CN113834938B - 黄曲霉预警分子参考物质、制备方法及其应用 - Google Patents

黄曲霉预警分子参考物质、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了黄曲霉预警分子参考物质、制备方法及其应用。其由黄曲霉产毒菌制备获得，含有黄曲霉毒素预警分子AFT‑YJFZP008，黄曲霉毒素预警分子AFT‑YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，黄曲霉预警分子参考物质通过检测标定其中AFT‑YJFZP008的含量，作为参考物质使用。可用于鉴别比较农田土壤、农产品及饲料等产品的黄曲霉毒素污染风险水平；稳定性好，货架期长，易操作，实用性强，容易推广应用。

Description

黄曲霉预警分子参考物质、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及黄曲霉预警分子参考物质、制备方法及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。
对黄曲霉毒素污染产品实施预警是国际通行做法。现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立，用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估，一旦检测发现，污染往往已经发生，难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。欧盟食品和饲料快速预警系统(Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF)利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量，对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据，研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型，主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。
已有研究表明，黄曲霉毒素的产毒真菌不同菌株之间产毒力差异很大，从不产毒真菌菌株一直到高产毒力菌株都有分布。以花生中分离的黄曲霉菌株为例，有相当一部分黄曲霉菌株缺失了产毒基因或产毒关键调控基因，它们不具有产生黄曲霉毒素的能力；有约不到20％的黄曲霉菌株为强产毒力菌株。如何在黄曲霉毒素污染事前评估预警风险？这一直是本领域的世界性难题。
综合国内外近二十年研究进展，当前黄曲霉毒素早期预警分子不明是根本原因。针对这一瓶颈难题，发明人团队经过十多年攻关研究，构建了我国黄曲霉毒素产毒菌株库、菌株产毒力数据库、强产毒菌株蛋白质抗体库，建立了用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的抗体库方法，发现了黄曲霉毒素的产毒真菌产毒力指示分子，并首次明确其具有黄曲霉毒素污染事前预警功能，因此成为黄曲霉毒素预警分子。研究发现该预警分子发生水平与黄曲霉毒素污染水平之间存在显著的正相关关联性，由此利用此关联性，进一步建立了黄曲霉毒素分子预警方法。然而，在实际应用中我们发现黄曲霉毒素预警分子纯品用作标准物质时存在稳定性较差容易引发检测结果偏离的问题。进一步，我们为了通过准确检测黄曲霉毒素预警分子以实现其预警功能，本发明提供了含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质黄曲霉预警分子参考物质及其制备方法，并建立了参考物质的标准曲线，用于黄曲霉毒素污染风险预测预警，攻克了上述难题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供黄曲霉预警分子参考物质、制备方法及其应用，其用于预测预警黄曲霉毒素风险水平，容易推广应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
黄曲霉预警分子参考物质，其由黄曲霉产毒菌制备获得，含有黄曲霉毒素预警分子，黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，黄曲霉预警分子黄曲霉预警分子参考物质通过检测标定其中AFT-YJFZP008的含量，作为参考物质使用。
按上述方案，所述的黄曲霉预警分子参考物质黄曲霉预警分子参考物质中的AFT-YJFZP008含量通过采用黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列或其中的部分序列，通过常规抗体制备流程，制备出与该蛋白质对应的抗体，并实现对该预警分子蛋白质的定量检测，也可以通过其他检测技术手段实现对这些与该黄曲霉毒素预警分子蛋白质有一一对应关系的定量检测，从而达到上述用途，部分序列是指与该黄曲霉毒素预警分子蛋白质有一一对应关系的全序列中的一部分。
按上述方案，所述的黄曲霉产毒菌优选为产毒力经鉴定不小于10μg/kg的黄曲霉产毒菌。可采用经NY/T 2311—2013标准方法进行产毒力测试。
上述黄曲霉预警分子参考物质黄曲霉预警分子参考物质的制备方法，包括：将黄曲霉产毒菌接种到察氏培养基中培养，收集长成的菌丝，用液氮研磨菌丝至粉末状，再将菌丝粉末置于水或常规缓冲液中，随后用高压均质仪裂解菌丝粉末，获得黄曲霉产毒菌裂解液，裂解液经过脱盐处理，并通过检测标定其中预警分子AFT-YJFZP008的含量，得到黄曲霉预警分子参考物质得到。
按上述方案，上述方法还包括将脱盐后裂解液，再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质，通过检测标定黄曲霉产毒菌裂解液干物质中预警分子AFT-YJFZP008的含量。
黄曲霉预警分子参考物质的应用：
提供一种测定样品中黄曲霉预警分子参考物质含量的方法，以黄曲霉预警分子参考物质建立标准曲线，测定样品中黄曲霉预警分子参考物质含量，进一步地，结合黄曲霉预警分子参考物质中AFT-YJFZP008的黄曲霉毒素预警分子标定含量，用于黄曲霉产毒菌产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量的检测。
按上述方案，上述应用包括：标定黄曲霉预警分子参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量；建立标准曲线，测定样品中黄曲霉预警分子参考物质含量。
按上述方案，上述标定黄曲霉预警分子参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量为通过黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008检测方法标定上述黄曲霉产毒菌裂解液或者上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZP008含量，具体的过程为：
a制备黄曲霉预警分子参考物质溶液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度；
