CN112379088B - 一种基于金纳米花技术检测铅残留的检测试纸 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品安全免疫检测领域，涉及一种基于单克隆抗体检测重金属铅的金纳米花快速检测试纸。本发明提供的抗重金属铅单克隆抗体9B7，亲和力常数Kaff达到9.56×109 L/mol；对Pb‑iEDTA的50%抑制浓度IC50达到153 ng/mL。本发明提供的一种检测铅离子的金纳米花快速检测试纸，检测时间10min，检测阈值（消除T线）达到100 ng/mL，检测限（vLOD）达到1.562 ng/mL。首次利用纳米花材料与抗重金属铅单克隆抗体结合，制备金纳米花试纸条，具有更高的灵敏度，可实现粮食中铅残留的高灵敏快速检测，确保对重金属铅残留的有效监测与防控。

Description

一种基于金纳米花技术检测铅残留的检测试纸
技术领域
本发明属于环境污染以及粮食安全免疫检测领域，涉及一种基于单克隆抗体的检测铅残留的金纳米花快速检测试纸。
背景技术
铅是一种具有青白色光泽的金属元素，可以通过食物链的积累作用在机体内积累引起铅中毒，对人体健康产生重大危害。随着冶金、矿山开采等工业生产的快速发展及含铅蓄电池和燃料的使用，大量的含铅废物被排放到环境中。环境中重金属污染逐渐成为人们关注的重点。
目前重金属检测主要利用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、原子荧光光谱法（AFS）、原子吸收光谱法（AAS）等仪器分析方法。仪器分析法在重金属检测上比较灵敏，但是所用大多为大型仪器，需要在实验室由专人操作，存在样品前处理复杂，成本高且花费时间长，不适合现场大宗产品的快速筛查等问题。因此发展快速、廉价和易于普通用户掌握的分析方法以及在仪器分析之前，对样品进行预分析，对节约分析费用和时间具有十分重要的意义。酶联免疫反应和免疫层析技术等免疫分析方法以其快速、简便、灵敏及特异性强的特点近年来广泛的应用于食品安全检测方面。本发明立足于我国目前食品和环境中Pb2+残留较为严重的国情，在参考国外相关研究文献的基础上,以双功能螯合剂iEDTA连接重金属离子（Pb2+）与载体蛋白，制备出完全抗原，通过小鼠免疫、细胞融合和抗体纯化，获得一株分泌抗Pb-iEDTA抗体的单克隆杂交瘤细胞株。以该抗体为基础，在最优条件下建立间接ELISA和金纳米花免疫层析试纸条方法，成功地应用于对Pb2+的检测，这对实现环境中Pb2+的快速检测具有重要意义。
现有的Pb2+胶体金免疫层析试纸在灵敏度上有待继续提高。研究表明，抗体的指标直接决定抗体的应用潜力，此外，免疫检测方法类型的选择亦至关重要。花状金纳米颗粒（也称纳米花，colloidal Au nano-flower，AuNF）因其特殊的表面形貌表现出更大的消光系数，能够使免疫检测试纸灵敏度提高10倍。因此，本发明旨在通过制备高亲和力高特异性单克隆抗体开发一种检测Pb2+的金纳米花快速检测试纸，实现对Pb2+快速灵敏检测，对环境中铅污染进行有效监测与防控。
发明内容
本发明提供一种检测水体或粮食中铅残留的金纳米花快速检测试纸，可用于铅离子快速灵敏检测。
本发明采用以下技术方案：一种基于金纳米花检测铅残留的检测试纸，所述试纸包括免疫探针（AuNF-mAb），免疫探针由抗二价铅离子单克隆抗体杂交瘤细胞株9B7与金纳米花通过静电吸附形成；所述单克隆抗体9B7由抗二价铅离子单克隆抗体杂交瘤细胞株9B7分泌产生，抗二价铅离子单克隆抗体杂交瘤细胞株9B7于2020年11月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌保中心，保藏编号CGMCC No.21006。
所述试纸还包括塑料外壳，所述的塑料外壳内包括免疫层析试纸条，所述的试纸条包含样品垫、免疫探针结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，依次粘贴固定在底板上，粘贴间隔2mm，干燥封装，置4℃保存，所述免疫探针位于免疫探针结合垫上。
