CN113831396B - 一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途。指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT‑YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其用于鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，容易推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子。
背景技术
黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。然而，迄今国内外仍没有黄曲霉毒素等微生物毒素污染前的分子预警研究范例，难以满足事前预警的迫切需求。
现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立，用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估，一旦检测发现，污染往往已经发生，难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。欧盟食品和饲料快速预警系统(Rapid Alert System forFood and Feed，RASFF)利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量，对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据，研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型，主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。
综合国内外近二十年研究进展，当前黄曲霉毒素早期预警分子不明是根本原因。针对这一瓶颈难题，发明人团队经过十多年攻关研究，构建了我国黄曲霉毒素产毒菌株库、菌株产毒力数据库、强产毒菌株蛋白质抗体库，建立了用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的抗体库方法，并成功发明了一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子，并用于鉴别菌株产黄曲霉毒素能力，发现农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供科学依据。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，以及鉴别体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的用途。用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，容易推广应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
提供一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
提供鉴别体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的方法，基于指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量检测，进行体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的鉴别，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体可通过采用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列或其中的部分序列，通过常规抗体制备流程，制备出与该蛋白质对应的抗体，并实现对该指示分子蛋白质的定量检测，也可以通过其他检测技术手段实现对这些与该蛋白质有一一对应关系的定量检测，从而达到上述用途，部分序列是指与该指示分子蛋白质有一一对应关系的全序列中的一部分。
鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力的应用，待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强；
具体应用方法包括：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别菌株的待测液的制备：待鉴别菌株培养，稀释，获得待鉴别菌株的待测液；
具体可为：将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜菌株生长的培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释1-10倍，获得待鉴别菌株的待测液；
(4)待鉴别菌株产黄曲霉毒素能力的测定：
采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力，步骤包括：a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待测液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果。
具体步骤为：
a将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中(以200μL/孔)，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液(每孔加300μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待测液适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
按上述方案，采用系列浓度梯度的产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液制作标准曲线。
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008在鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的应用，具体应用方法，步骤如下：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别样品的制备：待鉴别样品培养，稀释，获得待鉴别样品的待测液；
具体可为：称量待鉴别样品，转移至适量无菌水中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取10-1000μL样品均匀分散液加在含6-600mL常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于15-35℃下200±50rpm震荡培养，培养6-24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
(4)用于鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株：步骤包括：
a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待鉴别样品液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；
具体步骤为：
a将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中(以200μL/孔)，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液(每孔加300μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待鉴别样品液适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中(每孔加入200μL)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