用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZP008纯品溶液，替换待测液，用于制作标准曲线，得到黄曲霉预警分子参考物质中AFT-YJFZP008的浓度，标定黄曲霉预警分子参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量。
按上述方案，所述的应用方法为：间接非竞争双抗体夹心ELISA法，荧光免疫层析法或其他可以达到检测目的的方法。
所述非竞争双抗体夹心ELISA法为：
a制备待测样品待测液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度；
以系列浓度的黄曲霉预警分子参考物质替换待测液，用于制作标准曲线，用于计算得到待测样品中黄曲霉预警分子参考物质的含量。计算得到待测样品中黄曲霉预警分子参考物质的含量，可结合黄曲霉预警分子参考物质中AFT-YJFZP008的黄曲霉毒素预警分子标定含量，得到样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量，预测预警黄曲霉毒素污染风险水平。
所述的荧光免疫层析法为：
提供黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡，包括黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体、信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线上包被有羊抗兔抗体，所述的检测线上包被有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或者黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载，所述的黄曲霉毒素预警分子是指AFT-YJFZP008肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
用常规察氏培养基培养并制备待鉴别菌株或待鉴别样品的待测液，然后即可用上述黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量，具体方法为：样品垫上装载有信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体时，将待鉴菌株或待鉴别样品的待测液加到黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡的样品垫上，反应一段时间，读取分析结果；
样品垫上没有装载信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，将待鉴菌株或待鉴别样品的待测液加到信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体中，然后将黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡插入待鉴菌株或待鉴别样品的待测液中，反应一段时间，读取分析结果。
按上述方案，所述的信号材料是指常规的铕乳胶微球、金纳米颗粒以及其他可达到类似效果的标记材料，均可通过商业购买获得。
按上述方案，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，是指信号材料通过常规标记方法与黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体发生偶联以后的产物。
所述的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体为免疫试纸条常规材料，均可通过商业购买获得。
上述待鉴别样品液的制备：待鉴别样品培养，获得待鉴别样品的待测液；具体可为：称量待鉴别样品，转移至无菌水中，室温震荡至均匀，制成待测样品稀释液，取10-1000μL样品稀释液加在含6-600mL常规沙氏液体培养基中，置于15-35℃下200±50rpm震荡培养，培养6-24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
所述的产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的黄曲霉产毒菌可以为公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17以及3.4408黄曲霉菌标准菌株，也可采用其他产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的黄曲霉产毒菌株，均可达到类似功效。
按上述方案，所述的样品可以为农田土壤、农产品、饲料等。将样品粉碎后转移至水或样品稀释液中，常规方法匀浆后静置，取上清即可制成待测样品待测液。
所述的样品稀释液可为含有0.1％山梨醇和绵糖的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，配制方法为：山梨醇与糖各0.5g、NaCl 4.0g、Na2HPO4·12H2O 1.45g、KCL 0.1g、KH2PO4 0.1g，加入去离子水定容至500mL。
本发明还提供一种基于样品中黄曲霉预警分子参考物质含量，预警黄曲霉毒素污染风险水平的应用，应用方法为：测定样品中黄曲霉预警分子参考物质含量，根据黄曲霉预警分子参考物质含量预警黄曲霉毒素污染风险水平，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质在0.667mg/g以下时属于低风险区域，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质在6.67mg/g以上时属于高风险区域。测定实际样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008或黄曲霉预警分子参考物质黄曲霉预警分子参考物质的含量，其浓度越高，则说明黄曲霉毒素污染风险越高。
本发明有益效果在于：
1.可用于建立检测黄曲霉毒素预警分子以及检测含有黄曲霉毒素预警分子的产毒黄曲霉菌的标准曲线。
2.可用于鉴别比较农田土壤、农产品及饲料等产品的黄曲霉毒素污染风险水平。
3.稳定性好，货架期长，易操作，实用性强，容易推广应用；
4.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
具体实施方式
实施例1 黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的制备