所述的杂交瘤细胞株9B7的制备方法是：游离态二价铅为小分子半抗原，通过中间螯合剂iEDTA偶联载体蛋白，形成人工完全抗原。以人工完全抗原Pb-iEDTA-KLH，作为Balb/c小鼠免疫抗原；以人工完全抗原Pb-iEDTA-BSA，作为检测抗原。首次免疫取免疫抗原与弗氏完全佐剂按1:1混合乳化完全，按200μg/200μL每只小鼠的量，皮下多点注射Balb/c小鼠，加强免疫取免疫抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混合乳化完全，按50μg/200μL皮下多点注射，第一次加强免疫间隔28天，其余加强免疫间隔21天。经过5-8次免疫后，选取血清效价较高且IC50较低的小鼠，用2倍于前一次免疫剂量的免疫抗原Pb-iEDTA-KLH做最后一次冲击免疫，3天后，取脾细胞与SP2/0用50% PEG1450按照常规方法进行融合。用含20%胎牛血清的HAT RPMI-1640培养基作为基础筛选融合细胞，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗Pb-iEDTA-BSA完全抗原的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，选择吸光值和灵敏度均较高的孔；采用有限稀释法进行亚克隆，第一次亚克隆后7-8天同样采用两步筛选进行检测，其余亚克隆后7-8天改为仅用间接ELISA法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得可稳定分泌抗Pb-iEDTA单克隆抗体IgG2b的杂交瘤细胞株9B7。
所述的抗Pb-iEDTA单克隆抗体9B7的制备方法是：将获得的杂交瘤细胞株9B7以约1×106每只的量注射到用石蜡（500μL/只）预致敏过的9周龄的Bal b/c小鼠腹腔中，待小鼠腹部明显膨大且腹部皮肤具有紧张感时抽取腹水；置4℃下13000 r/min离心20min，取中间层；经过辛酸-硫酸铵法粗提和Protein G亲和层析法精提两步进行纯化，其中，辛酸-硫酸铵法粗提以常规的辛酸-硫酸铵法进行操作，将粗提后的抗体再进行Protein G亲和层析法精提，按商用的Protein G亲和层析使用说明进行操作；用超纯水透析完全后，冷冻干燥，收集冻干粉，即得抗Pb-iEDTA单克隆抗体9B7，将抗体置-20℃冰箱中备用。
本发明所述的金纳米花免疫探针（AuNF-mAb 9B7）由金纳米花与单克隆抗体9B7通过静电吸附形成，其制备方法是：通过种子生长法，以直径20nm胶体金为晶核，对苯二酚为介导制备花瓣状金纳米花（AuNF）；取金纳米花（AuNF）用氯化钠滴定法分别确定最适标记pH值和最适标记抗体量；取所述的金纳米花用0.1M K2CO3调pH至最适pH值，冰水浴持续搅拌，缓慢滴加最适标记量的单克隆抗体9B7，维持搅拌1h，紫外可见全波长扫描分析吸附情况，按终浓度为1%加入牛血清白蛋白，继续搅拌30min，按终浓度为0.5%加入PEG20000，维持搅拌30min；静置于4℃平衡体系过夜。采用分段离心纯化探针，用重悬液复溶，得到金纳米花免疫探针（AuNF-mAb 9B7）。
本发明所述的检测二价铅离子的金纳米花快速检测试纸，其制备方法是：样品垫采用玻纤GL-b02，免疫探针结合垫采用聚酯MA0280，封闭液配方采用1% BSA + 0.5%PEG20000 + 0.5% Tween 20 in 1× PBS（pH7.4），置37 ℃孵育封闭1h，干燥，剪成4 mm ×15 mm，置4℃备用；硝酸纤维膜（Sartorius CN140，2.5 cm × 30 cm）固定到卡式底板 DB-6（6.0 cm × 30 cm），检测抗原为完全抗原Pb-iEDTA-BSA（BCA法定量5.95mg/mL）以 1×PBS（pH7.4）按1/60进行稀释，羊抗小鼠IgG（GAMA，1 mg/mL）以 1× PBS（pH7.4）按1/2进行稀释，分别在硝酸纤维膜上按照3.5μL/cm进行划线，置37 ℃恒温箱干燥15min。以上述重悬液作为免疫探针稀释液，按4/10进行稀释，分别取10 μL加到免疫探针结合垫上，冷冻干燥，组装试纸。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的抗二价铅离子单克隆抗体9B7，用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得亲和力常数Kaff达到9.56×109 L/mol；可以较好地识别二价铅离子，对Pb2+的50%抑制浓度IC50达到 153ng/mL。
