CN113607949B - 一种用于快速鉴别比较农田黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法 - Google Patents

一种用于快速鉴别比较农田黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供快速鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法。步骤：(1)用察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养待测土壤样品培养待测土壤样品并制备待鉴别土壤样品的待测液，备用；(2)采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度；(3)通过比较AFT‑YJFZ01浓度，得知农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度；所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子是指AFT‑YJFZ01肽，其氨基酸序列见SEQ ID NO.1所示。其用于鉴别农田土壤样品中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，鉴别速度快，及时性和实用性强，容易推广应用。

Description

一种用于快速鉴别比较农田黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度 的方法
技术领域
本发明涉及一种用于快速鉴别比较农田黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法。
背景技术
黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。
已有研究表明，黄曲霉毒素主要由黄曲霉等产毒真菌产生。以花生为例，花生在田间已经带上了黄曲霉毒素的产毒菌株，在收获后这些菌株伴随着花生一起进入包装袋、运输车、仓库、加工线等，条件一旦适宜，均可以产生大量的黄曲霉毒素，从而威胁花生及其制品的消费安全和人民生命健康安全。
为了减少花生产后尽量少带甚至不带黄曲霉毒素的产毒真菌，美国农业部农业研究局、联合国粮农组织(FAO)的国际半干旱研究所等国际知名研究机构将黄曲霉毒素的产毒真菌列为花生等作物的土传病原加以研究与防控。
然而，如何鉴别农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌丰度？这对制定防控策略的精准性和及时性都是至关重要的。现有报道的鉴别农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌丰度方法主要是菌落数计数法，即在固体察氏培养基或具有等同效应的平板培养基培养土壤样品，直至长出菌落，然后计算出每克土壤中的菌落数。该现有方法中，有时平板上长出的菌落数多到相互重叠或者少到寥寥无几，均会影响计算结果的准确性，尤其是需要对样品培养很多天才能长出菌落，难以满足即时性要求。
针对上述难题，发明人团队经过十多年攻关研究，成功发现了一种黄曲霉毒素的产毒菌产毒力指示分子，并首次研究发现：该指示分子在土壤培养6-24 小时即可以产生，尤其是该指示分子在土壤样品培养6-24小时后，其浓度与上述现有的菌落数计数法的结果呈现正相关关系，从而发明了快速鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法及其应用，所发明的技术方案可用于田间黄曲霉毒素的产毒真菌发生风险监测，为及时防控与早防早控提供了科学依据。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种用于快速鉴别比较农田黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法，其用于鉴别农田土壤样品中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，鉴别速度快，及时性和实用性强，容易推广应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
快速鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法，包括以下步骤：
(1)用察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养待测土壤样品，制备待鉴别土壤样品的待测液，备用；
(2)采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，步骤包括：
a待测液加入到孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01 的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果。
具体步骤为：
a将上述待测液，以每孔100-200μL加入到孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，
b然后加入AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体(每孔加入100-200μL)，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，
c然后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(每孔100-200μL)，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，
d然后先后加入ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。
(3)通过比较AFT-YJFZ01浓度，得知农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，即丰度强弱次序——测定的AFT-YJFZ01浓度与土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度呈现正相关关系，即测定的AFT-YJFZ01浓度越高，则土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度越高，该土壤样品对应的农田的产毒真菌发生风险越高；
所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子是指AFT-YJFZ01肽，其氨基酸序列见SEQ ID NO.1所示。
按上述方案，用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01纯品溶液(每孔100-200μL)，替换待测液，用于制作标准曲线，计算得到待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。
按上述方案，所述的用察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养待测土壤样品并制备待鉴别土壤样品的待测液，其方法步骤为：称量待测的土壤样品，转移至样品稀释液中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取10-1000μL上述待测样品均匀分散液，加在含6-600mL常规察氏液体培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养6-24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
所述的察氏培养基为常规察氏培养基，可以自配，也可以直接购买商品获得。
按上述方案，所述的样品稀释液是指含有0.1％山梨醇和0.1％糖的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，配制方法为：山梨醇与绵糖各0.5g、NaCL 4.0g、 Na2HPO4·12H2O 1.45g、KCL0.1g、KH2PO4 0.1g，加入去离子水定容至500mL。
按上述方案，所述的孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT- YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板，其制备方法为：将AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板(以100-200μL/孔)中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后加ELISA常规封闭液(每孔加200-300μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板。
按上述方案，黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同，可利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子直接作抗原，制备获得纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体，具体地：
黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得；
黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的多克隆抗体制备技术方案即可研制获得黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体；
所述的与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，可以直接购买商品获得。
所述的ELISA包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液，配制方法为：称取 NaHCO31.465g、Na2CO3 0.795g,加入去离子水定容至500mL即可。
所述的ELISA显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。
所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液：2mol/L硫酸水溶液，配制方法为：取44mL浓硫酸加入到300mL去离子水中，搅拌到冷却，最后定容至 400mL即可。
本发明根据首次发现的黄曲霉毒素的产毒真菌产毒力指示分子在土壤培养 6-24小时即可以产生，尤其是该指示分子在土壤样品培养6-24小时后，其浓度与现有菌落数计数法的结果呈现正相关关系，结合黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体，并由这些抗体构建成夹心免疫检测方法，从而实现对农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的快速鉴别，因方法具有速度快、及时性和实用性强等优势，容易推广应用，为及时发现农田黄曲霉毒素的产毒真菌发生风险与实施早防早控提供了关键抓手与科学依据，对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
本发明有益效果在于：
1.可用于鉴别农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度并及时发现污染风险，
2.速度快——仅1天时间即可完成，易操作，实用性强，容易推广应用，
3.对促进花生等农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
附图说明
图1为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法标准曲线。
具体实施方式
实施例1可起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01 的制备
按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)NaNO3， 0.1％(w/v)K2HPO4，0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，0.05％(w/v)KCl，0.001％ (w/v)FeSO4，pH6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、 JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-108-19、JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17 等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01。试验结果表明，上述产毒菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZ01，在同样培养条件下，HBHA-8-17制备得到AFT-YJFZ01的量最多，而HLJ-1制备得到 AFT-YJFZ01的量最少。
所述的免疫亲和方法，是指用上样液稀释黄曲霉毒素产毒菌细胞破碎液，经常规滤纸过滤后，再连续加到免疫亲和柱中，待基本流尽时，再免疫亲和柱常规淋洗液洗涤柱体，最后用pH 2.2的甘氨酸缓冲液或者70％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液后通过常规超滤离心方法及时去除溶液，再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质，即可获得黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01水溶液。
黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的初始获得用发掘方法：
(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～ 35℃。
所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
实施例2黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体制备
利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、 VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。
将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/ 孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，按照专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用AFT-YJFZ01和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为AFT-YJFZ01的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经ELISA方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