按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)NaNO3，0.1％(w/v)K2HPO4，0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，0.05％(w/v)KCl，0.001％(w/v)FeSO4，pH6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-122-2、JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008。试验结果表明，上述产毒菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZP008，在同样培养条件下，HBHA-8-17制备得到AFT-YJFZP008的量最多，而HLJ-1制备得到AFT-YJFZP008的量最少。
所述的免疫亲和方法，是利用黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，通过常规方法制备成免疫亲和柱，再利用免疫亲和方法从黄曲霉毒素产毒真菌细胞破碎液中富集纯化，去离子水溶解获得。上述免疫亲和柱是指利用黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008抗体通过常规的亲和柱制备方案制备获得。具体可用上样液稀释黄曲霉毒素产毒菌细胞破碎液，经常规滤纸过滤后，再连续加到上述免疫亲和柱中，待基本流尽时，再免疫亲和柱常规淋洗液洗涤柱体，最后用pH 2.2的甘氨酸缓冲液或者70％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液后通过常规超滤离心方法及时去除溶液，再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质，即可获得黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008水溶液。
黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZP008的初始获得用发掘方法：
用于发掘黄曲霉菌株产毒力预警分子的方法如下：
(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力预警分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力预警分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力预警分子。
上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
上述黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008抗体获知黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008全部序列后，利用其全部肽段或部分肽段通过常规的抗体制备技术流程制备获得。
实施例2 黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008纳米抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5 E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，按照专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用AFT-YJFZP008和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为AFT-YJFZP008的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经ELISA方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
实施例3 黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008单克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得AFT-YJFZP008单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点AFT-YJFZP008单克隆抗体。
实施例4 黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体。
实施例5 黄曲霉预警分子参考物质黄曲霉预警分子参考物质的标定
将上述黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008纳米抗体或单克隆抗体溶解在常规的ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再以200μL/孔加入至96孔酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以浓度不低于1％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加300μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质适当稀释，再每孔加入200μL，或者每孔加入200μL系列浓度AFT-YJFZP008溶液(浓度为0.000003、0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0、30ng/mL，用于获得标准曲线)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将上述AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体适当稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，以pH接近中性的常规磷酸盐缓冲液将商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体按说明稀释，再每孔加入200μL，放置室温或37℃封闭不少于1h后，弃去液体，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后，先后加入ELISA常规的显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并基于标准曲线计算黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量结果。
实施例6 黄曲霉预警分子参考物质的制备
制备方法流程包括：将产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的黄曲霉产毒菌接种到察氏培养基中培养，收集长成的菌丝，用液氮研磨菌丝至粉末状，再将菌丝粉末置于水或常规缓冲液中，随后用高压均质仪裂解菌丝粉末，获得黄曲霉产毒菌裂解液，裂解液经过脱盐，然后再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质。最后通过黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008检测方法标定上述黄曲霉产毒菌裂解液或者上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZP008含量，即可获得含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质溶液或者固体的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质。