（2）本发明提供的一种检测铅残留的金纳米花快速检测试纸，检测时间仅为10min，检测阈值（消除T线）达到100ng/mL，检测限（vLOD）达到1.562ng/mL。
（3）与现有报道的铅离子胶体金免疫层析试纸相比，检测阈值（消除T线）降低10倍，检测限（vLOD）降低33倍。
附图说明
图1 是本发明杂交瘤细胞株9B7染色体分析图。
图2 是本发明杂交瘤细胞株9B7分泌的单克隆抗体的亚型鉴定图。
图3 是本发明杂交瘤细胞株9B7分泌的单克隆抗体的纯化结果鉴定图。泳道1：Maker；泳道2：腹水总蛋白；泳道3：纯化后的9B7单克隆抗体。
图4 是本发明杂交瘤细胞株9B7所产生的腹水及其纯化后抗体的效价测定图。
图5 是本发明杂交瘤细胞株9B7所产生的单克隆抗体亲和力检测结果图。
图6 是本发明杂交瘤细胞株9B7所产生的单克隆抗体的特异性分析图。
图7 是本发明9B7单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线图。
图8 是本发明9B7单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线直线图。
图9是本发明金纳米花胶体溶液数码照片图。
图10是本发明金纳米花紫外可见全波长扫描图。
图11是本发明金纳米花透射电镜TEM图。
图12是本发明金纳米花免疫探针制备过程的紫外可见光谱分析图。
图13是本发明金纳米花快速检测试纸的灵敏度测试图。
图14是本发明金纳米花快速检测试纸的特异性鉴定图。
图15是本发明金纳米花快速检测试纸的实际样品检测图。
具体实施方式
以下实施实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1杂交瘤细胞株9B7的制备
1、人工完全抗原的制备
取10 mg 血蓝蛋白KLH溶解于1mL HBS缓冲液，用1mol/mL NaOH调节至pH=8，随后加入10mg 1-（4-异硫氰苄基）乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸 即iEDTA，混合均匀后，在室温下180 r/min避光交联过夜，得到半抗原，再缓慢滴加130μL 铅离子标准溶液（1mg/mL），180r/min转速避光交联反应6h，用1×PBS（pH 7.4）透析三天，每4h更换一次透析液，透析后PEG20000进行浓缩，得到免疫抗原Pb-iEDTA-KLH。检测抗原Pb-iEDTA-BSA制备过程同上。
2、动物免疫
以人工完全抗原Pb-iEDTA-KLH为免疫抗原，免疫6周龄Balb/c小鼠。取Pb-iEDTA-KLH与等体积弗氏完全佐剂混匀，用漩涡振荡器与注射器抽吸结合乳化完全后以每只200μg/200μL的量于小鼠颈背部皮下多点注射。第一加强免疫与首次免疫间隔28天，取相同批次的完全抗原Pb-iEDTA-KLH与等体积弗氏不完全佐剂混匀，按每只50μg/200μL的量皮下多点注射。其余加强免疫间隔为21天，免疫剂量与方式与第一次加强免疫相同。第四次开始每次免疫后5-7天内，尾部静脉取血，分离血清，采用间接ELISA法检测小鼠血清效价。第六次免疫开始每次免疫后5-7天，尾部静脉取血，分离血清，采用间接ELISA法检测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清IC50。选择效价及IC50均相对较好的小鼠，用2倍于前一次免疫剂量的免疫抗原Pb-iEDTA-KLH以生理盐水稀释至500μL，腹腔注射，进行最后一次冲击免疫。上述间接ELISA和间接竞争均为常规的ELISA操作。
3、细胞融合
冲击免疫后3-4天取小鼠的脾细胞，采用50%聚乙二醇1450（PEG1450）作为融合剂，脾细胞与SP2/0按照4：1的细胞个数混合于20mL新鲜的RPMI 1640不完全培养基，轻柔混合均匀后，置1100 rpm，7min，离心，弃上清，轻弹离心管使底部细胞松散，随后将离心管置于37℃水浴，于1min内先慢后快地滴加1 mL 于37℃预热的50%PEG1450，边加边晃动离心管，促进细胞接触，静置0.5min，随后在第1min内缓慢加入1 mL RPMI 1640不完全培养液，在2min内先慢后快补加RPMI 1640不完全培养液至40mL，终止PEG的作用；1000 rpm离心10min，弃去上清，加入5mL新鲜培养基轻柔混匀，将细胞悬液转入95mL含2%HAT的完全培养基（含20%FBS的RPMI 1640培养基），混合混匀，随后铺板至预先铺好饲养层细胞的96孔板（每孔约2000个饲养层细胞含10%FBS的RPMI 1640培养基，每孔100μL），每孔100μL；融合15天后更换1%HT的完全培养基。