实施例3黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的单克隆抗体制备
利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至 BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作按照专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
按照专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、 0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得AFT-YJFZ01单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点的AFT- YJFZ01单克隆抗体。
实施例4黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体制备
利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体。
实施例5黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的免疫快速检测方法建立
AFT-YJFZ01的免疫快速检测方法即双抗夹心间接非竞争ELISA方法的基本操作程序：酶标板中包被AFT-YJFZ01的纳米抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；加入AFT-YJFZ01或待测液反应，洗板；加入AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体反应，洗板；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体反应，洗板；加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果。以下工作均采用该基本程序完成。
抗体最佳浓度的确定：采用设计棋盘滴定法同时进行多个平行实验，采用不同浓度的上述纳米抗体包被，另外将上述兔源多克隆抗体设置为不同浓度，最终根据结果确定纳米抗体和兔源多克隆抗体的最佳工作浓度，即在节省抗体用量的原则下选择OD450nm值近似1.0的点所对应的上述两种抗体浓度， ELISA结果研究表明，虽然上述纳米抗体和兔源多克隆抗体的其他浓度也可以实现检测，但是上述纳米抗体的最佳包被浓度为2.0μg/mL，上述兔源多克隆抗体的最佳浓度为3.0μg/mL。
最佳抗体包被条件的确定：包被是ELISA方法研究的第一步，包被效果的好坏对ELISA的结果有着非常关键的影响。为确定不同包被条件对检测结果的影响，选择了4℃包被过夜、37℃恒温包被2h、37℃恒温包被1h三种不同的条件包被在孔内，检测结果表明，研究的三种包被方式均可以实现包被，4℃下包被过夜为最佳包被条件。
最佳封闭剂的确定：抗体完成包被以后，为了避免酶标板孔未被占用的位点对ELISA后续的步骤造成干扰，需要利用一些惰性蛋白即封闭剂来占用这些位点，而不适当的封闭剂会与二抗非特异性结合，造成假阳性的情况。本研究采用3％BSA/PBST、3％脱脂奶粉/PBST、5％脱脂奶粉/PBST三种不同的封闭剂进行封闭，研究结果表明，虽然三种封闭剂均可不同程度的达到封闭的目的，5％脱脂奶粉/PBST的封闭效果最佳，为最佳封闭剂。
封闭时间的确定：研究分别设置37℃恒温封闭1h、2h、3h三种不同的封闭时长进行封闭，检测的结果表明37℃、封闭2h的设置下阳性孔OD450nm值 /阴性孔OD450nm值的数值最大，阳性样品OD450nm值＞1，因此37℃恒温封闭2h为最佳封闭时间。
上述兔源多克隆抗体反应时间的确定：研究分别采用37℃恒温反应30min、50min、1h三个反应时长进行反应，检测结果表明：37℃恒温下反应50min为上述兔源多克隆抗体的最佳反应时间。
黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的ELISA标准曲线绘制：将AFT-YJFZ01分子分别稀释至0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、 300ng/mL，每孔200μL入孔，采用上述最佳条件绘制AFT-YJFZ01的ELISA 标准曲线，结果见图1。在上述最佳优化条件下建立的双抗夹心酶联免疫吸附分析方法的相关系数达0.9980，对AFT-YJFZ01分子检测限可达到0.1ng/mL，表明该检测方法具有良好的检测灵敏度和准确度。
方法特异性评价：为评价黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01 的上述免疫检测方法的特异性，研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉菌、串珠镰刀菌等，通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测，结果见表1，上述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应，表明建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子 AFT-YJFZ01免疫快速检测方法具有良好的特异性。
表1.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法特异性测定结果
Figure RE-GDA0003292174620000101
方法重复性评价：为评价上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子 AFT-YJFZ01免疫快速检测方法的重复性，随机取4株黄曲霉毒素的产毒菌株——阳性1、阳性2、阳性3、阳性4和1株黄曲霉毒素的不产毒菌株——阴性 5研究，对测定结果的板内、板间的数据变异进行分析。上述研究结果见表2、 3，经计算板内变异系数为0.5％-3.5％，板间的变异系数为0.9％-5.7％，均在7％以下，因此，上述方法具有良好的重复性。
表2.产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法板内重复性测定结果
Figure RE-GDA0003292174620000111
表3产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法板间重复性测定结果
Figure RE-GDA0003292174620000112
方法准确度评价：为了评价上述方法的检测准确度，同时也是为了考察方法的实用性，选择花生和玉米样品为例进行研究评价，在玉米和花生样品中添加黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01，检测结果的回收率越接近 100％，说明方法越准确、越实用。该研究结果见表4，结果表明，上述建立的检测方法用于检测花生和玉米中产毒力指示分子AFT-YJFZ01，其回收率达到了82.5％-109.5％，说明该方法准确度高，可以应用到实际样品检测中去，具有良好的实用性。
表4.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法添加回收试验结果
Figure RE-GDA0003292174620000113
Figure RE-GDA0003292174620000121
实施例6土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌产毒力指示分子与黄曲霉毒素的产毒真菌丰度之间的数量关联性
选择花生黄曲霉毒素不同污染水平的农田土壤6份，采用上述建立的检测方法测定，具体操作如下。
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：依次称量待测的农田土壤样品，粉碎均匀后转移样品稀释液中，浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取50μL该待测样品均匀分散液，加到30mL的上述常规的察氏培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养20h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100-200μL 加入到上述包被有黄曲霉毒素产毒真菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体的酶标板孔中，或者每孔加入上述系列浓度的产毒力指示分子AFT-YJFZ01 的溶液100-200μL，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体，每孔加入100-200μ L，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后每孔加入上述辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述提及ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测农田土壤样品中AFT- YJFZ01的浓度。
采用常规菌落计数法测出土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌群体丰度依次为：278cfu/g、216cfu/g、169cfu/g、155cfu/g、112cfu/g、17cfu/g。上述测定结果显示：6个土壤样品中产毒力指示分子AFT-YJFZ01浓度依次为：21.7ng/g、12.2 ng/g、3.6ng/g、2.4ng/g、1.0ng/g、0ng/g，该结果表明：土壤中产毒力指示分子AFT-YJFZ01浓度越高，则土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌群体丰度越高，花生等农作物产后受黄曲霉毒素的污染风险越大。
实施例7利用黄曲霉毒素的产毒真菌产毒力指示分子免疫快速检测方法鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌丰度
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取吉林、辽宁、江西、福建等花生花期根际土壤样品共4份，依次命名为土样-1、土样-2、土样-3、土样-4。依次称量待测的农田土壤样品，粉碎均匀后转移上述试剂盒的样品稀释液中， 0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取10-1000μL该待测样品均匀分散液，加到6-600mL的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28℃下 200rpm震荡培养，培养24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100-200μL 加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZ01的溶液100-200μL，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中AFT- YJFZ01兔源多克隆抗体，再每孔加入100-200μL，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定土样-1、土样-2、土样-3、土样-4中 AFT-YJFZ01浓度结果依次为：0.3ng/mL、0.2ng/mL、16ng/mL、19ng/mL。该结果表明，上述四个花生产地共4个农田土壤样品中黄曲霉毒素的产毒真菌丰度由低到高依次为：土样-2、土样-1、土样-3、土样-4，其中土样-4和土样-3 中AFT-YJFZ01浓度较高，均超过了10ng/mL，表明这些土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌丰度较高，意味着如果不采取有效防控措施，土样-3、土样-4对应的农田产后花生等农作物产品受黄曲霉毒素污染风险较大。
综合以上具体实施例证明，本发明技术方案可用于鉴别农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度并及时发现污染风险，具有速度快——仅1天时间即可完成，易操作，实用性强等优点，容易推广应用，具有广阔的推广应用前景，对促进花生等农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 一种用于快速鉴别比较农田黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 33172
＜212＞ PRT
＜213＞ 黄曲霉
＜400＞ 1
AIGVEEPEAD PTYYHNAIGV EEPEADPTYY HNNKAIGVEE PEADPTYYHN NKTTASMVWE 60
EAQQVSGKAS VETPASIEAA SELSKAVSPS FEDVWSQPRD GAGQMFIPLN PNAYSPNTLN 120
KDGAGQMFIP LNPNAYSPNT LNKGSPKDGV YVDKSVTSGF VDGIKDGLRD VGGPIEDQNS 180
LQVGDRDVHG FATRFEQLPI NQPRFGKPVG AVGSAAFGKP VGAVGSAATA LKGDNEIPQA 240
ATAHDSAWDF FSQQPSGDNE IPQAATAHDS AWDFFSQQPS SLHGPNFEQL PINQPRGPTL 300
LEDFIFRGVD FTEDPLLQGR GVGAHGVFTS YHGGPNFEQL PINQPRHVDG FGIHTFRLAS 360
VETPASIEAA SELSKLFSYL DTQLNRLFYN SLTPAEQQFV VDAIRNAGIQ TSRNAGIQTS 420
RDGVYVDKNS LTPAEQQFVV DAIRNYFAET EQVMFQPGHN YFAETEQVMF QPGHIVRPEE 480
YVPITKPLQI VIDGFRPNAY SPNTLNKPVG AVGSAATALK QDLFEAIEAG RQLSEDGVDV 540
VVVAERSEDG VDVVVVAERS LTPAEQQFVV DAIRSMVWEE AQQVSGKSPS FEDVWSQPRS 600
VETPASIEAA SELSKSVTSG FVDGIKDGLR TTDVGTFGQK VDFTEDPLLQ GRVETPASIE 660
AASELSKVGF LASVETPASI EAASELSKYP EWELGVQIMD EEDQLKFDHE RVPERFGFDL 720
FDPTKFDLFD PTKFGKPVGA VGSAATNPDF MRQDLFEAIE AGRFVTDNGD SKLVKFVTDN 780
GDSKSVTSGF VDGIKGFDLF DPTKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKIVPEEY 840
VPITKDGVYV DKSVTSGFVD GIKFENSNVK SSVVRVGGPI EDQNSLQVGD RGDNEIPQAA 900