所述的产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的黄曲霉产毒菌可以为公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17以及3.4408黄曲霉菌标准菌株，也可采用其他产黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的黄曲霉产毒菌株，均可达到类似功效。
如下以3.4408黄曲霉菌标准菌株为例，阐述含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质的制备过程，具体如下：
(1)将黄曲霉菌标准菌株接种于PDA固体培养基上进行活化，28℃温箱内恒温黑暗培养7天后取出，用灭菌的0.1％的吐温水冲洗孢子得到孢子悬浮液，将孢子液加至察氏培养基培养基中，使其终浓度为5×105cfu/mL，继续放置在摇床中培养5d后，用灭菌滤纸过滤收集菌丝；
(2)用液氮充分研磨上述收集的菌丝至粉末状，将菌丝粉末溶解于常规磷酸盐缓冲液中，随后用高压均质仪充分裂解黄曲霉菌菌丝，裂解过程中要保持低温状态，即可获得黄曲霉产毒菌裂解液；
(3)上述裂解液经过常规的脱盐处理，然后再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质；
(4)最后通过实施例5建立的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008检测方法标定上述黄曲霉产毒菌裂解液和上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZP008含量，结果为：上述黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZP008含量为0.15ng/μg，由此获得了含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质溶液或者固体的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质。
所述的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008检测方法，可以为实施例5的ELISA法，也可以为荧光免疫层析法及其他可以定量测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的方法，均可以达到类似功效。
实施例7 黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡制备
黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡由黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体、信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体通过常规的免疫试纸条搭建方式组装而成，即底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线上包被有羊抗兔抗体，所述的检测线上包被有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或者黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载，其中不同之处在于核心试剂的装载：
(1)所述的硝酸纤维素膜的检测线上固定有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，固定方法为：采用常规点膜仪喷涂，喷涂黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体的浓度为1mg/mL，喷涂速度为0.6μL/cm；质控线上固定有羊抗兔抗体，固定方法为：采用常规点膜仪喷涂，喷涂羊抗兔抗体浓度为0.5mg/mL，喷涂速度为0.6mL/cm。
(2)所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载在常规的小孔、小瓶等器皿中，通过常规冷冻干燥处理后即可。
如下以常规铕乳胶微球为例，说明所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体制备方法：取100μL铕乳胶微球，于900μL pH 6.0的MES溶液涡旋混匀，置于超声波细胞破碎仪中，功率20％，超声9s，11000rpm离心10min，小心弃上清，沉淀中加入1mL硼酸缓冲溶液(pH 8.2)重悬，涡旋混匀后再重复超声9s，加入20μL现配15mg/mL的碳二亚胺水溶液活化，室温剧烈震荡15min，11000rpm离心10min，小心弃去上清液，沉淀中加入1mL硼酸缓冲溶液重悬，涡旋混匀后再超声9s，加入60μg黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，10℃摇床震荡2h，11000rpm离心10min，沉淀物用1mL 0.1％牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲液复溶，重复超声步骤，4℃下摇床震荡1h，使牛血清白蛋白封闭微球表面未结合的位点；反应完成后即可获得所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，置于4℃保存备用。使用时，采用含有1％蔗糖、0.5％卵清蛋白、2.5％吐温-20、0.5％PVPK30的常规磷酸盐缓冲液将上述制备获得的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体稀释1000倍再使用。
(3)与上述(2)方案相互呼应的是：所述的硝酸纤维素膜质控线上固定有羊抗兔抗体。
实施例7 利用黄曲霉预警分子参考物质建立黄曲霉毒素风险预警标准曲线
以上述铕乳胶微球最终制备成的黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡为例，阐述利用含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质建立黄曲霉毒素风险预警标准曲线过程。