4、细胞株的筛选及亚克隆
待细胞生长至融合后第5-7天，每孔吸取100μL上清，补加120μL含1%HAT的完全培养基（含20%FBS的RPMI 1640培养基），融合第10-12天，采用ELISA方法分两步进行筛选，第一步采用间接ELISA法筛选出抗二价铅离子（Pb2+）而不抗载体蛋白的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出来的阳性孔以Pb-iEDTA作为竞争抗原进行间接竞争ELISA；选择吸光值和灵敏度均较高的孔（此处的吸光值，指同一个细胞孔的第一步检测结果；此处的灵敏度，指抑制率为50%时的竞争抗原浓度，即同一个细胞孔的第二步检测结果），采用有限稀释法进行亚克隆。第一次亚克隆后7-8天采用同样的两步筛选进行检测，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，其余亚克隆后10-12天改为仅用间接ELISA法进行检测，选择吸光值较高的孔，重复亚克隆2-3次后，直至阳性率为100%为止，获得杂交瘤细胞株9B7。
5、染色体分析
用0.1%秋水仙素处理对数生长期细胞6 h后重悬，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.075 mol/L KCl 5 mL重悬细胞，静置20 min；加入1 mL新鲜的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），混匀后静置5 min，1000 r/min离心10 min，弃上清；再加入5 mL固定液，重悬，置4℃静置过夜；1000 r/min离心10 min，弃上清，加入300 μL固定液，混匀，在预冷的载玻片上滴加1-2滴细胞悬液，干燥，经过Giemsa染色，结果如图1所示，计算处于分裂中期的杂交瘤细胞的染色体数目为108±2条，杂交瘤细胞的染色体数目接近于两个亲本的染色体数目之和，证明该阳性杂交瘤细胞为骨髓瘤细胞与脾细胞融合而成。
6、抗体亚型鉴定
用市售亚型测定试剂盒(厂家SIGMA，货号ISO2-1KT)鉴定杂交瘤细胞株9B7分泌的抗二价铅离子（Pb）的单克隆抗体，鉴定结果如图2所示，该抗体为IgG2b亚型抗体。
实施例2抗二价铅离子单克隆抗体的制备与性质鉴定
1、腹水的制备与纯化
1）腹水的制备：将处于对数生长期的杂交瘤细胞株9B7按约1×106 cell/只注射到石蜡（500μL/只）致敏过的9周龄Balb/c雌鼠腹腔，一周后观察小鼠，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，置4℃、13000r/min离心20 min，离心后分为三层（由下向上依次为聚集物，含有大量抗体的中间层，脂质层），取中间层。
2）抗体纯化：采用辛酸-硫酸铵法粗提与Protein G亲和层析法精提相结合进行纯化，以13%SDS-PAGE凝胶电泳检测验证抗体的纯度，如图3所示，纯化后的抗体在25 kDa及50kDa处均有条带，分别对应IgG抗体的轻链和重链，而且几乎没有杂带，表明纯化效果良好。用超纯水透析完全后，冷冻干燥，收集冻干粉，即得抗二价铅离子单克隆抗体9B7，将抗体置-20℃冰箱中备用。
3）效价测定：采用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测定腹水的效价及纯化后抗体的效价，结果如图4所示，腹水的效价超过2.048×106，纯化后抗体效价超过1.024×106，表明经过纯化后抗体依然保持较高活性。
2、单克隆抗体的特性鉴定
1）亲和力测定：根据Beatty的方法，用间接ELISA进行单克隆抗体亲和力常数Kaff的测定。用包被缓冲液将Pb-iEDTA-BSA稀释成5、2.5 、1.25、0.625μg/mL包被酶标板，其余步骤按常规间接ELISA操作。利用Origin8.0进行分析，如图5所示，按下面公式计算抗体的亲和力常数，计算结果为9.56×109 L/mol，为高亲和力抗体。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中：[Ab] 表示抗原浓度为[Ag] 时，在IC50处的抗体浓度；