(5)鉴别结果评判：
待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量越高，则说明待鉴别样品中产黄曲霉毒素能力即产毒力越强，根据上述酶标仪计算结果，获得单位体积待检测样品液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
按上述方案，所述的待鉴别样品为土壤、农产品、中药材或者饲料等。
按上述方案，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同，具体地：
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得；
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的多克隆抗体制备技术方案即可研制获得指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体；
所述的与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，可以直接购买商品获得。
黄曲霉菌株产毒力是衡量菌株产生黄曲霉毒素能力的指标，菌株产毒力越强，表明该菌株在相同时间和培养条件下能够产生黄曲霉毒素的量越多。本发明提供了一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量与菌株产毒力成正相关的特征，进一步提供了鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的用途，实用且易推广用，为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供了关键抓手与科学依据，对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
本发明有益效果在于：
1.可用于鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌菌株产黄曲霉毒素能力；
2.可用于鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株；
3.易操作，实用性强，容易推广应用；
4.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
具体实施方式
实施例1指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的制备
按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)NaNO3，0.1％(w/v)K2HPO4，0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，0.05％(w/v)KCl，0.001％(w/v)FeSO4，pH6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-122-2、JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008。试验结果表明，上述产毒菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZP008，在同样培养条件下，HBHA-8-17制备得到AFT-YJFZP008的量最多，而HLJ-1制备得到AFT-YJFZP008的量最少。
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的初始获得用发掘方法：
用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子AFT-YJFZP008的方法如下：
(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
实施例2指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作参考专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，参考专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用AFT-YJFZP008和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为AFT-YJFZP008的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经ELISA方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
实施例3指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的单克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得AFT-YJFZP008单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点的AFT-YJFZP008单克隆抗体。
实施例4指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体。
实施例5利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别黄曲霉毒素的菌株产毒力
第一步，待鉴别菌株的待测液的制备：按菌株产毒力强弱，选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株，待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释5倍，获得待鉴别菌株的待测液。
第二步，上述待鉴别菌株待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成2μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量。
根据上述文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》结果，HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌株的产毒力依次为：0μg/L、0μg/L、3.8μg/L、4.9μg/L、67.2μg/L、81.7μg/L、192.0μg/L、204.4μg/L、297.4μg/L、1027.5μg/L，表明HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株，HBHA-1-4和GDZJ-6等为弱产毒力菌株，HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒菌株。
第三步，鉴别结果评判：待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强。按上述技术方案测定HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌的AFT-YJFZP008含量的结果——每毫升培养基中依次含有AFT-YJFZP008量为：0ng、0ng、7.8ng、11.2ng、43.7ng、51.5ng、99.4ng、109.0ng、166.5ng、562.3ng，结果同样表明：HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株，HBHA-1-4和GDZJ-6等为弱产毒力菌株，HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒力菌株。该测定结果与上述公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》公布的菌株产毒力强弱次序一致，且强产毒力菌株与弱产毒力菌株鉴定结果与文献一致，证明本发明提供的技术方案可以用于鉴别黄曲霉毒素的菌株产毒力，方法简便、易操作，实用性强。