TAHDSVTSGF VDGIKDTTDV GTFGQKLKGV GAHGVFTGDN EIPQAATAHF VVDAIRTLLE 960
DFIFRFTEDP LLQGRPDLIH AVKPRVDGFG IHTFRGVGAH GVFYLDTQLN RNVIIQLNRK 1020
PVGAVGSAAT ALKDGVYVDK NNVIIQLNRI VPEEYVPITK LGKTPAEQQF VVDAIRFENS 1080
NVKEQVMFQP GHIVRGVDFT EDPLLQGRAI GVEEPEADPT YYHNAIGVEE PEADPTYYHN 1140
ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKASMVWEEA QQVSGKASMV 1200
WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKASMVWEEA 1260
QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS 1320
GKASMVWEEA QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS 1380
MVWEEAQQVS GKASMVWEEA QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE 1440
EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKASMVWEEA QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ 1500
VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKAVSPSFED VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR 1560
AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED VWSQPRAVSP 1620
SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED 1680
VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ 1740
PRAVSPSFED VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV 1800
SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF 1860
EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED VWSQPRDGAG QMFIPLNPNA YSPNTLNKDG 1920
AGQMFIPLNP NAYSPNTLNK DGAGQMFIPL NPNAYSPNTL NKDGAGQMFI PLNPNAYSPN 1980
TLNKDGAGQM FIPLNPNAYS PNTLNKDGAG QMFIPLNPNA YSPNTLNKDG AGQMFIPLNP 2040
NAYSPNTLNK GSPKDGAGQM FIPLNPNAYS PNTLNKGSPK DGVYVDKDGV YVDKDGVYVD 2100
KSVTSGFVDG IKDGVYVDKS VTSGFVDGIK FENSNVKSSV VRFGFDLFDP TKFGFDLFDP 2160
TKFGKPVGAV GSAATALKFG KPVGAVGSAA TALKFGKPVG AVGSAATALK FGKPVGAVGS 2220
AATALKFGKP VGAVGSAATA LKFGKPVGAV GSAATALKFG KPVGAVGSAA TALKFGKPVG 2280
AVGSAATALK FGKPVGAVGS AATALKFGKP VGAVGSAATA LKFGKPVGAV GSAATALKFG 2340
KPVGAVGSAA TALKFGKPVG AVGSAATALK FVTDNGDSKF VTDNGDSKLV KFVTDNGDSK 2400
LVKFVTDNGD SKLVKGPTLL EDFIFRGVDF TEDPLLQGRG VDFTEDPLLQ GRGVDFTEDP 2460
LLQGRGVDFT EDPLLQGRGV DFTEDPLLQG RGVDFTEDPL LQGRHGGPNF EQLPINQPRH 2520
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2580
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2640
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2700
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2760
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2820
GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH VDGFGIHTFR HVDGFGIHTF RHVDGFGIHT 2880
FRHVDGFGIH TFRHVDGFGI HTFRHVDGFG IHTFRHVDGF GIHTFRHVDG FGIHTFRHVD 2940
GFGIHTFRHV DGFGIHTFRH VDGFGIHTFR HVDGFGIHTF RHVDGFGIHT FRHVDGFGIH 3000
TFRHVDGFGI HTFRHVDGFG IHTFRHVDGF GIHTFRHVDG FGIHTFRHVD GFGIHTFRHV 3060
DGFGIHTFRI VPEEYVPITK IVPEEYVPIT KIVPEEYVPI TKLFSYLDTQ LNRLFSYLDT 3120
QLNRLFSYLD TQLNRLFSYL DTQLNRLFYN SLTPAEQQFV VDAIRLFYNS LTPAEQQFVV 3180
DAIRNAGIQT SRNAGIQTSR DGVYVDKNNV IIQLNRNYFA ETEQVMFQPG HNYFAETEQV 3240
MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH 3300
IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RNYFAETEQV MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF 3360
AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RNYFAETEQV 3420
MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH 3480
IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RQDLFEAIEA GRQDLFEAIE AGRQLSEDGV DVVVVAERQL 3540
SEDGVDVVVV AERQLSEDGV DVVVVAERQL SEDGVDVVVV AERSLQGKAS MVWEEAQQVS 3600
GKSLQGKASM VWEEAQQVSG KSPSFEDVWS QPRSVTSGFV DGIKSVTSGF VDGIKDGLRS 3660
VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS 3720
VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS 3780
VTSGFVDGIK DGLRTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT 3840
FGQKLKTTDV GTFGQKLKVG FLASVETPAS IEAASELSKV GFLASVETPA SIEAASELSK 3900
VGFLASVETP ASIEAASELS KVGFLASVET PASIEAASEL SKVGFLASVE TPASIEAASE 3960
LSKVGFLASV ETPASIEAAS ELSKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKVPVHNN 4020
NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKYPEWEL 4080
GVQIMDEEDQ LKYPEWELGV QIMDEEDQLK ALFNRDIATG KANNYCSNQV EGPYSLYSGR 4140
DIATGKVSIA KDYACPWNGG EEVSLKDYAC PWNGGEEVSL KVEYSDAAKE GDPEMYGNNE 4200
TVNKVCAKAN NYCSNQVEGP YSLYSGREPG ICETTPGVKE QTASVVNGTA VIKGFSATGD 4260
YPRGGPGSSS MIGLMQENGP CRGYLEDIAY VLDSGIKGYY DISHFDPDIG LMQENGPCRL 4320
AAEGDPEMYG NNETVNKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNQVEG PYSLYSGRNY 4380
CSNQVEGPYS LYSGRPGGCK DQIIECRQVE GPYSLYSGRQ YGNFSFTRSN QVEGPYSLYS 4440
GRTNASYVGG LVRTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKPGG TVYDMAMEAW SKPGGCKVAL 4500
VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VFEAGHEVPA YQPETAYEIF VFEAGHEVPA YQPETAYEIF 4560
HRVSIWTESY GGRYCSNQVE GPYSLYSGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRVEYSDAAK 4620
FRISYKEPGI CETTPGVKFT AFFQEQNEKS IWTESYGGRN YIVVDADSSF WFFESRISYK 4680
EPGIHDDRVS IWTESYGGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRDYAANNYC SNQVEGPYSL 4740
YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ VEGPYSLYSG 4800
RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG PYSLYSGRAN 4860
NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRANNY CSNQVEGPYS LYSGRANNYC 4920
SNQVEGPYSL YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ 4980
VEGPYSLYSG RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG 5040
PYSLYSGRAN NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRDIAT GKVSIAKDYA 5100
CPWNGGEEVS LKDYACPWNG GEEVSLKGDP EMYGNNETVN KVCAKANNYC SNQVEGPYSL 5160
YSGRGGPGSS SMIGLMQENG PCRIGLMQEN GPCRIGLMQE NGPCRISYKE PGICETTPGV 5220
KISYKEPGIC ETTPGVKISY KEPGICETTP GVKISYKEPG ICETTPGVKI SYKEPGICET 5280
TPGVKISYKE PGICETTPGV KISYKEPGIC ETTPGVKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE 5340
NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW MNGGPGSSSM IGLMQENGPC 5400
RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG PGSSSMIGLM QENGPCRNAP 5460
LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW 5520
MNGGPGSSSM IGLMQENGPC RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG 5580
PGSSSMIGLM QENGPCRNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRPGGCK DQIIECRTVY 5640
DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKTVY 5700
DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKPGGTVYD MAMEAWSKPG GTVYDMAMEA 5760
WSKPGGCKTV YDMAMEAWSK PGGCKTVYDM AMEAWSKPGG CKTVYDMAME AWSKPGGCKT 5820
VYDMAMEAWS KPGGCKTVYD MAMEAWSKPG GCKTVYDMAM EAWSKPGGCK TVYDMAMEAW 5880
SKPGGCKVAL VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VALVYGDRDY ACPWNGGEEV SLKVALVYGD 5940
RDYACPWNGG EEVSLKVALV YGDRDYACPW NGGEEVSLKV ALVYGDRDYA CPWNGGEEVS 6000
LKVALVYGDR DYACPWNGGE EVSLKVALVY GDRDYACPWN GGEEVSLKVA LVYGDRDYAC 6060
PWNGGEEVSL KVALVYGDRD YACPWNGGEE VSLKVALVYG DRDYACPWNG GEEVSLKVFE 6120
AGHEVPAYQP ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI 6180
FHRVFEAGHE VPAYQPETAY EIFHRVFEAG HEVPAYQPET AYEIFHRVFE AGHEVPAYQP 6240
ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI FHRVFEAGHE 6300
VPAYQPETAY EIFHRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRVSI WTESYGGRVS IWTESYGGRV 6360