采用实施例6制备的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质，用常规磷酸盐缓冲液配置成0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3.0mg/mL等系列浓度的溶液，然后依次用其溶解黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，再通过常规的免疫层析反应15min，最后通过读取黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡上荧光信号，以荧光信号作纵坐标，以黄曲霉预警分子参考物质作横坐标绘制标准曲线，结果表明，黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡快速定量测定黄曲霉预警分子参考物质的含量，其检测限可达1μg/mL，相关系数达0.99。再采用常规方法评价黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡快速测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的重复性和准确度，重复性评价结果显示：测定结果的变异系数均在10％以下，表明方法测定结果重复性良好；准确度评价结果表明，向花生、玉米、大米等产品中添加实施例1制备的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008，回收率范围为87％-103％，表明方法测定结果准确度良好。因此，快速定量测定AFT-YJFZP008的黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡方法具有良好的检测灵敏度和准确度。
方法特异性评价：为评价黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的上述免疫检测方法的特异性，研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉菌、串珠镰刀菌等，通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测，测定结果表明，上述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应，表明建立的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008免疫快速检测方法具有良好的特异性。
实施例8 含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008纯品的稳定性比较
将实施例1制备的黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008纯品和实施例6制备的含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质，在相同条件下存放，比较二者的稳定性即货架期。采用实施例5和实施例7共两种方法测定，研究结果均表明：含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008纯品相比，稳定性更高，货架期更长，4℃保存可延长3个月以上。
实施例9 含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质在预测预警黄曲霉毒素污染风险水平方面的应用
随机选择土壤、花生、玉米、稻米、小麦、核桃、开心果等样品共299份，采用实施例5的方法测定上述样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的浓度，并采用《GB 5009.22-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中的高效液相色谱-质谱联用方法测定黄曲霉毒素水平。测定结果表明：当测定的AFT-YJFZP008浓度小于0.1μg/g时，90％样品的黄曲霉毒素污染水平在1.0μg/kg以下，为低风险；当测定的AFT-YJFZP008浓度大于1.0μg/g时，75％样品的黄曲霉毒素污染水平在10μg/kg以上，为高风险；其余测定AFT-YJFZP008浓度在0.1μg/g～1.0μg/g则为中风险。
利用上述低风险时黄曲霉毒素预警分子阈值——0.1μg/g，高风险时黄曲霉毒素预警分子阈值——1.0μg/g，以及上述实施例6中标定结果为0.15ng/μg的含有黄曲霉毒素预警分子的参考物质，则可获知：当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质在0.667mg/g以下时属于低风险区域，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质在6.67mg/g以上时属于高风险区域，由此建立基于含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质的黄曲霉毒素污染风险预测预警方法。
利用实施例7基于含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质建立的黄曲霉毒素风险预警标准曲线，采用该方法测定花生根际土壤样品6个、花生样品6个、大米样品6个、核桃样品3个、开心果样品3个、小麦样品3个、饲料样品6个，通过测定获知有1个土壤样品、2个花生样品、1个开心果样品、3个饲料样品的结果都在6.67mg/g以上，其余样品测定结果均在0.667mg/g以下，根据上述基于含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质的黄曲霉毒素污染。风险预测预警方法判断：6.67mg/g以上的1个土壤样品、2个花生样品、1个开心果样品、3个饲料样品的黄曲霉毒素污染风险水平较高，应予以预警重视，并及时采取有效的防控措施来降低污染危害；而其余样品的黄曲霉毒素污染风险水平属于低风险，在指导生产生上可以放心利用，在没有遭遇恶劣天气影响下无需采取任何额外的防控措施。
综合以上实施例证明，本发明技术方案具有如下优势：
1.可用于建立检测黄曲霉毒素预警分子以及检测含有黄曲霉毒素预警分子的产毒黄曲霉菌的标准曲线。
2.可用于鉴别比较农田土壤、农产品及饲料等产品的黄曲霉毒素污染风险水平。
3.稳定性好，货架期长，易操作，实用性强，容易推广应用；
4.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 黄曲霉预警分子参考物质、制备方法及其应用
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 18499
＜212＞ PRT
＜213＞ 黄曲霉
＜400＞ 1
ALAALASERL EPRALASERP HESERGLYPH ELYSALAPHE ASPSERSERP HEPRLEPRLY 60
SALAPHEPRA SNALAPRASP LYSALAGLYV ALILEPRGLS ERLEHISGLN ASPTHRVALG 120
LYTHRPHEGL YLYSALAILE HISASPGLVA LSERPRVALG LYASPTHRAS PALALELEGL 180
ARGALAILEA SNASPTYRIL EASPSERGLN LEASPLYSAL ALELEPHEGL YALAALAGLY 240