实施例6利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别农田中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取吉林、辽宁、江西、福建等花生花期根际土壤样品共4份，依次命名为土样-1、土样-2、土样-3、土样-4。依次称量待测的农田土壤样品，粉碎后转移至无菌水中，浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散样品均匀分散液液。取50μL土壤稀释液加在含30mL常规沙氏液体培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液(浓度为0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL，用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并基于标准曲线计算AFT-YJFZP008含量结果。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述技术方案测定土样-1、土样-2、土样-3、土样-4中AFT-YJFZP008含量结果——每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量依次为：0.2ng、0.1ng、10.6ng、19.2ng。该结果表明，土样-1和土样-2中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在1.0ng以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险很低；土样-1和土样-2中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10ng以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险较高。
实施例7利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别农产品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取花生、玉米、大米、小麦等农产品样品共4份，依次称量待测的农田土壤样品，粉碎后转移至无菌水中，浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取100μL样品均匀分散液加在含50mL常规沙氏液体培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养6h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度(浓度为0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL，用于获得标准曲线)的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液(用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取，并基于标准曲线计算AFT-YJFZP008含量结果。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述技术方案测定的花生、玉米、大米、小麦样品中AFT-YJFZP008含量结果——每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量依次为：10.2ng、12.6ng、0.4ng、0ng。该结果表明，花生和玉米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10ng以上，其含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险较高；大米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量在1.0以下，不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险很低；测定的小麦样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量为0，不含有黄曲霉毒素产毒菌株，基本无黄曲霉毒素污染风险。
实施例8利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008鉴别饲料中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：从市场上选取待测饲料样品共4份，依次命名为饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4。依次称量待测的饲料样品，粉碎后转移至无菌水中，浓度0.5g/mL,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取50μL样品均匀分散液加在含30mL常规沙氏液体培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述待测液体适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液(浓度为0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL，用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述技术方案测定饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4中AFT-YJFZP008含量结果——每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量依次为：0.5ng、20.3ng、14.2ng、72.9ng。该结果表明，饲料-1样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量在1.0ng以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其污染风险很低；以50μL样品均匀分散液加在含30mL培养基中为例，饲料-2、饲料-3、饲料-4中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10ng以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其用途
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 6579
＜212＞ PRT
＜213＞ 黄曲霉
＜400＞ 1
AASLPASFSG FKAFDSSFPL PKAFPNAPDK AGVIPESLHQ DTVGTFGKAI HDEVSPVGDT 60
DALLERAIND YIDSQLDKAL LFGAAGSAED PVVVKALTNG AGAIKALVSH DGTFVADAKA 120
NNYCSNQVEG PYSLYSGRAP VVQYALNRAS MVWEEAQQVS GKASPSYLTA TPRAVEQSLD 180
AIRAVGQATE RAVITDIVNQ QRAVSPSFED VWSQPRAYQG YFHSNDDLLN RCDVATTDVY 240
YSGKCVTAPS GPCGQKCYAL VNHEFSRDAD ACNGGGIEYD SPADTPLEFK DAGSPKPVVQ 300
IGHEGDVGVA EIQNMRDAGY ETSITDYWGR DAVYALDAIY GIDARDERAS LDVEPSLPWP 360