SIWTESYGGR VSIWTESYGG RVSIWTESYG GRVSIWTESY GGRVSIWTES YGGRVSIWTE 6420
SYGGRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRYGP SFTAFFQEQN EKYGPSFTAF FQEQNEKYGP 6480
SFTAFFQEQN EKAAWLFEDS QAKADEINQI FDAISYMKAD VPSGSTNITH GRAFPCFDEP 6540
ALKAGMIADA GALASSGYQS TSGLLSLLKA VEQSLDAIRD GHILQQFKFA AGETSAIHPN 6600
IRGFDNEAEF IVWNEIVARI VDVLLDEKIV DVLLDEKNSG ASRLNADHSA IYRLTFTGIL 6660
NDNMAGFYRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRNVGFPV VTVAEDAASS SIKSSHPIEV 6720
PVKSSHPIEV PVKRTGDVRP EEDTTLYPVM LGLRTHEIGW EFSEKTKQGL DENTMLTERT 6780
LGLALSDEVK VYATPDQDIE HGRYLASTQM EPTDARYLGE DVFIQGVRQG LLTVEDRGSV 6840
FSIVLKAAQE MFQRQGLDEN TMLTERTDVE SWLKAGMIAD AGALASSGYQ STSGLLSLLK 6900
FAAGETSAIH PNIRLTFTGI LNDNMAGFYR NGGEKEYNVV YDRNGGEKEY NVVYDRNGGE 6960
KEYNVVYDRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRVYATPD QDIEHGRYLA STQMEPTDAR 7020
AWYENGITNC VGDNTRCCDS GVEQLVSFSD VSDFKDADAC NGGGIEYDSP ADTPLEFKDN 7080
TCNAPIPVSF PVAPTDTKDP YMFHQANLRD QCNYSLQYTI GNKFAANGNY GSETTAAVIN 7140
NFNGRFTTSA SDGFDGMQVN PRGNGVIEAA AGKGNVAGNI LVIAKITTAD MDGISSWLPT 7200
INGKIYYNCD TPACTVQEWI DTSAGSGDFS NLLATEKKPL GTGTDLWPKL DDLFVWWTTP 7260
ANRLVDWPIV TITHQEMSAN MNAGSSYFVE VGHNMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKQ 7320
AWVETMVQEF VRSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 7380
VNPRVIANGN VAGNILVIAK YFTSNGIIPP AITGLHNGDA LRQITGVTLS AKSASDGFDG 7440
MQVNPRDPYM FHQANSDVSD FKEAGLKGII PPAITGLHNG DALRYFTSNG IIPPAITGLH 7500
NEISFNQAWL RLVDWPIVTI THQEMSANFL DRKPLGTGTD LANGNVAGNI LVIAKHQEMS 7560
ANFLDRYNRD QCNYSLQYTI GNKAWYENGI TNCVGDNTRA WYENGITNCV GDNTRAWYEN 7620
GITNCVGDNT RAWYENGITN CVGDNTRAWY ENGITNCVGD NTRAWYENGI TNCVGDNTRA 7680
WYENGITNCV GDNTRAWYEN GITNCVGDNT RDADACNGGG IEYDSPADTP LEFKDADACN 7740
GGGIEYDSPA DTPLEFKDAD ACNGGGIEYD SPADTPLEFK DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK 7800
DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK DPYMFHQAND PYMFHQANLR DPYMFHQANL RDPYMFHQAN 7860
LRDPYMFHQA NLRDQCNYSL QYTIGNKEIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS 7920
FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF 7980
AANGNYGSET TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN 8040
NFNGRFAANG NYGSETTAAV INNFNGRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF AANGNYGSET 8100
TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN NFNGRITTAD 8160
MDGISSWLPT INGKITTADM DGISSWLPTI NGKITTADMD GISSWLPTIN GKITTADMDG 8220
ISSWLPTING KITTADMDGI SSWLPTINGK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8280
TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8340
TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKLDDLFV 8400
WWTTPANRLD DLFVWWTTPA NRLDDLFVWW TTPANRLDDL FVWWTTPANR LVDWPIVTIT 8460
HQEMSANLVD WPIVTITHQE MSANFLDRLV DWPIVTITHQ EMSANFLDRM NAGSSYFVEV 8520
GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA 8580
AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS 8640
YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN 8700
GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8760
VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8820
VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8880
VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8940
VNPRVIANGN VAGNILVIAK VIANGNVAGN ILVIAKYFTS NGIIPPAITG LHNGDALRAS 9000
HTVDKNGIWS SEVKATDNYI ANAAAAVAKD LLQDIVTWDD KEAGIYLIAR GPLNEGGLYA 9060
ERGTNYVALS LWALESDGAK HTDYSSQEST SYKLGSFELS YTTPVLTGYG NVESPEQPKL 9120
SGQDASAITW KLTGNLGGED YQDKLTGNLG GEDYQDKVRN SAYNYWVPEL PTEGTSPGFS 9180
TSKPGIGFYT AQFDLDLPKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSPGSFFV VRSSYDDSAW 9240
VSADLPKTSY DYGSPITETR YPDADYMQYV MDQARNGIWS SEVKVLVLYG GPKASPSYLT 9300
ATPRYLDTLP EIKTLHLEQS PSTPYAQLYV NGYQYGKKAD IVVPFPWGGP GFEKAQLYVN 9360
GYQYGKAQLY VNGYQYGKAT DNYIANAAAA VAKLSGQDAS AITWKLTGNL GGEDYQDKVR 9420
NGIWSSEVKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSSYDDSA WVSADLPKYP DADYMQYVMD 9480
QARYPDADYM QYVMDQARAL TNGAGAIKEA IADVLEHLGE NDEDIAVYAP NPFYKGFAPL 9540
EYLGSNFENG ELPKGFDNAG FVMGTSSSLF NQFILRGKMP MPILVADGRH FQLINTAAYW 9600
KIPNVAIAVS GGGYRLNGTD IPNFLKLNLS SFDASGYIDR LPDICNTCFK MPMPILVADG 9660
RNSILEGPDV KSAAALSTSE KDWLQVRSSS LFNQFILRTF LNLGLNKTNT KLPDICNTCF 9720
KTSLTDYWGR SSFDASGYID RSTSEKDWLQ VRGTDIPNFL KLNLGLNKGF DNAGFVMGTS 9780
SSLFNQFEYL GSNFENGELP KMPILVADGR DLYDAVKINT AAYWKSIALG DDFKKALTNG 9840
AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKGKMPM PILVADGRGK MPMPILVADG 9900
RGKMPMPILV ADGRGKMPMP ILVADGRGKM PMPILVADGR GKMPMPILVA DGRHFQLINT 9960
AAYWKHFQLI NTAAYWKLPD ICNTCFKLPD ICNTCFKMPI LVADGRMPMP ILVADGRMPM 10020
PILVADGRMP MPILVADGRM PMPILVADGR MPMPILVADG RMPMPILVAD GRMPMPILVA 10080
DGRMPMPILV ADGRMPMPIL VADGRNSILE GPDVKNSILE GPDVKNSILE GPDVKSAAAL 10140
STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10200
AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10260
QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE 10320
KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL 10380
STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10440
AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10500
QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RTNTKLPDIC 10560
NTCFKTNTKL PDICNTCFKT NTKLPDICNT CFKAASLPAS FSGFKALVSH DGTFVADAKE 10620
NSLVWHQQVL GWLNKFNAVF SGTLKGDAGS PVFSPDSKGD AGSPVFSPDS KKIAYWQMAD 10680
ESYEADHRIQ AFVIYPENFD KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRLPV SEGLSLFNIL 10740
QERMINWIQG SDLGRNAESP YPPFGGASDY DLSPDGKRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK 10800
SEAIPNPSGD VAVFSQSQYS FKTAVPINGP DSPGTPEGVK TAVPINGPDS PGTPEGVKGD 10860
AGSPVFSPDS KTLATANKID PELKTLYVYT VGSEETIPSL AADWDRTTSQ WNVLDLKVVT 10920
TDSGDVRWIQ GSDLGRALVS HDGTFVADAK ALVSHDGTFV ADAKGDAGSP VFSPDSKKIA 10980
YWQMADESYE ADHRIAYWQM ADESYEADHR IAYWQMADES YEADHRLFSI PADAGDDYKP 11040
KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK RSEAIPNPSG 11100
DVAVFSQSQY SFKTAVPING PDSPGTPEGV KTAVPINGPD SPGTPEGVKT AVPINGPDSP 11160
GTPEGVKGDA GSPVFSPDSK TTSQWNVLDL KTTSQWNVLD LKAASNFDGD TLVLGYDSGN 11220
GNPETSFMTL MRAGSTIAVT DVQITGGAVG IKASGTCSGP IQSAPTSYWL ADQDHSGDAR 11280
DAGSPKPVVQ IGHEGDVGVA EIQNMRFSVA EILPGAKGDG STDDSASLNA ILANNAANCK 11340
GTCSGPIQSA PTSYWLADQD HSGDARIVGE AWAVITGAGD AFKNSQILIQ NLSHDNSNAI 11400
AVDSKNSQIL IQNLSHDNSN AIAVDSKDNI KNVVLDTTAL SANTKSAPTS YWLADQDHSG 11460
DARVGTIITG DPLDPPVLKV TNSPSNLVWY SISTRYPAEV FLPGGTYQLG KSLGSLVLLD 11520
SSSINSGPVV RDTLVIPPGS RAQPTYAEYS NDQIVNVKSG TCSGPIQSAP TSYWLADQDH 11580
SGDARAGSTI AVTDVQITGG AVGIKAQPTY AEYSNDQIVN VKAQPTYAEY SNDQIVNVKD 11640
AGSPKPVVQI GHEGDVGVAE IQNMRFSVAE ILPGAKNSQI LIQNLSHDNS NAIAVDSKNS 11700
QILIQNLSHD NSNAIAVDSK NSQILIQNLS HDNSNAIAVD SKNSQILIQN LSHDNSNAIA 11760
VDSKDNIKNS QILIQNLSHD NSNAIAVDSK DNIKNSQILI QNLSHDNSNA IAVDSKDNIK 11820
NVVLDTTALS ANTKSAPTSY WLADQDHSGD ARVTNSPSNL VWYSISTRVT NSPSNLVWYS 11880
ISTRAGALLL GKAGVIPESL HQDTVGTFGK DRLETTAGSW ALLGSVVPRG IMDETYYQAL 11940
