‑1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12028。所述细胞株NaN‑1分泌的单克隆抗体，可以识别二十五种磺胺类抗生素，且具有较好的检测灵敏度，其中对磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SMR、磺胺二甲氧嘧啶SDM及磺胺噻唑STZ的IC₅₀分别为：4.51，1.80，1.98及0.53μg/L，可以用于食品安全中磺胺类抗生素的多残留检测。

Description

一株分泌抗磺胺类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株NaN-1 及其应用

技术领域

一株分泌抗磺胺类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株NaN-1及其应用，涉及杂交瘤细胞株NaN-1及其产生的抗磺胺类抗生素单克隆抗体，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术

磺胺类抗生素（sulfonamide antibiotics, SAs）是人工合成的抗菌药，用于临床已近50年，它具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便等优点。这类抗生素也是畜牧、水产等养殖生产中广泛应用的一类抗菌药物，其常常用于预防和治疗畜禽疾病，以及作为饲料添加剂促进动物生长。但由于其对人体潜在的危害性以及致病菌耐药性的产生，其在食品中的残留问题引起了广泛关注。近年来，各个国家加强了对SAs的监控，分别制定了动物源性食品中SAs的最大残留量。国际食品法典委员会、欧盟及欧美一些国家明确规定食品中SAs总含量不得超过0.1 mg/kg。

目前SAs的检测方法主要有仪器检测法（如高效液相色谱法，高效液相色谱串联质谱分析法），酶联免疫检测方法（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）以及胶体金免疫层析技术。由于仪器分析方法的样品前处理繁琐、耗时、仪器贵重、需要专业人员操作，不能实现大量样品的同时检测。ELISA是一种极为高效、灵敏的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高、操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。但要实现对磺胺类抗生素的同时检测，制备群选性的单克隆抗体是前提。

发明内容

本发明目的是提供一种抗磺胺类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体能识别二十五种SAs，且具有较好的检测灵敏度，可以用来建立SAs的免疫学检测方法。

本发明提供一种对SAs具有较广的识别性和较好的检测灵敏度的单克隆抗体的制备方法。

本发明提供的一株抗磺胺类抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12028。

抗磺胺类抗生素单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12028的抗磺胺类抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-1所分泌产生。

所述抗磺胺类抗生素单克隆抗体的应用，在磺胺类抗生素分析检测中的应用，用于食品安全中磺胺类抗生素的多残留检测。

本发明提供的NaN-1细胞株的制备基本步骤为：

1）免疫原的合成：500 mg氨基噻唑乙酸溶于7.5mL无水甲醇中，在溶液中加入400 mg二氯亚砜。反应液回流2h后，旋转蒸发去除挥发物，残余物用饱和碳酸氢钠溶液中和，然后用乙酸乙酯萃取后，旋转蒸发得到中间体Ⅰ，300 mg 中间体Ⅰ与 600 mg 4-乙酰氨基苯磺酰氯溶解于15mL吡啶中，在室温下反应3h，将反应液浓缩得到中间体Ⅱ，134 mg中间体Ⅱ溶解在5 mL、1M 氢氧化钠溶液中，加热至80℃，在氮气保护下反应2h。反应结束后蒸发掉挥发物，残余物用盐酸中和，然后用乙酸乙酯萃取两次。将得到的目标液干燥并蒸发掉有机溶剂，最后在真空下浓缩，得到目标半抗原。

半抗原是带有羧基的产物，用碳二亚胺法进行偶联。具体步骤为： 称取 20 mg 半抗原 溶解于 5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入 15.1 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与 12.8 mg N-羟基琥珀酰亚胺，在室温下活化4h；称取50 mg 牛血清白蛋白溶解于 6 mL 碳酸盐缓冲溶液中，将活化液滴加进蛋白溶液中，室温反应过夜。用0.01M 磷酸盐缓冲溶液透析3天去除未偶联上的半抗原，得到完全抗原，并用紫外进行表征。

包被原的合成与免疫原的合成过程类似，只需将载体蛋白换成鸡卵清白蛋白。

2）小鼠的免疫：完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天。最后一次直接用完全抗原（不含佐剂）冲击免疫，通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

3）细胞融合和细胞株的建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株NaN-1；

4）杂交瘤细胞株NaN-1性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

本发明获得的抗SAs单克隆抗体，对二十五种磺胺类抗生素有较好的检测灵敏度，其中对磺胺嘧啶（sulfadiazine,SD）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine,SMR）、磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimidine,SDM）及磺胺噻唑（sulfathizzole,STZ）的IC₅₀分别为：4.51，1.80，1.98及0.53 μg/L。