SERALAGLAS PPRVALVALV ALLYSALALE THRASNGLYA LAGLYALAIL ELYSALALEV 300
ALSERHISAS PGLYTHRPHE VALALAASPA LALYSALAAS NASNTYRCYS SERASNGLNV 360
ALGLGLYPRT YRSERLETYR SERGLYARGA LAPRVALVAL GLNTYRALAL EASNARGALA 420
SERMETVALT RPGLGLALAG LNGLNVALSE RGLYLYSALA SERPRSERTY RLETHRALAT 480
HRPRARGALA VALGLGLNSE RLEASPALAI LEARGALAVA LGLYGLNALA THRGLARGAL 540
AVALILETHR ASPILEVALA SNGLNGLNAR GALAVALSER PRSERPHEGL ASPVALTRPS 600
ERGLNPRARG ALATYRGLNG LYTYRPHEHI SSERASNASP ASPLELEASN ARGCYSASPV 660
ALALATHRTH RASPVALTYR TYRSERGLYL YSCYSVALTH RALAPRSERG LYPRCYSGLY 720
GLNLYSCYST YRALALEVAL ASNHISGLPH ESERARGASP ALAASPALAC YSASNGLYGL 780
YGLYILEGLT YRASPSERPR ALAASPTHRP RLEGLPHELY SASPALAGLY SERPRLYSPR 840
VALVALGLNI LEGLYHISGL GLYASPVALG LYVALALAGL ILEGLNASNM ETARGASPAL 900
AGLYTYRGLT HRSERILETH RASPTYRTRP GLYARGASPA LAVALTYRAL ALEASPALAI 960
LETYRGLYIL EASPALAARG ASPGLARGAL ASERLEASPV ALGLPRSERL EPRTRPPRAS 1020
NASPGLYILE PHEARGTRPA RGASPPHEPH EASNHISVAL THRILELYSA SPPHEGLYTR 1080
PASPSERALA PHEASPGLNL YSGLYASNSE RLEGLYLECY SLEPRTHRAS PPHELYSASP 1140
PHEPRCYSAS PVALGLNARG PRPRASPLEA LAALAASNAS PALALYSASP PHETHRASPI 1200
LETHRALAGL YSERSERILE GLYCYSASPG LYVALASNPR GLNTHRGLYL YSASPGLYAL 1260
AGLYGLNMET PHEILEPRLE ASNPRASNAL ATYRSERPRA SNTHRLEASN LYSASPGLYA 1320
SPLEVALTHR GLNGLNASNG LLEGLNGLYL YSASPLEASP GLNASPILEG LLYSLYSASP 1380
LEASNASPGL YGLYSERSER VALGLYVALG LNASNARGLY SASPLEASNP RASNGLYSER 1440
GLNPHEILET HRPRGLYGLY LYSASPLEPR TRPTYRGLNC YSASNGLNGL ILEHISTHRL 1500
EVALSERGLY LELEARGARG ASPASNILEL EPRGLASNLE ASPASPGLYL EPRSERGLNP 1560
HEVALTYRGL LYSASPASNT HRCYSASNAL APRILEPRVA LSERPHEPRV ALALAPRTHR 1620
ASPTHRLYSA SPPRPHELYS ALAILEILET HRLESERALA ARGLEASPTH RPHEALATHR 1680
ILEASNTHRL EPHELYSASP PRPRILEASN METGLYPRIL EPRALATHRT HRASPLETHR 1740
ASNMETASPA RGARGASPPR TYRMETPHEH ISGLNALAAS NLEARGASPG LNCYSASNTY 1800
RSERLEGLNT YRTHRILEGL YASNLYSASP GLNGLLYSAR GGLNARGASP GLNILEILEG 1860
LCYSARGASP THRLEVALIL EPRPRGLYSE RARGASPTHR SERLECYSPR METALAPRPR 1920
ASNSERPHEM ETSERTHRLE PRMETTHRAL AASPPHEARG ASPTHRTHRG LYPHEILEGL 1980
THRASPPRLE LYSASPVALH ISGLYPHEAL ATHRARGASP VALVALGLAL APHEARGASP 2040
TYRALACYSP RTRPASNGLY GLYGLGLVAL SERLELYSGL ALAALASERA LAALALEALA 2100
ALAGLYTYRL YSGLALAGLY LEVALPRPHE GLNVALSERP RTHRTHRLYS GLGLTYRASP 2160
GLGLYLEARG METVALASNL YSGLYLEALA LYSGLGLYAS NGLSERVALG LNVALPRARG 2220
ASNHISALAL ESERSERASP ARGGLHISHI SGLLEALAIL EALASERLYS GLILEASNGL 2280
NILEGLNARG GLILESERPH EASNGLNALA TRPLEARGGL LESERALATH RVALMETASP 2340
HISLELESER GLNARGGLLE VALLEVALLE GLYARGGLPR GLYALAGLGL YVALCYSGLT 2400
HRTHRPRGLY VALLYSGLPR GLYILECYSG LTHRTHRPRG LYVALLYSGL ARGGLLEASP 2460
SERARGGLSE RGLPHEPHEI LEARGPHEAL ALESERTHRT RPALAARGPH EALAASNGLN 2520
METPRASNGL YCYSGLNASP LEILESERTH RCYSLYSPHE ALASERASPA SPALACYSGL 2580
GLLYSPHEGL GLILEALAPR TYRVALASNG LYLYSARGPH EGLGLYTYRL EPRASPALAA 2640
RGPHEGLASN SERASNVALL YSPHEGLASN SERASNVALL YSSERSERVA LVALARGPHE 2700
GLYLYSPRVA LGLYALAVAL GLYSERALAA LATHRALALE LYSPHEGLYT RPTRPSERAL 2760
AASPGLYALA TRPPRGLYAL ALEASPASPP HEVALVALTR PVALGLNLYS LYSPHEHISA 2820
SPSERSERAS NASPSERGLY ASNARGPHEH ISVALLETHR ALAGLNLESE RPHEPRARGP 2880