[Ab]t表示抗原浓度为[Ag]t时，在IC50处的抗体浓度；
n=[Ag]/[Ag]t
2）特异性分析
检测抗原Pb-iEDTA-BSA以5 μg/mL包被酶标板，Pb2+，Zn2+，Mg2+，Cu2+，Ca2+，Cd2+，Mn2 +，Fe2+，Cr3+九种金属离子标准品螯合EDTA，以及EDTA分别作为竞争抗原，分别将10种竞争抗原按200 ng/mL倍比稀释，抗体9B7按1:64k稀释，采用常规的间接竞争ELISA法进行特异性的鉴定，结果如图6所示。
4）抗体灵敏度测定
用常规的间接竞争ELISA法鉴定其对二价铅离子（Pb）的灵敏度，绘制标准竞争曲线，结果如图7所示，曲线方程y=0.115+(0.926-0.115)/(1+(x/153.4)1.145)，R2=0.99613，其中IC50 = 153.4 ng/mL，在IC20 ~ IC80之间呈现良好的线性关系，线性部分直线方程为y =1.39857-0.40491x，R2=0.99125，结果如图8所示，线性范围18.32～962.53ng / mL，LOD为6.71 ng/mL。
实施例3二价铅离子的金纳米花免疫探针的制备
1、金纳米花的制备与表征
1）金纳米花（AuNF）制备：取100mL ddH2O调pH值7.0，依次加入20nm胶体金500 μL，1%柠檬酸钠300 μL，1% HAuCl4 750 μL，混合均匀；剧烈搅拌，一次性快速加入1.0mL 30 mM对苯二酚，持续剧烈搅拌30min；置4℃保存。
2）金纳米花（AuNF）的表征：所制金纳米花胶体为深蓝色，未见浑浊，底部无沉淀，分散性良好，如图9所示；紫外可见光谱扫描，最大吸收峰约为600nm，峰形较宽，如图10所示；透射电镜观测，标尺20 nm能够明显看到类似花瓣状形貌，如图11所示。
2、最适标记条件
1）最适标记抗体量：取酶标条分别加入200μL金纳米花（AuNF），各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μL单克隆抗体9B7（浓度为1.01 mg/mL），孵育30min；分别加入10% NaCl各20μL，5min后观测颜色变化趋于稳定的第一个孔对应的体积，结果为6μL mAb 9B7 / 200mLAuNF。
2）最适标记pH值：取酶标条分别加入200μL金纳米花（AuNF），各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8μL 0.1M K2CO3，混匀，随后分别加入6μL单克隆抗体9B7（浓度为1.01mg/mL），孵育30min；分别加入10% NaCl各20μL，5min后观测颜色最深的孔，结果为5 μL 0.1M K2CO3 /200mL AuNF。
3、金纳米花免疫探针（AuNF-mAb）的制备
1）取20mL金纳米花（AuNF）置冰水浴，低速搅拌， 用0.1M K2CO3调至最适标记pH，按最适标记抗体量，缓慢滴加抗体，维持冰水浴低速搅拌1h；取1mL进行紫外可见光谱扫描分析mAb吸附情况，结果如图12所示，说明吸附良好。按终浓度1%加入BSA，维持冰水浴，低速搅拌30min；按终浓度0.5%加入PEG20000，继续搅拌30min；静置4℃平衡体系过夜。
2）离心纯化：置4℃、1500 r/min离心20min，弃沉淀，取上清置4℃、10000 r/min离心5min，保留沉淀，按1/10体积重悬，重悬液配方为：0.5% BSA + 0.5% Glycine + 5%Trehalose + 0.5% Tween20 in 1× PBS（pH7.4）。
实施例4二价铅离子的金纳米花快速检测试纸及其测试
1、试纸组装
样品垫采用玻纤GL-b02，免疫探针结合垫采用聚酯MA0280，封闭液配方采用1%BSA + 0.5% PEG20000 + 0.5% Tween 20 in 1× PBS（pH7.4），置37 ℃孵育封闭60 min，干燥，剪成4 mm × 15 mm，置4℃备用；硝酸纤维膜（Sartorius CN140，2.5 cm × 30 cm）固定到卡式底板 DB-6（6.0 cm × 30 cm），检测抗原为完全抗原Pb-iEDTA-BSA（BCA法定量5.95mg/mL）以 1×PBS（pH7.4）按1/60进行稀释，羊抗小鼠IgG（GAMA，1 mg/mL）以 1× PBS（pH7.4）按1/2进行稀释，分别在硝酸纤维膜上按照1.5 μL/cm进行划线，置37 ℃恒温箱干燥24 h。以上述重悬液作为免疫探针稀释液，按4/10进行稀释，分别取10 μL加到免疫探针结合垫上，冷冻干燥，组装试纸。