NDGIFRWRDF FNHVTIKDFG WDSAFDQKGN SLGLCLPTDF KDFPCDVQRP PDLAANDAKD 420
FTDITAGSSI GCDGVNPQTG KDGAGQMFIP LNPNAYSPNT LNKDGDLVTQ QNELQGKDLD 480
QDIEKKDLND GGSSVGVQNR KDLNPNGSQF ITPGGKDLPW YQCNQEIHTL VSGLLRRDNI 540
LPENLDDGLP SQFVYEKDNT CNAPIPVSFP VAPTDTKDPF KAIITLSARL DTFATINTLF 600
KDPPINMGPI PATTDLTNMD RRDPYMFHQA NLRDQCNYSL QYTIGNKDQE KRQRDQIIEC 660
RDTLVIPPGS RDTSLCPMAP PNSFMSTLPM TADFRDTTGF IETDPLKDVH GFATRDVVEA 720
FRDYACPWNG GEEVSLKEAA SAALAAGYKE AGLVPFQVSP TTKEEYDEGL RMVNKGLAKE 780
GNESVQVPRN HALSSDREHH ELAIASKEIN QIQREISFNQ AWLRELSATV MDHLLSQREL 840
VLVLGREPGA EGVCETTPGV KEPGICETTP GVKERELDSR ESEFFIRFAL STWARFANQM 900
PNGCQDLIST CKFASDDACE EKFEEIAPYV NGKRFEGYLP DARFENSNVK FENSNVKSSV 960
VRFGKPVGAV GSAATALKFG WWSADGAWPG ALDDFVVWVQ KKFHDSSNDS GNRFHVLTAQ 1020
LSFPRFLDEA LTYPPPKFNS LADRFQYPGD LFDQGTTIRF SSCSGTRFST VAGSRFSVAE 1080
ILPGAKFVGG ASTDAFADPK FVTDNGDSKG ADRGRGDAGS PVFSPDSKGF FTAPGRGGGG 1140
GTFGVVMEST HRGGSGALGL AFSEAKGIDV AKPTGRGIQI NDPSINDDSV MIYAPAVRGL 1200
RNSGVHGTFS SRPEQEEIQK GLYAGHRGPL NEGGLYAERG QTPLPILVAD GRGSDCSTTA 1260
GGCCGGTGCQ PNETLVFGSS DLARGVDFTE DPLLQGRGVG SDAWTVSESG RGVLRPVSTG 1320
SRGVYDIRGY KPSASSGSKG YPTSQQNWVG TLLLPRHAGQ CGEYHENKHF QLINTAAYWK 1380
HFTSLEEKHF VDTFGLHGHK HGGPNFEQLP INQPRHLFGL HRHTDYSSQE STSYKHVDGF 1440
GIHTFRHVYD AVQDKIAFAS YLEEYARIAP QFGDLKIASL NDSYETLKKR IFRLLGTPDE 1500
DSWPGVTSFP DYKILFDSNN VATGVQVSTG GTFGTRINPH ELSIRDPDFY NEIYVTESKR 1560
IQAFVIYPEN FDKISAYVEG SSRISHHAQT LLEGLGTHRY LESCTERISY KEPGICETTP 1620
GVKIVPEEYV PITKIVQVGD LRIVTPDGKI YDSIYVRKAK ESSSESSDSS ESESESESED 1680
EKKFTDTPVL YGPKKMEDDL RKPLGTGTDL WPKKTLLFYA SSHEAISFDS CRKTSSSTAT 1740
STSTSTGAAA LPTAAFGAVE GGLMLGVVLG VLGLLDRPPV IPLPPSDSDV TAFRLEELNQ 1800
RLEQYRMQLS GLLSQNGQGS KLFSIPADAG DDYKPKLFSY LDTQLNRLFY NSLTPAEQQF 1860
VVDAIRLKDL VLSLLNLSSF DASGYIDRLN TGAVIPVLVR LPDICNTCFK LSQLESGKLS 1920
SIALPRLTDL EINRLTGNLG GEDYQDKMPM PILVADGRNA GIQTSRNAHG QEILLRNALQ 1980
TMYDTQDKND PVAVFDGSVI PKNFDNDQHR NFQELFGIKN GDQSPPSALG PLPSVIERNH 2040
NVLSAIPQEP YRNHTAGIEA RNLETERQLR NLEVLSLTKN LVGTSGFTSA RNNVIIQLNR 2100
NPDLSSTSDT TDVIRNSILE GPDVKNSVVG IKPTVGLTSR NVGLVSVSLD GKNVLDYGAR 2160
NVVLDTTALS ANTKNWHRLS FTYNCTPSAN YQYIPAYKNY FAETEQVMFQ PGHIVRNYIV 2220
VDADSSPLQI VIDGFRPPME DIVSPTLEDL IHLALRRPPQ PDGATCIKGN ECEAFCVDGV 2280
CKPQGDPKPQ SIDTIVGTNL HMDILSDLAA ALAGSIGVAP SSNLDPTRKP VADAAVVNAC 2340
ESFPLSFDTD VSRRPWVGGQ IVNSIPASVE KIAVLEQVRQ DGHFSVPSYA GHVATMTSVS 2400
LRRQDLFEAI EAGRQIQTSR QLPPSLPYTF YTSYTSEDSY KKQLSEDGVD VVVVAERRDE 2460
EHQLDDDFEG IDDEMDESQS RRPDLSTFFA TLSEISPDEA RRPFIIARRP GDRSHSRSAA 2520
ALSTSEKSAA ALSTSEKDWL QVRSAADGLA SAITSKSAGY TPLKSAMTLP RSATVMTYWK 2580
TEEGAPLPGC PRTTLQRSDD AITRTNPDAL KASAVPGASA KSGNYSYGVR SGSSFSSIGS 2640
AISMSKSGSV ALGKSHLSVV DGGEDGQNIP LHPLIQPERS IAVKAPSPTE PGSPASPGGS 2700
QPRSIISRML VTDPKSLGDV CMDLQTITTS SDPDPKRSNI TEILPAGTPL PGTAATARQN 2760
PNPAAAASTG GQDGGPNDAV PRSPAAVQGI YGNRSSEKPS ITIDGNNINK SSGAVTGQST 2820
RSSGTGTSTG AAATGTETNA ASVAKLQMGV SAAGIAGLAL GIWALSSHPI EVPVKSTDTS 2880
INVRSVTSGF VDGIKSVTSG FVDGIKDGLR TALADYALCA EATNMCRTAS NFDQPHSDES 2940
ALQHLRTAVP INGPDSPGTP EGVKTDYSVC GETTIFKTGY VNYNVDTTNL RTIFGWDIAE 3000
GQKTISNVVD NELARTIVSP DGFNWDYGST RTLGIDIART LSTNEEGYET SAVRTMLVGM 3060
DVTHPSPGSS ANAPSVAGMV ASVDSTLSQW PAEIRVQRTN TQVPDACTQC FQKTQGPHST 3120
FDRTSGSGSS SPEPRTTDVG TFGQKTTGAF DESGPPLSQK TTNGIVSTNE SGRTTSQWNV 3180
LDLKTTTLDQ GHYQSRTTYN VVAQTKTVNV NNLKVALVYG DRVATIGSAT FARVCNLIGL 3240
MGLRVDFYNN LKVELQSKVE RTGYAAFRVE SASADLISTI TKVFDAGHTV PAFQPETMFR 3300
VFEAGHEVPA YQPETAYEIF HRVGEEETPA LVHDLNTAMR VGFLASVETP ASIEAASELS 3360