HELEASPGLA LALETHRTYR PRPRPRLYSP HEASNSERLE ALAASPARGP HEGLNTYRPR 2940
GLYASPLEPH EASPGLNGLY THRTHRILEA RGPHESERSE RCYSSERGLY THRARGPHES 3000
ERTHRVALAL AGLYSERARG PHESERVALA LAGLILELEP RGLYALALYS PHEVALGLYG 3060
LYALASERTH RASPALAPHE ALAASPPRLY SPHEVALTHR ASPASNGLYA SPSERLYSGL 3120
YALAASPARG GLYARGGLYA SPALAGLYSE RPRVALPHES ERPRASPSER LYSGLYPHEP 3180
HETHRALAPR GLYARGGLYG LYGLYGLYGL YTHRPHEGLY VALVALMETG LSERTHRHIS 3240
ARGGLYGLYS ERGLYALALE GLYLEALAPH ESERGLALAL YSGLYILEAS PVALALALYS 3300
PRTHRGLYAR GGLYILEGLN ILEASNASPP RSERILEASN ASPASPSERV ALMETILETY 3360
RALAPRALAV ALARGGLYLE ARGASNSERG LYVALHISGL YTHRPHESER SERARGPRGL 3420
GLNGLGLILE GLNLYSGLYL ETYRALAGLY HISARGGLYP RLEASNGLGL YGLYLETYRA 3480
LAGLARGGLY GLNTHRPRLE PRILELEVAL ALAASPGLYA RGGLYSERAS PCYSSERTHR 3540
THRALAGLYG LYCYSCYSGL YGLYTHRGLY CYSGLNPRAS NGLTHRLEVA LPHEGLYSER 3600
SERASPLEAL AARGGLYVAL ASPPHETHRG LASPPRLELE GLNGLYARGG LYVALGLYSE 3660
RASPALATRP THRVALSERG LSERGLYARG GLYVALLEAR GPRVALSERT HRGLYSERAR 3720
GGLYVALTYR ASPILEARGG LYTYRLYSPR SERALASERS ERGLYSERLY SGLYTYRPRT 3780
HRSERGLNGL NASNTRPVAL GLYTHRLELE LEPRARGHIS ALAGLYGLNC YSGLYGLTYR 3840
HISGLASNLY SHISPHEGLN LEILEASNTH RALAALATYR TRPLYSHISP HETHRSERLE 3900
GLGLLYSHIS PHEVALASPT HRPHEGLYLE HISGLYHISL YSHISGLYGL YPRASNPHEG 3960
LGLNLEPRIL EASNGLNPRA RGHISLEPHE GLYLEHISAR GHISTHRASP TYRSERSERG 4020
LNGLSERTHR SERTYRLYSH ISVALASPGL YPHEGLYILE HISTHRPHEA RGHISVALTY 4080
RASPALAVAL GLNASPLYSI LEALAPHEAL ASERTYRLEG LGLTYRALAA RGILEALAPR 4140
GLNPHEGLYA SPLELYSILE ALASERLEAS NASPSERTYR GLTHRLELYS LYSARGILEP 4200
HEARGLELEG LYTHRPRASP GLASPSERTR PPRGLYVALT HRSERPHEPR ASPTYRLYSI 4260
LELEPHEASP SERASNASNV ALALATHRGL YVALGLNVAL SERTHRGLYG LYTHRPHEGL 4320
YTHRARGILE ASNPRHISGL LESERILEAR GASPPRASPP HETYRASNGL ILETYRVALT 4380
HRGLSERLYS ARGILEGLNA LAPHEVALIL ETYRPRGLAS NPHEASPLYS ILESERALAT 4440
YRVALGLGLY SERSERARGI LESERHISHI SALAGLNTHR LELEGLGLYL EGLYTHRHIS 4500
ARGTYRLEGL SERCYSTHRG LARGILESER TYRLYSGLPR GLYILECYSG LTHRTHRPRG 4560
LYVALLYSIL EVALPRGLGL TYRVALPRIL ETHRLYSILE VALGLNVALG LYASPLEARG 4620
ILEVALTHRP RASPGLYLYS ILETYRASPS ERILETYRVA LARGLYSALA LYSGLSERSE 4680
RSERGLSERS ERASPSERSE RGLSERGLSE RGLSERGLSE RGLASPGLLY SLYSPHETHR 4740
ASPTHRPRVA LLETYRGLYP RLYSLYSMET GLASPASPLE ARGLYSPRLE GLYTHRGLYT 4800
HRASPLETRP PRLYSLYSTH RLELEPHETY RALASERSER HISGLALAIL ESERPHEASP 4860
SERCYSARGL YSTHRSERSE RSERTHRALA THRSERTHRS ERTHRSERTH RGLYALAALA 4920
ALALEPRTHR ALAALAPHEG LYALAVALGL GLYGLYLEME TLEGLYVALV ALLEGLYVAL 4980
LEGLYLELEA SPARGPRPRV ALILEPRLEP RPRSERASPS ERASPVALTH RALAPHEARG 5040
LEGLGLLEAS NGLNARGLEG LGLNTYRARG METGLNLESE RGLYLELESE RGLNASNGLY 5100
GLNGLYSERL YSLEPHESER ILEPRALAAS PALAGLYASP ASPTYRLYSP RLYSLEPHES 5160
ERTYRLEASP THRGLNLEAS NARGLEPHET YRASNSERLE THRPRALAGL GLNGLNPHEV 5220
ALVALASPAL AILEARGLEL YSASPLEVAL LESERLELEA SNLESERSER PHEASPALAS 5280
ERGLYTYRIL EASPARGLEA SNTHRGLYAL AVALILEPRV ALLEVALARG LEPRASPILE 5340
CYSASNTHRC YSPHELYSLE SERGLNLEGL SERGLYLYSL ESERSERILE ALALEPRARG 5400
LETHRASPLE GLILEASNAR GLETHRGLYA SNLEGLYGLY GLASPTYRGL NASPLYSMET 5460
PRMETPRILE LEVALALAAS PGLYARGASN ALAGLYILEG LNTHRSERAR GASNALAHIS 5520