2、工作过程与结果判读
1）工作过程：取100 μL待测液，滴加至试纸卡的样品垫，结合垫上的免疫探针随液体流动而泳动，在侧流层析过程中免疫探针依据抗原抗体反应被截留在T线和C线处，在T线和C线处形成可视信号，检测过程为10min。
2）结果判读：T线C线都正常显色，且颜色接近，为阴性，说明待测液中不含靶标；T线消失，C线正常显色，为阳性，说明待测液中含有靶标，且浓度高于检测阈值；T线显色明显浅于C线显色，为阳性，说明待测液含有靶标。
3、二价铅离子的金纳米花快速检测试纸的测试
1）灵敏度测试：用含有不同浓度的Pb-iEDTA半抗原的PBS溶液，鉴定所述金纳米花快速检测试纸，结果如图13所示，所述试纸的检测阈值（彻底消除T线）为100ng/mL；在为3.125 ng/mL时仍可明显地观察到T线颜色浅于C线颜色，在1.562ng/mL时T线与C线颜色相当。因此，检测限（vLOD）为1.562ng/mL。
2）灵敏度对比：现有报道的二价铅离子胶体金快速检测试纸检测限（vLOD）为50ng/mL，因此，所述二价铅离子金纳米花快速检测试纸与现有报道的二价铅离子胶体金快速检测试纸相比，检测限（vLOD）降低33倍。
3）特异性测试：用不同二价及三价金属离子Pb2+、Ca2+、Mg2+、Cd2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Cr3+经EDTA处理后以及EDTA做样品测试所述金纳米花免疫层析试纸的特异性，结果如图14所示，仅加入Pb-iEDTA的试纸T线被消除，其余试纸的T线与C线均正常显色。
实施例5二价铅离子的金纳米花快速检测试纸的应用
1）实际样品前处理：随机购买的超市售卖大米粉、小麦粉、地瓜粉和玉米粉各两份作为实际样品检测材料。粮食粉末样品的处理方法是：用三倍体积的双蒸水溶解，过滤，再倍比稀释。
2）金纳米花快速检测试纸的检测：用稀释过的实际样品100μL点样，以实施例4中的金纳米花快速检测试纸进行检测。检测结果如图15所示。
对照：为加标50ng大米粉，金纳米花快速检测试纸检测结果为阳性。
样品1：为实验室去离子水，金纳米花快速检测试纸检测结果为未检出或低于检测限。
样品2：为生活用自来水，金纳米花快速检测试纸检测结果为未检出或低于检测限。
样品3：为大米粉，金纳米花快速检测试纸检测结果为未检出或低于检测限。
样品4：为地瓜粉，金纳米花快速检测试纸检测结果为未检出或低于检测限。
样品5：为小麦粉，金纳米花快速检测试纸检测结果为未检出或低于检测限。
样品6：为玉米粉，金纳米花快速检测试纸检测结果为未检出或低于检测限。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种基于金纳米花检测铅残留的检测试纸，其特征在于：所述试纸包括免疫探针，免疫探针由抗二价铅离子单克隆抗体9B7与金纳米花通过静电吸附形成；所述抗二价铅离子单克隆抗体9B7由抗二价铅离子单克隆抗体杂交瘤细胞株9B7分泌产生，抗二价铅离子单克隆抗体杂交瘤细胞株9B7于2020年11月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.21006。
2.根据权利要求1所述的一种基于金纳米花检测铅残留的检测试纸，其特征在于，所述试纸还包括塑料外壳，所述的塑料外壳内包括免疫层析试纸条，所述的试纸条包含样品垫、免疫探针结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫，依次粘贴固定在底板上，粘贴间隔2mm，干燥封装，置4℃保存，所述免疫探针位于免疫探针结合垫上。
3.根据权利要求1所述的一种基于金纳米花检测铅残留的检测试纸，其特征在于，所述单克隆抗体9B7的制备方法包括以下步骤：将获得的杂交瘤细胞株9B7注射以石蜡预致敏过的Balb/c小鼠，收集腹水，纯化即得抗二价铅离子单克隆抗体9B7。
4.一种如权利要求1所述检测铅残留的金纳米花检测试纸在环境以及粮食中铅离子测定中的应用。
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