EFCQRGKTPE GGYAQFLTNK GPLHGIPFIV KIHQTQPYLN AILQVNPDAF KLETTAGSWA 12000
LLGSVVPRNS VVGIKPTVGL TSRTIVSPDG FNWDYGSTRT PEGGYAQFLT NKTTREEGID 12060
AALKVDFYNN LKDYLSEVEN TKAALSEWAD MRALGTETDG SVINPAQREE GIDAALKDAV 12120
YALDAIYGID ARAALSEWAD MRAALSEWAD MRAGVIPESL HQDTVGTFGK AGVIPESLHQ 12180
DTVGTFGKAG VIPESLHQDT VGTFGKAGVI PESLHQDTVG TFGKGIMDET YYQALEFCQR 12240
IHQTQPYLNA ILQVNPDAFK NSVVGIKPTV GLTSRNSVVG IKPTVGLTSR NSVVGIKPTV 12300
GLTSRTIVSP DGFNWDYGST RTTREEGIDA ALKAVWPGDM GVAVPAAFVS TGDLESVKAY 12360
QGYFHSNDDL LNRDGSASYV MPDKDRAVWP GDMGVAVPAA FVSTGDLESV KDSAFPGLWE 12420
ENIYAPSSRG GSGALGLAFS EAKGVYYVDD TATITVSGGG SHRIWYSGAY TLQTNAVPVN 12480
TGRNALQTMY DTQDKNALQT MYDTQDKTTG AFDESGPPLS QKSPDGYTLQ FSVPPGTKSS 12540
EKPSITIDGN NINKTTGAFD ESGPPLSQKI APQFGDLKAL ELIRRFQASW DKSPDGYTLQ 12600
FSVPPGTKIS SFEIQGHFKA VWPGDMGVAV PAAFVSTGDL ESVKAYQGYF HSNDDLLNRA 12660
YQGYFHSNDD LLNRAYQGYF HSNDDLLNRA YQGYFHSNDD LLNRDGSASY VMPDKDGSAS 12720
YVMPDKDRAV WPGDMGVAVP AAFVSTGDLE SVKGVYYVDD TATITVSGGG SHRGVYYVDD 12780
TATITVSGGG SHRISSFEIQ GHFKNALQTM YDTQDKNALQ TMYDTQDKNA LQTMYDTQDK 12840
NALQTMYDTQ DKTTGAFDES GPPLSQKNAL QTMYDTQDKT TGAFDESGPP LSQKNALQTM 12900
YDTQDKTTGA FDESGPPLSQ KNALQTMYDT QDKTTGAFDE SGPPLSQKSP DGYTLQFSVP 12960
PGTKSPDGYT LQFSVPPGTK SSEKPSITID GNNINKSSEK PSITIDGNNI NKSSEKPSIT 13020
IDGNNINKTT GAFDESGPPL SQKDNILPEN LDDGLPSQFV YEKFGPHEYN GDQYTSIIRL 13080
VIDLSGNGGG YILQGYDTFR NVGLVSVSLD GKPSSDPMQG IGGIKQLFPS IVQDGYTRSD 13140
KYAGEYEFQA DLFKSFEPST PAEFQAVLEK YAGEYEFQAD LFKPFAASTP GFDGYFSGSA 13200
RAASTPGFDG YFSGSARYDL NLENKAFNLA HDGHFRHFTS LEEKFFPDLL TKSIAIGGRP 13260
SSDPMQGIGG IKFGPHEYNG DQYTSIIRFG PHEYNGDQYT SIIRQLFPSI VQDGYTRQLF 13320
PSIVQDGYTR QLFPSIVQDG YTRSDKYAGE YEFQADLFKE PGAEGVCETT PGVKFANQMP 13380
NGCQDLISTC KGCQDLISTC KQLPKNPTGV KSAGYTPLKV NGVEYGETRS YSGYVDTSPE 13440
SHTFTALADY ALCAEATNMC RTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKKVYEA GHEVPYYQPI 13500
ASLYKEPGAE GVCETTPGVK LSGLPSLDSR SYSGYVDTSP ESHTFFHNPE TAPITLWLNK 13560
IWPSYKVYEA GHEVPYYQPI ASVNGVEYGE TRTALADYAL CAEATNMCAE GVCETTPGVK 13620
FANQMPNGCQ DLISTCKFAN QMPNGCQDLI STCKFANQMP NGCQDLISTC KFANQMPNGC 13680
QDLISTCKFA NQMPNGCQDL ISTCKFANQM PNGCQDLIST CKKIWPSYKK IWPSYKSAGY 13740
TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN 13800
GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE 13860
TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY 13920
TPLKVNGVEY GETRTALADY ALCAEATNMC RTALADYALC AEATNMCRTA LADYALCAEA 13980
TNMCRTALAD YALCAEATNM CRTALADYAL CAEATNMCRT ALADYALCAE ATNMCRTALA 14040
DYALCAEATN MCRTALADYA LCAEATNMCR TALADYALCA EATNMCRTIF GWDIAEGQKT 14100
IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14160
IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14220
IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKKVNGVEY GETRVNGVEY GETRVNGVEY GETRYKEPGA 14280
EGVCETTPGV KYKEPGAEGV CETTPGVKYK EPGAEGVCET TPGVKYKEPG AEGVCETTPG 14340
VKYKEPGAEG VCETTPGVKA SDFWANELVT WWNKEAEPSQ EYVSYSHGVF LRFSYEEGEK 14400
FLNKGAKDDV FIKGGSILPM QEVALTTRKA TGDVLFNTKN AHGQEILLRN HNVLSAIPQE 14460
PYRQYQLSTV GLPAMQQYNT LGFHQCRSSE AEPSQEYVSY SHGVFLRTLG GSVDLTFYSG 14520
PTQAEVTKWA SVIDATKSEA EPSQEYVSYS HGVFLRAEPS QEYVSYSHGV FLRAEPSQEY 14580
VSYSHGVFLR AEPSQEYVSY SHGVFLRAEP SQEYVSYSHG VFLRASDFWA NELVTWWNKE 14640
AEPSQEYVSY SHGVFLREAE PSQEYVSYSH GVFLREAEPS QEYVSYSHGV FLRFSYEEGE 14700
KFLNKGGSIL PMQEVALTTR GGSILPMQEV ALTTRNAHGQ EILLRNAHGQ EILLRNHNVL 14760
SAIPQEPYRN HNVLSAIPQE PYRNHNVLSA IPQEPYRNHN VLSAIPQEPY RNHNVLSAIP 14820
QEPYRSEAEP SQEYVSYSHG VFLRWASVID ATKWASVIDA TKDPSINDDS VMIYAPAVRF 14880
LDEALTYPPP KGIQINDPSI NDDSVMIYAP AVRIASAMLD EEDEKYFNVK NGDQSPPSAL 14940
GPLPSVIERP SINDDSVMIY APAVRTDYSV CGETTIFKVY LTGESYAGQY IPYIASAMLD 15000
EEDEKVYLTG ESYAGQYIPY IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKT DYSVCGETTI 15060
FKNGDQSPPS ALGPLPSVIE RVYLTGESYA GQYIPYTLIA GAGLLGTAHT ERETTIFKNG 15120
DQSPPSALGP LPSVIERTDV QKALHVPRDD SVMIYAPAVR FLDEALTYPP PKGIQINDPS 15180
INDDSVMIYA PAVRGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV MIYAPAVRGI 15240
QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKIASAMLDE EDEKYFNVKI ASAMLDEEDE 15300
KYFNVKIASA MLDEEDEKYF NVKIASAMLD EEDEKYFNVK IASAMLDEED EKYFNVKIAS 15360
AMLDEEDEKY FNVKIASAML DEEDEKYFNV KNGDQSPPSA LGPLPSVIER TDYSVCGETT 15420
IFKNGDQSPP SALGPLPSVI ERTDYSVCGE TTIFKNGDQS PPSALGPLPS VIERVYLTGE 15480
SYAGQYIPYI ASAMLDEEDE KYFNVKAHIL PPNGRDLNPN GSQFITPGGK DLNPNGSQFI 15540
TPGGKNDPVA VFDGSVIPKE AGLVPFQVSP TTKFHVLTAQ LSFPRFRDLN PNGSQFITPG 15600
GKLDRPPVIP LPPSDSDVTA FRNDPVAVFD GSVIPKPVAV FDGSVIPKTI SNVVDNELAR 15660
TTNGIVSTNE SGRDPVAVFD GSVIPKFALS TWARILPATS QVSTKAHILP PNGRAHILPP 15720
NGRAHILPPN GRDLNPNGSQ FITPGGKFAL STWARFALST WARFHVLTAQ LSFPRFHVLT 15780
AQLSFPRFRD LNPNGSQFIT PGGKFRDLNP NGSQFITPGG KFRDLNPNGS QFITPGGKND 15840
PVAVFDGSVI PKTISNVVDN ELARTISNVV DNELARTISN VVDNELARTT NGIVSTNESG 15900
RDWSDSYYQG PAFKFGLGAD NTLAFEVVTA DGQLVTASRG VGSDAWTVSE SGRITNEYVP 15960
QLEAVTPGSG CYQNEGNFRN VLENNPTGMA SVLRSKWDPN NFFYVLKTTA LTDLGIAYKV 16020
SAGVMGYQIL NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RWDPNNFFYV 16080
LKDWSDSYYQ GPAFKGVGSD AWTVSESGRG VGSDAWTVSE SGRGVGSDAW TVSESGRGVG 16140
SDAWTVSESG RITNEYVPQL EAVTPGSGCY QNEGNFRNVL ENNPTGMASV LRNVLENNPT 16200
GMASVLRVSA GVMGYQILNA AHAKVSAGVM GYQILNAAHA KVSAGVMGYQ ILNAAHAKVS 16260
AGVMGYQILN AAHAKVSAGV MGYQILNAAH AKVSAGVMGY QILNAAHAKV SAGVMGYQIL 16320
NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RALMNGAGAI KDAGYETSIT 16380
DYWGRDFFNH VTIKDGNWTT CVGCAILSRG FVPLEYVGSK HVYDAVQDKP TVYGFVPLEY 16440
VGSKTNTQVP DACTQCFQKQ ADMPMPLLVA DGRTAFSDIL AKSIALTDTF KILDSATYYK 16500
ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK 16560
ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK DAGYETSITD YWGRDAGYET SITDYWGRDA 16620
GYETSITDYW GRDAGYETSI TDYWGRDAGY ETSITDYWGR DFFNHVTIKD FFNHVTIKDF 16680
FNHVTIKDFF NHVTIKGFDN AGFVMGTSSS LFNQFMPLLV ADGRMPLLVA DGRMPMPLLV 16740
ADGRMPMPLL VADGRMPMPL LVADGRMPMP LLVADGRMPM PLLVADGRMP MPLLVADGRM 16800
PMPLLVADGR QADMPMPLLV ADGRQADMPM PLLVADGRQA DMPMPLLVAD GRQADMPMPL 16860
LVADGRTSIT DYWGRAHDDT VNYLYEELKK ATAFAVATYA NDLSSIPKGG DPNNVVALGG 16920
HTDSVEAGPG INDDGSGIIS NLVIAKGPYS AIVGISLEDG QKNLGCSEAD YPSDVEGKQP 16980
QVHLWSNADQ TLKTMTYSPS VEVTADVAVV KTTYNVVAQT KVGDEEIEAK AHDDTVNYLY 17040
EELKKAHDDT VNYLYEELKK AHDDTVNYLY EELKKQPQVH LWSNADQTLK TMTYSPSVEV 17100
TADVAVVKAG QFPISANDGA TSTKAGVLSW SYTWSPADKE AASAALAAGY KFDGVTWDEE 17160
NWLLKFDPSA AIYPWTSGRF VGGASTDAFA DPKLLPEEGI YITPNLPPQI PYVKPSAAIY 17220
PWTSGRVVLT LTGIEPSTIY TAEEENQVRA YVASDSELEY VTWTVDNRGD WEVTSILSID 17280
QERTLIPADK IPTGKTLSTN EEGYETSAVR VSQTNPTVTL SLLNIASKYP ILFTPYGGPG 17340
AQEVTKDGTD GWLDNLLSMK TLSTNEEGYE TSAVRKFYDS MYTERTLIPA DKIPTGKATS 17400
GGTSAAAPVF AGLVGMLNDA RDFTDITAGS SIGCDGVNPQ TGKGFPDVAA HSLTPRPDVA 17460
AHSLTPRPNS ALPQVLSNSY GDEEQTVPEY YAKSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKSYG 17520
DEEQTVPEYY AKVCNLIGLM GLRLKDLVLS LAWYQESAVS KATSGGTSAA APVFAGLVGM 17580