生物材料样品保藏：单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-1，巳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为CGMCC No.12028，保藏日期2016年1月 20日。

本发明的有益效果：本发明提供的一株抗磺胺类抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-1，此细胞株分泌的单克隆抗体，可以识别二十五种磺胺类抗生素，且具有较好的检测灵敏度，其中对磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶及磺胺噻唑的IC₅₀分别为：4.51，1.80，1.98及 0.53μg/L可以用于食品安全中磺胺类抗生素的多残留检测。

附图说明

图1：NaN-1分泌的单克隆抗体对SD的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将SAs的完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对SAs有较广的识别性和较好的灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-1。

实施例 1：杂交瘤细胞株NaN-1的制备

1、抗原的合成

500 mg氨基噻唑乙酸于溶7.5mL无水甲醇中，在溶液中加入400mg二氯亚砜。反应液回流2h后，旋转蒸发去除挥发物，残余物用饱和碳酸氢钠溶液中和，然后用乙酸乙酯萃取后，旋转蒸发得到中间体Ⅰ，300 mg 中间体Ⅰ与 600 mg 4-乙酰氨基苯磺酰氯溶解于15mL吡啶中，在室温下反应3h，将反应液浓缩得到中间体Ⅱ，134 mg 中间体Ⅱ溶解在5 mL、1M 氢氧化钠溶液中，加热至80℃，在氮气保护下反应2h。反应结束后蒸发掉挥发物，残余物用盐酸中和，然后用乙酸乙酯萃取两次。将得到的目标液干燥并蒸发掉有机溶剂，最后在真空下浓缩，得到目标半抗原。

半抗原是带有羧基的产物，用碳二亚胺法进行偶联。具体步骤为： 称取 20 mg 半抗原 溶解于 5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入 15.1 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与 12.8 mg N-羟基琥珀酰亚胺，在室温下活化4h，称取50 mg 牛血清白蛋白溶解于 6 mL 碳酸盐缓冲溶液中，将活化液滴加进蛋白溶液中，室温反应过夜。用0.01M 磷酸盐缓冲溶液 透析3天去除未偶联上的半抗原，得到完全抗原，并用紫外进行表征。

包被原的合成与免疫原的合成过程类似，只需将载体蛋白换成鸡卵清白蛋白。

2、动物免疫

选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高且能识别较多SAs的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。

3、细胞融合

在冲击免疫3天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1︰10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用SD，SMR, SDM及STZ为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对这四种标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株NaN-1。

5、单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞NaN-1，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体对二十五种SAs的IC₅₀见表1；

表1 NaN-1分泌的单克隆抗体的交叉反应率

说明对它们有较好的灵敏度，可用于免疫分析检测。

6. 抗体应用

将杂交瘤细胞株NaN-1通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于几种磺胺类抗生素（SD，SMR，SDM，STZ）的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）包被：将包被原用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从2µg/mL开始倍比稀释，100 µL/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200 µL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1︰1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100µL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100 µL/孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100 µL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50µL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD ₄₅₀值。

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；

（8）添加回收及样品前处理：以加入SD的添加回收试验为例，吸取1mL牛奶于15mL离心管中，向牛奶中分别添加20ng，50ng, 100ng SD，用0.01M PBS稀释牛奶 10倍，采用间接ELISA 进行添加回收试验。SMR的添加回收试验添加量分别为：1ng, 2ng, 5ng；SDM的添加量为：10ng, 20ng, 50ng；STZ的添加量为：1ng，2ng，5ng；NaN-1单克隆抗体对SD，SMR，SDM及和STZ四种药物的添加回收实验结果，其回收率见表2。

表2：

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄•12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄•12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60mgTMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (4)

1.一株抗磺胺类抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12028。

2.抗磺胺类抗生素单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为CGMCC No.12028的抗磺胺类抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-1所分泌产生。

3.权利要求2所述抗磺胺类抗生素单克隆抗体的应用，其特征在于：在磺胺类抗生素分析检测中的应用，用于食品安全中磺胺类抗生素的多残留检测。

4.根据权利要求3所述的抗磺胺类抗生素单克隆抗体的应用，其特征在于：本发明获得的抗SAs单克隆抗体，对二十五种磺胺类抗生素有较好的检测灵敏度，其中对磺胺嘧啶sulfadiazine,SD、磺胺甲基嘧啶sulfamerazine,SMR、磺胺二甲氧嘧啶sulfadimidine,SDM及磺胺噻唑sulfathizzole,STZ的IC₅₀分别为：4.51、1.80、1.98及 0.53 μg/L。