KVGGTLAYVS VEIEKVKVGT IITGDPLDPP VLKVIPLQGC DADEYGRVLL HPLLTAAALL 3420
GASARAQSVV GTPFGFASGT TGGGNAAPAA PKVNGVEYGE TRVQLDEGLK RVSIWTESYG 3480
GRVSNDLARV SQISGNRPLD ALDQGTRVSY TEYDSYYDHY NKVTNSPSNL VWYSISTRVV 3540
AVDTASNKVV NYYSDDPTGM SDSGEDAFDM RKVYATPDQD IEHGRWNETI YVIITSFSDT 3600
LTIQPYDWNE FRKWNFIMNS RWRHYYLRYA GEYEFQADLF KYCASAQEDN ATLQALLRYD 3660
LNLENKYGPS FTAFFQEQNE KYKEPGAEGV CETTPGVKYL ASTQMEPTDA RYLDQQITAE 3720
TKYLDTLPEI KYLTNSQALA DLPYFAEKYL VDQLNPEGKY QGASQCPFRY QPHTVTTVSA 3780
GASDPRGSPE GGGRYVDAGG FEPSIKYVTS NAVSVGVTHF AGSRAAALAE LVWSGNRAAA 3840
PKSAALDALQ QSIYLQPKAA TYCPENIEKA EDYLLNPSPK AEHCFDYDLS YKPADKAENQ 3900
AVAVGRAGAV AAVVYNNEKA GKPTLGFLNP LLYSGALKAG SSPTDIISGI SDKAIHDEVS 3960
PVGDTDALLE RAIMGAEEAA KALSEMILQS EKALVEGSTF AKALYSSAAT GTYASSTTVY 4020
KANEQPTWVY RANFEVETPR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA PVVQYALNRA QNDPNAFGVV 4080
AARASAIQLD GIIYRASMVW EEAQQVSGKA SNSLQYVNVQ VKATGDVLFN TKAVGQATER 4140
AVHEDLDVAA IDAAEVRAVL LLDEADVFME ERAVSPSFED VWSQPRCQSV FNPNIPKDAY 4200
SPHEIYSRDF TDITAGSSIG CDGVNPQTGK DGLEGSFKDK DPEKDPKAIE LPRDQIIECR 4260
DSGLVMKDSP LYPYRDVHGF ATRDVKSMKD VVVVGGGASG AYAAVRDYQV EMVNKEAGLV 4320
PFQVSPTTKE EPSFQPDDVT LLLSQDPGHW EKEGISIHTC DQREHHELAI ASKEIPVGYS 4380
AADIDTNREL DTQHIHPPDS YFVSPLTREP GICETTPGVK EPSNDPNPPE TYSKESLEDI 4440
RKEYLVANGV QAQALVPKFE PPAVYNDELK FGATGDEYRF GKPVGAVGSA ATALKFLDEA 4500
LTYPPPKFNV DETAFTGAWG RFRQDLISEI KPCCEEKFTA VFTPSIVERF TDTPVLYGPK 4560
FVTDNGDSKF VTNMQAALLK GFPDVAAHSL TPRGGSILPM QEVALTTRGI DVAKPTGRGI 4620
MLDTGRGKES CKGLYAGHRG MVFSIDAQGE KGPARRRGQL GFWGNKGSIV GPRWKLPFMG 4680
PFLQSVNPKG TVFPSETEGE SMASRGVDFT EDPLLQGRGV KISGWDVETL GDEITHVGEK 4740
FTKGYKPSAS SGSKHAGQCG EYHENKHFTS LEEKHFVDTF GLHGHKHGGP NFEQLPINQP 4800
RHGIPGGGIA TGAEGIKHMF GLVASEDAGR HPVEVAEEEA SKPKHVDGFG IHTFRHVQLL 4860
QLNMEYDDDI LCRKSKHVYD AVQDKIAFAS YLEEYARIDA TTNPGMRIDY IGGGDLFRIE 4920
IENSIRIENQ SDADGYSSCS TLKIFEQLEG MSLSKIFSYK MNSTLRYLPF RIGLHFRTRI 4980
HLTVPEDLRI QDGSQVKIQG ISNPSGALSS GGLGEPKIQS KLRGLVQRIR DAMRQRIRLH 5040
LERTGQLGVG SDGNPVVAGR ISAYVEGSSR IVPEEYVPIT KIYSFFVGGA VPENLRIYVT 5100
GESYAGRKDI RHGHKKEHDK SKFTDTPVLY GPKKGDAPTI DTSNYFLFGK KMEDDLRKYT 5160
VPSTCGVKLE MYQGGIELSA LLQMIQDAIR LFSYLDTQLN RLGITYTTYS KLKDLVLSLL 5220
NALQGGRLNT GAVIPVLVRL NVIDFPKLQV RAAARRLSAG SRLSELEWIR LSQLESGKLS 5280
SIALPRLTDL EINRLVAHSV ATYARLVCFF PTKLVQNDFN TLLRMAPMSE EDLAWFRSTF 5340
HPIPKMGSLS DVRMKSIEEK GEGMTNDYIS ALTKNAFITN YPSEQRNAGI QTSRNFSRPK 5400
NHGTSTVAPQ VQASVYRNHN VLSAIPQEPY RNINMLLYGT DDCSGKNLDE LWIVGHGAVA 5460
RNLVGTSGFT SARNMHDVIG NDGTVPSEFR NNVIIQLNRN SMTDCCIETY LMKSERNTLA 5520
FFSGNEVIND GPSSKNTPVP SCFHFFIYKG CWMFLYRNYF AETEQVMFQP GHIVRPDGTG 5580
FRKPLWRHYF QNTQGIIFVV DSNDRPVVQV LMPEGMDSDE SQAILNNIGA DGQSAQGASP 5640
GVVIASPSKQ DLFEAIEAGR QTYASCWGGV GQGECRGSSN CKRCWSGVFY SNWIQELLRR 5700
SMGLESRSAA DGLASAITSK SAISQYGDSF AKSAMTLPRS AVQSDVWRSD GQCSDLLKSD 5760
KLNVIDFPKS DYDAFIRSDY QECADAPGQK SDYSALQSQG LILSLRSEML AEQDKSESNP 5820
GVMSTRSGAD THKSIVIRSI YAINSGRSLP LIVGNSDQEG KSQSDFESEF STAKSSGAVT 5880
GQSTRSSSAY ESLTSAVKST DTSINVRSVV ENNNDGLTAA YRTALFDSHE YRTASNFDQP 5940
HSDESALQHL RTCHRCCTTF APDATECENC KHTRTDYSVC GETTIFKTGE TTQIHARTGP 6000
SIQDRTISNV VDNELARTKS LPRTLPPLQY RDLDLLPLHQ NLIKTLVSTG RTPAAHRART 6060
SGSGSSSPEP RTTDVGTFGQ KTTEMTQRTT SNPETRTVGS SCPYCDSQAP QVRTVNGGFQ 6120
IARTVNVNNL KTVYAFDVSE DGSYLKTYEV VGNVYKVALV YGDRVAPNSG AYLNEADFRV 6180
ASLLQRVATI GSATFARVCN LIGLMGLRVD NVVASFKVEY SDAAKVFEAG HEVPAYQPET 6240
AYEIFHRVGS IEFTALPQLQ SLDFTKVIPE IDMPSHSSSG WKVLDRDPNH AKVLFLGRVL 6300
IADMCRRVLP QVIEATNRVQ NGAVTWESDP NRVQNGAVTW ESDPNRKVSN DLARVTAMRY 6360
WWLCEIAYCF ASVGGKVVTD SFRVYSVDNS KWDNLDSAAL NTKWFAEDPS RYCASAQEDN 6420