LNDARATSGG TSAAAPVFAG LVGMLNDARA WYQESAVSKA WYQESAVSKD FTDITAGSSI 17640
GCDGVNPQTG KGFPDVAAHS LTPRGFPDVA AHSLTPRGFP DVAAHSLTPR SALPQVLSNS 17700
YGDEEQTVPE YYAKVCNLIG LMGLRDAEEE PYDWSNEGRG ISDGIDWQAG YSAVQKMDDA 17760
EQYEATSRNI YIQSATLDGK PYSKSLNYIP VEDFDYKTLE YSYDDFTIAQ MARTMINPQD 17820
YTGENPLWKD NGIFVNSRSI NGYPLPGGAF VRMDDAEQYE ATSRTLEYSY DDFTIAQMAR 17880
DIDFGENGDG IKDYVPNTQI PVTVAANTFP GGQEGFIDFV KFQESPEGAD FWGARTKVTI 17940
SPELSIRVFQ TAFGPAGTML TYEPIVRADA IVAAIRLAED HINWVEIRVT ISPELSIRHE 18000
LGVDEIWRDI DFGENGDGIK DIDFGENGDG IKFQESPEGA DFWGARLAED HINWVEIRAG 18060
VKPSNYVGDI FGTLGGTPDF GPGRCDVATT DVYYSGKSKY TAEGYEAATK TASNFDQPHS 18120
DESALQHLRY CASAQEDNAT LQALLRYTAE GYEAATKYVD AGGFEPSIKL QALLRSKYTA 18180
EGYEAATKTA SNFDQPHSDE SALQHLRGHL TAMTGDGVND APSLKTAALV QGASDSGHFK 18240
TGTLTANQLS IRAYGIVVAT AKTGDGVNDA PSLKMLTGDA LAIAKLAIEH EVDAHGKIEN 18300
MLSHLSKDKS ETETETEIEI SNKIKEIQEA GDVRLSDELE DDNAPIGFET TKSVEIAQLH 18360
SEVEALVEKY TVTAGELTSD FKEVEVEKEW TKTETKTEIE IERIKEIQEA GDVRASSDDS 18420
NYGWEDSKGI QDAGVIATAK IGAQSTVLLK NFGEIGDASE YVYPEGLERY TPPNFSSWTR 18480
VNEFVDVQRA VDIVSQMTLT EKDSPNWDVD SDALPAIPEG AKEIPVGYSA ADIDTNRGVD 18540
YQPGGSSNLA DPIADAEGCK RNTLAFFSGN EVINDGPSSK YGLVEIDDGK VKTLADFDAL 18600
KYGLVEIDDG KVKDLMQAMA DFGPKFPGGN NLEGDTLDGR TGEVYASAVI VSKYPSNLDA 18660
WIPVDGSALS LKYVEVGNED NLNDGLDSYK FQAFYDAIKE QTYTGSFYVK ASLGHPEPWT 18720
VKDLMQAMAD FGPKELPSGP YFVSLYTGEV FKGISPEAHQ SLTTFTRLYP DDNLAFIQAG 18780
ISDEKQLLLA GGGWDGKSLF VSVYSVGTTD YRLYYTPTAE KPLAGLRGIS PEAHQSLTTF 18840
TRQLLLAGGG WDGKDSLSEA IAYAKGGGGG TFGVVMESTH RIANECQNQE LFWALRSQGG 18900
TAVIEEFPSW YEFYQKYVVP NAVTVGNAHF AATRSSGQGT LSLWTRAVTV GNAHFAATRG 18960
GGGGTFGVVM ESTHRGGGGG TFGVVMESTH RGGGGGTFGV VMESTHRIAN ECQNQELFWA 19020
LRSSGQGTLS LWTRYVVPNA VTVGNAHFAA TRYVVPNAVT VGNAHFAATR YVVPNAVTVG 19080
NAHFAATRAS SVSGVITLSD GRTTADSDGN FSFENVRVQD ETWELSDGSY ITKYDWSDFI 19140
NSAKYEEFEV PAGTLVKIWQ IGTLDRAYTQ YTETSVYGML KDGDLVTQQN ELQGKHEGWI 19200
DEAAVQEAKL HYGAYSIKSN LFNSYSENQV LLPASVYGSY KETYGSAAGW DKLADALAAS 19260
SLPEAWWGEN YEPLLNIKGG GGGTFGVVIE STHRIANECQ NQDLFWALRV EPQLSFVAAV 19320
IKYVTSNAVS VGVTHFAGSR AVFETAEGRG GGGGTFGVVI ESTHRYVTSN AVSVGVTHFA 19380
GSRDAEVAPP NDPVDPMAPD SSTKFEGYLP DARGSTGNVL VDVSHVLPSF RVGISWLSTE 19440
KLSITATGGD GNGDSQIYVQ KGAVNWEDGY RDAEVAPPND PVDPMAPDSS TKDSVKEDDY 19500
EDLFNYICAK KFTDTPVLYG PKMLDDAGIY LITDLSSPSE SINRSDGQCS DLLKQQLSFV 19560
MNQWYEKYGA YSVCSPKTLP AIESKKFTDT PVLYGPKMLD DAGIYLITDL SSPSESINRS 19620
DGQCSDLLKA DAAGSHGEAL NEVQAKAKAD AAGSHGEALN EVQAKLEAAE QALSEARVGA 19680
LESQLSTEQD AIKEAAESAG TTHSQQLQEL RDALEAAEAA AKIQEQLKGQ TPLPILVADG 19740
RNNILEGPDV KSHLSVVDGG EDGQNIPLHP LIQPERTIDY WTELVDTVKT STTLPEVCSK 19800
AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK GQTPLPILVA 19860
DGRINLGLNK NNILEGPDVK SHLSVVDGGE DGQNIPLHPL IQPERTFINL GLNKTSLTDY 19920
WGRFNVDETA FTGAWGRIGS LAITDVSLPF FKIQGISNPS GALSSGGLGE PKVQNGAVTW 19980
ESDPNRATTV YGESIKSIYA INSGRELDTQ HIHPPDSYFV SPLTRGFTEI DELWNGVTAE 20040
TNAAQDLRQA QVAHDFWQKF YHQVVELNRK DAELTDAGVK LNTGAVIPVL VRELDTQHIH 20100
PPDSYFVSPL TRLNTGAVIP VLVRLNTGAV IPVLVRQAQV AHDFWQKQAQ VAHDFWQKAI 20160
NDYIDSQLDK KGVQISTNIP KSSPWIMLGG SYPGMRYQSL EYQQSLCYRL FSLALKISIP 20220
IDHEDPSMGT YQNRAINDYI DSQLDKKCSS HDDCSDELAC TDGVCACTAD SAVTCSWEGH 20280
CAGAKLNLQY QASGDAKKSL VDFSAARGDN PSILGLRSAV TCSWEGHCAG AKIGTTIDDI 20340
KCTADSAVTC SWEGHCAGAK CTADSAVTCS WEGHCAGAKC TADSAVTCSW EGHCAGAKCT 20400
ADSAVTCSWE GHCAGAKAFP DVAAQGMNFA VYDKELYNIG DYQADANSGS KIAFASYLEE 20460
YARQGLQDIT LGASIGCTGR YADLENFENY LAPWAKAFPD VAAQGMNFAV YDKAFPDVAA 20520
QGMNFAVYDK ELYNIGDYQA DANSGSKYAD LENFENYLAP WAKYADLENF ENYLAPWAKA 20580
GSSPTDIISG ISDKTDALDS AIKKVEQAID DIIAKSAADG LASAITSKSG DDISTTDALA 20640
LPEPVQALTK SPTDIISGIS DKTDALDSAI KAQNDPNAFG VVAARLGACP PGKETALLGD 20700
KPNAFGVVAA RQNDPNAFGV VAARAATYCP ENIEKIENQS DADGYSSCST LKLTGLTTLT 20760
TLSFAALTKS DKLNVIDFPK VGSIEFTALP QLQSLDFTKL NVIDFPKTVN GGFQIARGVA 20820
AWLFERLSFG SIDLENANIN RSLSFIPGVL YDGSPIGKQE STFAAVERSC FEIGKFVDPL 20880
IGSNNGGNVF AGASLPYGMA KGWTQGGSNA DVVLTDAYVK VGISYISTDR AGNWQNLYKA 20940
QHPFLTIVDP EAQSRSVFSQ NESVAAGLKT TAVLFDEGKE ICLAALGRAL VIVSDSIRTD 21000
TIHGVGQNSF YKASHPIEVP VKASHPIEVP VKIMSILLGG AIPDDLKPLV LFDSVTKTAT 21060
ESEPSLSDIE KTGYVNYNVD TTNLRKHNPL VLFDSVTKTS PFPYDSKKHN PLVLFDSVTK 21120
KHNPLVLFDS VTKKHNPLVL FDSVTKTGYV NYNVDTTNLR APTPPDFSLG YIQSKIEQDG 21180
SESLLTNEYA PLKGYAFIWN MPAQGRTSGW GGNPGGYRYQ LASYLRDYLD EYLVFPPAGV 21240
QPQKIYVTGE SYAGRVDHLP DVPFDVGEMY SGLVPIDKDD KNFQELFGIK KTPLDDFRAD 21300
DVLEVNPLAD PEVVSYFRLD ADAITAQYFG NDAPWYRSDY ASFLYGPYRL VFAPQEEKAT 21360
WDGVDADKIR FQYPGDLFDQ GTTIRFTGDA ATVNSIAARP DSDEIYFGGQ FEKNLEVLSL 21420
TKHVAAYSFG SKAWTALGGG VNGPVHKNLA LLDGKDLTDY LMKSYELPDG QVITIGNERV 21480
APEEHPVLLT EAPINPKQEY DESGPSIVHR QEYDESGPSI VHRVAPEEHP VLLTEAPINP 21540
KVAPEEHPVL LTEAPINPKV APEEHPVLLT EAPINPKAEL PEGYPESSAN PAFRDIQYLE 21600
NYQGQGYSGP AVKFVTVTEE TDPDLFWALR LSLGDSGACK DAEVEPANWG VEGRLGGAQL 21660
FTSRTVSLVE DGSNTPATLS AGTFARSLVD IYRTVSLVED GSNTPATLSA GTFARAYVEM 21720
MQCTDEKEPL VRLEKDLPGT TLSSKYYGYG GGNPLGPAQG IGFANELIAR LEKDLPGTTL 21780
SSKLSEAGHS VLLIEKTPIE SDATSYLNDR GGPMGTYLVS ASERVILSAG TFGTPKAVIT 21840
DIVNQQRLIN QVELSEDKTI ARGGSNNFGI VTRLLLSDAM WYTRERPSAQ LLSGKFDTLG 21900
TSGPTAKLAN AYTWEGGRAV ADRIPLAIHD EVSPVGDTDA LLERAPVVQY ALNRDGYMGY 21960
HGVPQIPIYA YKAIHDEVSP VGDTDALLER AIHDEVSPVG DTDALLERAI HDEVSPVGDT 22020
DALLERDGYM GYHGVPQIPI YAYKLAEESA ALGVKVNPII LTGDMWRVSD NAGLGDWVPN 22080
PDRFPDGLTP LVEDVTKALG GTSTINGMAY TRSQLSDYAA ATVKAEDVQI DVWQKALGGT 22140
STINGMAYTR EIGFTVQEDN TDGKIDFGSA PNIVNAIAED RNSPVWPDGI QQTYEYPNRA 22200
STNMITSNSG AGLVPQDENR IGGSAGTELQ SDKITGEVWP VLMAYGQKSA ISQYGDSFAK 22260
SQSDFESEFS TAKVNAGIGI GPDDLVSFIK GNAMDHFSSI MERYGPTYAA YFLDQNEKAI 22320
TETQYEEAKD LTLDLPDIGL QYAGTVKTVA ALINWRNIWD GTTAQNVKKE DLETSSYSFS 22380
GDGKVDFASL QSAATQSTTY SNAPAVKTCS LVFLFPKKED LETSSYSFSG DGKFDGILGL 22440
GFDTISVNKY GSGSLSGFVS QDTLKWYSVY DLGNGAVGLA KDAYSPHEIY SRIFEQLEGM 22500
SLSKTYEVVG NVYKDQVLKD VALIKAVPGT AQQAAAIKDA GEFDVERGTV VTNDQCGGAS 22560
SVRLHLVTAE EADIKIIYDM PDGSSCKGID VAKPTGRVNG VWTVTHSPFE GLSALKSAMT 22620
LPRVNGVWTV THSPFEGLSA LKVPTVLMSP WVGKSIDQFF NDAKNVAPDD PDHSITGGNQ 22680
QVYSTYHPNA KESTLHLVLR IQDKEGIPPD QQRIQDKEGI PPDQQRIQDK EGIPPDQQRD 22740
VSLVANHIDT VGKTAATVNT WTGGWSDSKA IGTYQNSGLS QYTVRYSEGV HFPARTVANW 22800
LVREVAGDVD NAVNPAWRLG AGVQGFEAYE AANAQGLRLD GGVIEDFAQK NPDLSSTSDT 22860
TDVIRGPDEP YSGQYDEERQ FISVTNPTGA EPVPKFLSEL LEDEYFTKFV NIWLENTDYE 22920
SAANDPHLSK LLEYDIASGT PVYRNNNQGL EALTISPDGK VYAISDQDDT GPWIRDAYQN 22980
DFAARVDPST AVDYNHYSDA ADRSGDVQTL QFAWALQHLS ERTGNQTGQL GTYFNKNINM 23040
LLYGTDDCSG KGMVFSIDAQ GEKNINMLLY GTDDCSGKNP NPDQAFLQVR FWVATGDSSK 23100
AALDALQQSI YLQPKFSDGN GLFYQYERVA VAGYDDTTGG VGPLLAQKAI AIALQSSHRQ 23160
TGSVDGYAYT DANKNDLITY LKSVVENNND GLTAAYRVAP NSGAYLNEAD FRSLPLIVGN 23220
SDQEGKANEQ PTWVYRSDYQ ECADAPGQKF GATGDEYREP SNDPNPPETY SKVALLFSER 23280
LADGSIPTRS ISSDEDSAET EQSDSSDPKV AIIDGLADPW RTMGVGYATN DDSTIRDVPI 23340