ATLQALLRYC GVGVNILYER YEAAIQGVAA TDKYFYGDNY ATLRYGAYSV CSPKYGETEK 6480
SGLESIAAAR YIARPDIMKY LDQQITAETK YLVDQLNPEG KYQFPQTPSR YRHLPPETVT 6540
GILGRATFWW INSILKYTAE GYEAATKYVD AGGFEPSIK 6579
Claims (10)
1.一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，其特征在于：指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种鉴别体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的方法，其特征在于：基于指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量检测，进行体系黄曲霉毒素产毒菌产毒力的鉴别，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力的方法，其特征在于：具体鉴别方法包括：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别菌株的待测液的制备：待鉴别菌株培养，稀释，获得待鉴别菌株的待测液；
(4)待鉴别菌株产黄曲霉毒素能力的测定：
采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力，步骤包括：a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待测液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的特异性多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的步骤(3)为：将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜菌株生长的培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释1-10倍，获得待鉴别菌株的待测液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)为：
a将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待测液适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
6.鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的方法，其特征在于：具体鉴别方法步骤如下：
(1)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体：
(2)提供指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体；
(3)待鉴别样品的制备：待鉴别样品培养，稀释，获得待鉴别样品的待测液；
(4)用于鉴别样品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株：采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别样品，步骤包括：a酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；b加入待鉴别样品液反应，洗板；c加入AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；d加入与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体，反应，洗板；e加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；
(5)鉴别结果评判：
待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量越高，则说明待鉴别样品产黄曲霉毒素能力即产毒力越强，根据上述酶标仪计算结果，获得单位体积待鉴别样品液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株；
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的步骤(3)为：称量待鉴别样品，转移至无菌水中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取10-1000μL样品均匀分散液加在含6-600mL常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于15-35℃下200±50rpm震荡培养，培养6-24h后取样，形成待鉴别样品的待测液；所述的待鉴别样品为土壤、中药材、农产品或者饲料。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)具体步骤为：
a将AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体用ELISA包被缓冲液配制0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
b然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将待鉴别样品液适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
c然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008的多克隆抗体适当稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
d然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记抗体根据需要稀释，加入到酶标板孔中，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；
e然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算AFT-YJFZP008含量结果。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同。
10.根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于：步骤(b)中采用系列浓度梯度的产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液替换待测液或待鉴别样品液，制作标准曲线。
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| CN109468367A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-03-15 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 黄曲霉毒素产量与Nor-1基因转录量的同步检测RT-PCR试剂盒及其检测方法 |
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| CN113150160A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-07-23 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种黄曲霉毒素m1抗独特型纳米抗体及其制备方法 |
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