MQELNTNTIR DVDPIVIKVE TGVIKPGMVV TFAPANVTTE VKIVVIGHVD SGKDDADLQE 23400
LGAKSSAFAF RKDPSDAIPS IPSIPISYKE AIPFLKEAAE IDSHWERDDY MPFIEVPRDD 23460
YMPFIEVPRA LQGVDELVEK DALHPQFDNF YQEQPKASYG AGVTIQDRDL SVFFTRINDL 23520
LPVYVELLQK AALTNMVNAA KGEITPEQYE KIINEPTAAA IAYGLDKQLT SEEIWQAEEK 23580
LDKPAGDYTI RDYSNNWESG ALKLAPNQMT GSLDATYLKL APNQMTGSLD ATYLKCASDG 23640
SAETCSWEGH CKCASDGSAE TCSWEGHCKC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG 23700
HCKCASDGSA ETCSWEGHCK LAAISVEPGK ASELGCSSGD LDCLCKVGEC AQMCISNMNA 23760
KGTLLSSNQG SQAADVKNDD DFLNYGISSK APSVITYDEA TKYEAAGITV HKDDYLPFID 23820
MPSEVTQIDA KIPMALDDWP TLSNMIFSGK DNFDTSSVTH RGYQINFLSN SAKDNIQGIT 23880
KPAIRDNIQG ITKPAIGPLG LSPKLQLWDT AGQERAEDYL LNPSPKNFGI GQDIQPKIDA 23940
TTNPGMRQLG LAMLGNKLVI DGLKEVTEIP ATADASRVNV DYTEVPRLAV NMVPFPRYCD 24000
LILGEWRDQI KDVLRIDYIG GGDLFRGSSP NVLYKSANWT PPEGIVRAAS TGSMAEQYTK 24060
AATGTYASST TVYKAENQAV AVGRALVEGS TFAKALYSSA ATGTYASSTT VYKATGTYAS 24120
STTVYKATTV YGESIKAYAD GYVQIVQTYA ASTGSMAEQY TKDLTWSYAA LLTANNRFNV 24180
DETAFTGAWG RGQSAQGASP GVVIASPSKI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KIGSLAITDV 24240
SLPFFKIQGI SNPSGALSSG GLGEPKKYTV PSTCGVKPSG ALSSGGLGEP KQAILNNIGA 24300
DGQSAQGASP GVVIASPSKS DPDYFYTWTR SIYAINSGRT GTYASSTTVY KTVGSSCPYC 24360
DSQAPQVRVQ NGAVTWESDP NRVQNGAVTW ESDPNRKPDY FYTWTRYTVP STCGVKSSAA 24420
TGTYASSTTV YKGAVTWESD PNRIVGSISQ LGSWNPSSAT ALSAVQSDVW RDINTVLGSI 24480
HTFDPQNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKA ASTGSMAEQY TKAENQAVAV GRAENQAVAV 24540
GRALVEGSTF AKALVEGSTF AKALYSSAAT GTYASSTTVY KAYADGYVQI VQTYAASTGS 24600
MAEQYTKDLT WSYAALLTAN NRDLTWSYAA LLTANNRIQG ISNPSGALSS GGLGEPKIQG 24660
ISNPSGALSS GGLGEPKNIG ADGQSAQGAS PGVVIASPSK PDYFYTWTRQ AILNNIGADG 24720
QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ 24780
GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KQAILNNIGA DGQSAQGASP 24840
GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI 24900
ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS 24960
KQAILNNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI 25020
LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKSAVQSDV 25080
WRSAVQSDVW RSAVQSDVWR SAVQSDVWRS AVQSDVWRSD PDYFYTWTRS DPDYFYTWTR 25140
SDPDYFYTWT RSDPDYFYTW TRSDPDYFYT WTRSDPDYFY TWTRSIYAIN SGRSIYAINS 25200
GRSIYAINSG RTVGSSCPYC DSQAPQVRTV GSSCPYCDSQ APQVRVQNGA VTWESDPNRV 25260
QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE SDPNRVQNGA 25320
VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE 25380
SDPNRVQNGA VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN 25440
RKVQNGAVTW ESDPNRKVQN GAVTWESDPN RKVQNGAVTW ESDPNRKASM VWEEAQQVSG 25500
KAVSPSFEDV WSQPRDGAGQ MFIPLNPNAY SPNTLNKDVG GPIEDQNSLQ VGDRFGFDLF 25560
DPTKGPTLLE DFIFRHGGPN FEQLPINQPR HVDGFGIHLF SYLDTQLNRL FYNSLTPAEQ 25620
QFVVDAIRNN VIIQLNRQDL FEAIEAGRSL TPAEQQFVVD AIRSVTSGFV DGIKVGFLAS 25680
VETPASIEAA SELSKTTDVG TFGQKDVHGF ATRIVPEEYV PITKFVTDNG DSKASMVWEE 25740
AQQVSGKASM VWEEAQQVSG KASMVWEEAQ QVSGKASMVW EEAQQVSGKA SMVWEEAQQV 25800
SGKASMVWEE AQQVSGKAVS PSFEDVWSQP RAVSPSFEDV WSQPRAVSPS FEDVWSQPRA 25860
VSPSFEDVWS QPRAVSPSFE DVWSQPRDGA GQMFIPLNPN AYSPNTLNKD GAGQMFIPLN 25920
PNAYSPNTLN KHGGPNFEQL PINQPRHGGP NFEQLPINQP RHGGPNFEQL PINQPRHGGP 25980
NFEQLPINQP RLFSYLDTQL NRNNVIIQLN RNNVIIQLNR NNVIIQLNRS VTSGFVDGIK 26040
SVTSGFVDGI KAAALAELVW SGNRAELVWS GNRASNSLQY VNVQVKDAYS PHEIYSREYL 26100
VANGVQAQAL VPKGIMLDTG RGVQAQALVP KHIVGATAPL WGEQVDDINV SHIVGATAPL 26160
WGEQVDDINV SSMIFEQLEG MSLSKVIPEI DMPSHSSSGW KYNVMANPDA NTPNFNYGGN 26220
GGSWCAPYKT YEVVGNVYKD IEADLQHAET VWGALHAFLV MWEDIALSAD NAHDVPKAAA 26280
LAELVWSGNR AAALAELVWS GNRAAALAEL VWSGNRAAAL AELVWSGNRA SNSLQYVNVQ 26340
VKASNSLQYV NVQVKASNSL QYVNVQVKAS NSLQYVNVQV KDAYSPHEIY SRDAYSPHEI 26400
YSRDAYSPHE IYSRDAYSPH EIYSRDAYSP HEIYSRDAYS PHEIYSRDAY SPHEIYSREY 26460
LVANGVQAQA LVPKEYLVAN GVQAQALVPK EYLVANGVQA QALVPKGIML DTGRIFEQLE 26520
GMSLSKIFEQ LEGMSLSKIF EQLEGMSLSK IFEQLEGMSL SKTYEVVGNV YKYNVMANPD 26580
ANTPNFNYGG NGGSWCAPYK YNVMANPDAN TPNFNYGGNG GSWCAPYKYN VMANPDANTP 26640
NFNYGGNGGS WCAPYKYNVM ANPDANTPNF NYGGNGGSWC APYKATSGGT SAAAPVFAGL 26700
VGMLNDARAW YQESAVSKDF TDITAGSSIG CDGVNPQTGK GFPDVAAHSL TPRPDVAAHS 26760
LTPRPNSALP QVLSNSYGDE EQTVPEYYAK SALPQVLSNS YGDEEQTVPE YYAKSNSYGD 26820
EEQTVPEYYA KSYGDEEQTV PEYYAKYLDQ QITAETKAWY QESAVSKAWY QESAVSKAWY 26880
QESAVSKAWY QESAVSKGFP DVAAHSLTPR GFPDVAAHSL TPRGFPDVAA HSLTPRGFPD 26940
VAAHSLTPRG FPDVAAHSLT PRPDVAAHSL TPRSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKYLD 27000
QQITAETKYL DQQITAETKA NEQPTWVYRF FCPTDYLIDV RGTPSVLTEQ GLVKLGVPGN 27060
ELAIEIGSTG DYNARQGTPS VLTEQGLVKS LPLIVGNSDQ EGKTFQGTPS VLTEQGLVKY 27120
PVVQNPVTLA ESSCQSVFNP NIPKNPSAGP GWDQAKPTNG PLAKFQGTPS VLTEQGLVKA 27180
NEQPTWVYRA NEQPTWVYRG TPSVLTEQGL VKNPSAGPGW DQAKPTNGPL AKSLPLIVGN 27240
SDQEGKSLPL IVGNSDQEGK SLPLIVGNSD QEGKARNHGT STVAPQVQAS VYRASVDISN 27300
VDTYSSTEVA NDDSFQQVGK ATFLVWDQQR KASVDISNVD TYSSTEVAND DSFQQVGKNH 27360
GTSTVAPQVQ ASVYRSSTEV ANDDSFQQVG KTLYLTDTDA GVPMIDPRTV YAFDVSEDGS 27420
YLKVASNGYV ITGAGKARNH GTSTVAPQVQ ASVYRARNHG TSTVAPQVQA SVYRATFLVW 27480
DQQRATFLVW DQQRATFLVW DQQRKASVDI SNVDTYSSTE VANDDSFQQV GKTVYAFDVS 27540
EDGSYLKVAS NGYVITGAGK VASNGYVITG AGKIENQSDA DGYSSCSTLK LTGLTTLTTL 27600
SFAALTKSAS SLNSIGDTFK SDKLNVIDFP KSLNSIGDTF KVGSIEFTAL PQLQSLDFTK 27660
TVNGGFQIAR LNVIDFPKGQ LGFWGNKGTY SGDLQLNGVK LNVIDFPKSD KLNVIDFPKS 27720
DKLNVIDFPK TVNGGFQIAR TVNGGFQIAR AVGSDEWTVR LGITYTTYSK MTNDYISALT 27780
KSEMLAEQDK MTNDYISALT KSTITTPWKS VVENNNDGLT AAYRVAPNSG AYLNEADFRY 27840
FYGDNYATLR SGAYLNEADF RTAVGSDEWT VRLGITYTTY SKMTNDYISA LTKMTNDYIS 27900
ALTKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA 27960
EQDKMTNDYI SALTKSVVEN NNDGLTAAYR SVVENNNDGL TAAYRSVVEN NNDGLTAAYR 28020
SVVENNNDGL TAAYRETTMF VLQGFGASMA RLNALQGGRL VQNDFNTLLR QDILGGMVDS 28080
YTDPKTGETT QIHARYGLEA AVPLMYESTG LGLGDMTKVS VADVKIDYIG GGDLFRLVQN 28140
DFNTLLRQDI LGGMVDSYTD PKYGLEAAVP LMYESTGLGL GDMTKALEAY KVNGKAVDFS 28200
GHDEFQGKEP SNDPNPPETY SKFGATGDEY RSDYQECADA PGQKYIARPD IMKSTLPDLS 28260
EVIKVNGKEV GQFKSVDNFH LLTVYAVDFS GHDEFQGKFG ATGDEYRYIA RPDIMKFLDE 28320
ALTYPPPKGI QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKYFNVKNGD QSPPSALGPL 28380
PSVIERPSIN DDSVMIYAPA VRTDYSVCGE TTIFKTVDDE EGVAAQFKIA SAMLDEEDEK 28440
FLDEALTYPP PKFLDEALTY PPPKGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV 28500
MIYAPAVRIA SAMLDEEDEK IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKY FNVKNGDQSP 28560
PSALGPLPSV IERNGDQSPP SALGPLPSVI ERAGAVAAVV YNNEKHGIPG GGIATGAEGI 28620
KLVLGDAVPE SAAPMGLTPP TKSDKELVSS SAFQSHVKSF EGFPKRLVAH SVATYARIAD 28680
LGKEEYNHPT RAGAVAAVVY NNEKHGIPGG GIATGAEGIK HGIPGGGIAT GAEGIKLVLG 28740
DAVPESAAPM GLTPPTKLVL GDAVPESAAP MGLTPPTKLV LGDAVPESAA PMGLTPPTKS 28800
DKELVSSSAF QSHVKFTDTP VLYGPKKFTD TPVLYGPKML DDAGIYLITD LSSPSESINR 28860
QQLSFVMNQW YEKYGAYSVC SPKSDGQCSD LLKWDVDLYS RLITDLSSPS ESINRDLSSP 28920
SESINRKFTD TPVLYGPKKF TDTPVLYGPK QQLSFVMNQW YEKQQLSFVM NQWYEKCDVA 28980
TTDVYYSGKG GTPDFGPGRS KYTAEGYEAA TKVATIGSAT FARYCASAQE DNATLQALLR 29040
YTAEGYEAAT KYVDAGGFEP SIKSKYTAEG YEAATKVATI GSATFARVAT IGSATFARYV 29100
DAGGFEPSIK DADACNGGGI EYDSPADTPL EFKDNTCNAP IPVSFPVAPT DTKEISFNQA 29160
WLRFAANGNY GSETTAAVIN NFNGRITTAD MDGISSWLPT INGKVIANGN VAGNILVIAK 29220
SDVSDFKEAG LKDADACNGG GIEYDSPADT PLEFKDADAC NGGGIEYDSP ADTPLEFKDA 29280
DACNGGGIEY DSPADTPLEF KFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRANNYCSN QVEGPYSLYS 29340
GRVSIWTESY GGRYGPSFTA FFQEQNEKTV YDMAMEAWSK ISYKEPGICE TTPGVKSAGY 29400
APLKPGGCKD QIIECRANNY CSNQVEGPYS LYSGRANNYC SNQVEGPYSL YSGRANNYCS 29460
NQVEGPYSLY SGRISYKEPG ICETTPGVKV SIWTESYGGR AIMGAEEAAK TGGAMWPYRT 29520
LIPDVVGIFA GTPKFVTNMQ AALLKALSEM ILQSEKDYYA SMLQQPKANF EVETPRGITG 29580
TSIARANFEV ETPRDYYASM LQQPKFVTNM QAALLKFVTN MQAALLKTGG AMWPYRTGGA 29640
MWPYRAEDYL LNPSPKLSDL TGDTEYAQLS QKTDDQVSLF ETTIRTDSGF AGLTNVNAAN 29700
GGGRYDNQES FLFAEVLKIT GQEIYRAEDY LLNPSPKTDD QVSLFETTIR AGFAGDDAPR 29760
QEYDESGPSI VHRSYELPDG QVITIGNERV APEEHPVLLT EAPINPKDLT DYLMKIIAPP 29820
ERSYELPDGQ VITIGNERVA PEEHPVLLTE APINPKALLF GAAGSAEDPV VVKNVGFPVV 29880
TVAEDAASSS IKVYATPDQD IEHGRAVEQS LDAIRQGLLT VEDRGPLNEG GLYAERLSGQ 29940
DASAITWKLT GNLGGEDYQD KASPSYLTAT PRALMNGAGA IKDAGYETSI TDYWGRPTVY 30000
GFVPLEYVGS KTAFSDILAK TNTQVPDACT QCFQKMPMPL LVADGRTAFS DILAKAFPDV 30060
AAQGMNFAVY DKELYNIGDY QADANSGSKI AFASYLEEYA RLETIGDTFK QGLQDITLGA 30120
SIGCTGRAFP DVAAQGMNFA VYDKELYNIG DYQADANSGS KQGLQDITLG ASIGCTGRLV 30180
EGAAAGIVVA SPSKQGVLNN IGADGKSSSA YESLTSAVKA SALIAYGNSL ISSDKSVYGI 30240
NNGRPDYFYT WTRPDYFYTW TRSNPDYFYT WTRSNPDYFY TWTRSNPDYF YTWTRSNPDY 30300
FYTWTRSNPD YFYTWTRSNP DYFYTWTRFS VAEILPGAKN VVLDTTALSA NTKVGTIITG 30360
DPLDPPVLKY PAEVFLPGGT YQLGKADKET DIGSAIEKAS AIQLDGIIYR QLSGHVGPLT 30420
SSSSKETDIG SAIEKADKET DIGSAIEKQL SGHVGPLTSS SSKQLSGHVG PLTSSSSKIY 30480
SFFVGGAVPE NLRQTSSEQN PSLEEIQAAQ ATVLPHSPVS NVKSAGEYNT FSPEWPVPLT 30540
KTFDENDTYE IGNKSIDQFF NDAKVPTVLM SPWVGKDGQE ATFHFDRVDW SPSFRAAEVI 30600
NYYTPDHVPV FNAMSIDQFF NDAKNAFITN YPSEQRYDTA TFIDKRIDAT TNPGMRQLGL 30660
AMLGNKNMHD VIGNDGTVPS EFRIDATTNP GMRIDATTNP GMRNAFITNY PSEQRNAFIT 30720
NYPSEQRQLG LAMLGNKAQI TAVNLEARGD GGGGPTFEHL EKSMDNDNTS LLVFGKMGES 30780
VDDFFARAQI TAVNLEARMG ESVDDFFARG IVSGEGEESS DPVKVDNVVA SFKYMQQLLD 30840
QTKVVWQDSV RAQNDPNAFG VVAARDPNAF GVVAARNDPN AFGVVAARAA TYCPENIEKA 30900
QNDPNAFGVV AARAQNDPNA FGVVAARTIF GWDIAEGQKS AGYTPLKVNG VEYGETRSAG 30960
YTPLKVNGVE YGETRSAGYT PLKVNGVEYG ETRGGSILPM QEVALTTRWA SVIDATKKAT 31020
GDVLFNTKHT ADGAWAKGGS ILPMQEVALT TRGGSILPMQ EVALTTRWAS VIDATKDGLE 31080
GSFKWDNLDS AALNTKVEDG NLILTMPKVE DGNLILTMPK VEDGNLILTM PKWDNLDSAA 31140
LNTKWDNLDS AALNTKSAIS QYGDSFAKSQ SDFESEFSTA KVNAGIGIGP DDLVSFIKSA 31200
ISQYGDSFAK SQSDFESEFS TAKGFNIVVA PGLDGRHVDV PLTGEDEITI LAIHDEVSPV 31260
GDTDALLERA PVVQYALNRY LVDQLNPEGK AIHDEVSPVG DTDALLERAI HDEVSPVGDT 31320
DALLERAPVV QYALNRAPVV QYALNRDAEL TDAGVKQAQV AHDFWQKLNT GAVIPVLVRL 31380
GDLSANPIER VLPQVIEATN RIYVTGQSYA GRLGDLSANP IERVLPQVIE ATNRVLPQVI 31440
EATNRNDPVA VFDGSVIPKE AGLVPFQVSP TTKTLGIDIA RGQTPLPILV ADGRTSTTLP 31500
EVCSKNNILE GPDVKGQTPL PILVADGRIN TAAYWKEAIA DVLEHLGEND EDIAVYAPNP 31560
FYKNSILEGP DVKMPMPILV ADGRMPMPIL VADGRNDDDF LNYGISSKSP VTSEYTSVRS 31620
IFEAANEKAI NDYIDSQLDK YLTNSQALAD LPYFAEKGVQ ISTNIPKGVQ ISTNIPKEII 31680
STYSIDGLRS VYQTMTDRYN TDAELYKGGS ELGFRSAADG LASAITSKSG DDISTTDALA 31740
LPEPVQALTK AGSSPTDIIS GISDKTDALD SAIKYDYENV DSDGANKYNL SNGAPAPETV 31800
TNKSMPTSGA VDLVAKCSSH DDCSDELACT DGVCACTADS AVTCSWEGHC AGAKGDNPSI 31860
LGLRCTADSA VTCSWEGHCA GAKDSPNWDV DSDALPAIPE GAKTLADFDA LKTLADFDAL 31920
KINPGPLARL YPDDNLAFIQ AGISDEKLYT GEVFKTDEGK GQEPPAAIVE VQKVAIIDGL 31980
ADPWRSVNIV NYTPSDSYTY SDNSGSWQSV KVTTGGQGAE FTLAKDQTTW SVDGNVVRVT 32040
TGGQGAEFTL AKVTTGGQGA EFTLAKAGQF PISANDGATS TKEAASAALA AGYKQTYTSC 32100
NPLKKTLNYA DALDGENYPQ TPSRVAVAGY DDTTGGVGPL LAQKINPSSG LLEPQTPLAV 32160
SPGSGPRVAV AGYDDTTGGV GPLLAQKTTG AFDESGPPLS QKNALQTMYD TQDKAALDAL 32220
QQSIYLQPKF SDGNGLFYQY ERLGAEVVTA GRIYAVADTQ ERLINQVELS EDKAVITDIV 32280
NQQRAVITDI VNQQRGENIL SAPLITYAPA GPELDEKELG FTAVGGEGKD IQYLENYQGQ 32340
GYSGPAVKIL QYAQGRDYSN NWESGALKDD YMPFIEVPRE AAEIDSHWER TIPIDNDVDY 32400
VVTGYRVYWV DSGPRTGDGV NDAPSLKDGQ EQEILARADA IVAAIRSALI AFEKNINMLL 32460
YGTDDCSGKG MVFSIDAQGE KTGTDQASVG YYKDAVYALD AIYGIDARDN ILPENLDDGL 32520
PSQFVYEKIL VENLQDQTAK ILVENLQDQT AKAEPYVTGS SAASGSNFVA DFAEAGTDGK 32580
QISYWAFTTP AVKFEPPAVY NDELKDAEEE PYDWSNEGRL SDELEDDNAP IGFETTKDQE 32640
MAVAAFRTSD DFASQMDGRC MGCDSTSIDV SRCMGCDSTS IDVSRDASGG DQITEWQDIY 32700
LPPITKGIQD AGVIATAKGV GSDAWTVSES GRGIDGDKGL VVKDLYGNIV MSGGSTLYPG 32760
IADRAGFAGD DAPRQEYDES GPSIVHRSYE LPDGQVITIG NERSYELPDG QVITIGNERL 32820
SGGVAVIKTT AVLFDEGKIG GSAGTELQSD KDLALVDPGL ELSYNTKLVG GSDFGEDEAK 32880
TLSTNEEGYE TSAVRASYGA GVTIQDRSAY VVYDLSNNEI SLANTKVPYL IGANTDEGTS 32940
FAIRLPVEAF QALASSTSET KDAGNAATND PLFPFSRAAL PGTEVLFADS VAKVTSAQYY 33000
VNPKIQAFVI YPENFDKVGA GVNVGELYAF ADKALTQYSV KTTYNVVAQT KTYANLPQAL 33060
VNSGAIKVIP LQGCDADEYG RDNIQGITKP AIRLANAYTW EGGRYQGASQ CPFRTMGVGY 33120
ATNDDSTIRC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG HCKLILPGEL AK 33172

Claims (9)

1.快速鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）用察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养待测土壤样品，制备待鉴别土壤样品的待测液，备用；
（2）采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，步骤包括：
a待测液加入到孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；
（3）通过比较AFT-YJFZ01浓度，得知农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，即丰度强弱次序——测定的AFT-YJFZ01浓度与土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度呈现正相关关系，即测定的AFT-YJFZ01浓度越高，则土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度越高，该土壤样品对应的农田的产毒真菌发生风险越高；
所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子是指AFT-YJFZ01肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1 所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01纯品溶液，替换待测液，用于制作标准曲线，计算得到待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的用察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养待测土壤样品并制备待鉴别土壤样品的待测液，其方法步骤为：称量待测的土壤样品，转移至样品稀释液中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取 10-1000 µL上述待测样品均匀分散液，加在含6-600 mL常规察氏液体培养基中，置于15~ 35°C下200 ±50rpm震荡培养，培养6-24 h后取样，形成待鉴别土壤样品的待测液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的样品稀释液是指含有0.1%山梨醇和0.1%绵糖的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板，其制备方法为：将AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0 μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4 ℃放置过夜或者37 ℃放置不少于2 h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后加ELISA常规封闭液，放置室温或37 ℃封闭不少于1 h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）的具体步骤为：
a将上述待测液，以每孔100-200 μL加入到孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，
b然后加入AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，
c然后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，
d然后先后加入显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液：2mol/L硫酸水溶液。
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