GLYGLNGLIL ELELEARGAS NALALEGLNT HRMETTYRAS PTHRGLNASP LYSASNASPP 5580
RVALALAVAL PHEASPGLYS ERVALILEPR LYSASNPHEA SPASNASPGL NHISARGASN 5640
PHEGLNGLLE PHEGLYILEL YSASNGLYAS PGLNSERPRP RSERALALEG LYPRLEPRSE 5700
RVALILEGLA RGASNHISAS NVALLESERA LAILEPRGLN GLPRTYRARG ASNHISTHRA 5760
LAGLYILEGL ALAARGASNL EGLTHRGLAR GGLNLEARGA SNLEGLVALL ESERLETHRL 5820
YSASNLEVAL GLYTHRSERG LYPHETHRSE RALAARGASN ASNVALILEI LEGLNLEASN 5880
ARGASNPRAS PLESERSERT HRSERASPTH RTHRASPVAL ILEARGASNS ERILELEGLG 5940
LYPRASPVAL LYSASNSERV ALVALGLYIL ELYSPRTHRV ALGLYLETHR SERARGASNV 6000
ALGLYLEVAL SERVALSERL EASPGLYLYS ASNVALLEAS PTYRGLYALA ARGASNVALV 6060
ALLEASPTHR THRALALESE RALAASNTHR LYSASNTRPH ISARGLESER PHETHRTYRA 6120
SNCYSTHRPR SERALAASNT YRGLNTYRIL EPRALATYRL YSASNTYRPH EALAGLTHRG 6180
LGLNVALMET PHEGLNPRGL YHISILEVAL ARGASNTYRI LEVALVALAS PALAASPSER 6240
SERPRLEGLN ILEVALILEA SPGLYPHEAR GPRPRMETGL ASPILEVALS ERPRTHRLEG 6300
LASPLEILEH ISLEALALEA RGARGPRPRG LNPRASPGLY ALATHRCYSI LELYSGLYAS 6360
NGLCYSGLAL APHECYSVAL ASPGLYVALC YSLYSPRGLN GLYASPPRLY SPRGLNSERI 6420
LEASPTHRIL EVALGLYTHR ASNLEHISME TASPILELES ERASPLEALA ALAALALEAL 6480
AGLYSERILE GLYVALALAP RSERSERASN LEASPPRTHR ARGLYSPRVA LALAASPALA 6540
ALAVALVALA SNALACYSGL SERPHEPRLE SERPHEASPT HRASPVALSE RARGARGPRT 6600
RPVALGLYGL YGLNILEVAL ASNSERILEP RALASERVAL GLLYSILEAL AVALLEGLGL 6660
NVALARGGLN ASPGLYHISP HESERVALPR SERTYRALAG LYHISVALAL ATHRMETTHR 6720
SERVALSERL EARGARGGLN ASPLEPHEGL ALAILEGLAL AGLYARGGLN ILEGLNTHRS 6780
ERARGGLNLE PRPRSERLEP RTYRTHRPHE TYRTHRSERT YRTHRSERGL ASPSERTYRL 6840
YSLYSGLNLE SERGLASPGL YVALASPVAL VALVALVALA LAGLARGARG ASPGLGLHIS 6900
GLNLEASPAS PASPPHEGLG LYILEASPAS PGLMETASPG LSERGLNSER ARGARGPRAS 6960
PLESERTHRP HEPHEALATH RLESERGLIL ESERPRASPG LALAARGARG PRPHEILEIL 7020
EALAARGARG PRGLYASPAR GSERHISSER ARGSERALAA LAALALESER THRSERGLLY 7080
SSERALAALA ALALESERTH RSERGLLYSA SPTRPLEGLN VALARGSERA LAALAASPGL 7140
YLEALASERA LAILETHRSE RLYSSERALA GLYTYRTHRP RLELYSSERA LAMETTHRLE 7200
PRARGSERAL ATHRVALMET THRTYRTRPL YSTHRGLGLG LYALAPRLEP RGLYCYSPRA 7260
RGTHRTHRLE GLNARGSERA SPASPALAIL ETHRARGTHR ASNPRASPAL ALELYSALAS 7320
ERALAVALPR GLYALASERA LALYSSERGL YASNTYRSER TYRGLYVALA RGSERGLYSE 7380
RSERPHESER SERILEGLYS ERALAILESE RMETSERLYS SERGLYSERV ALALALEGLY 7440
LYSSERHISL ESERVALVAL ASPGLYGLYG LASPGLYGLN ASNILEPRLE HISPRLEILE 7500
GLNPRGLARG SERILEALAV ALLYSALAPR SERPRTHRGL PRGLYSERPR ALASERPRGL 7560
YGLYSERGLN PRARGSERIL EILESERARG METLEVALTH RASPPRLYSS ERLEGLYASP 7620
VALCYSMETA SPLEGLNTHR ILETHRTHRS ERSERASPPR ASPPRLYSAR GSERASNILE 7680
THRGLILELE PRALAGLYTH RPRLEPRGLY THRALAALAT HRALAARGGL NASNPRASNP 7740
RALAALAALA ALASERTHRG LYGLYGLNAS PGLYGLYPRA SNASPALAVA LPRARGSERP 7800
RALAALAVAL GLNGLYILET YRGLYASNAR GSERSERGLL YSPRSERILE THRILEASPG 7860
LYASNASNIL EASNLYSSER SERGLYALAV ALTHRGLYGL NSERTHRARG SERSERGLYT 7920
HRGLYTHRSE RTHRGLYALA ALAALATHRG LYTHRGLTHR ASNALAALAS ERVALALALY 7980
SLEGLNMETG LYVALSERAL AALAGLYILE ALAGLYLEAL ALEGLYILET RPALALESER 8040
SERHISPRIL EGLVALPRVA LLYSSERTHR ASPTHRSERI LEASNVALAR GSERVALTHR 8100
SERGLYPHEV ALASPGLYIL ELYSSERVAL THRSERGLYP HEVALASPGL YILELYSASP 8160
GLYLEARGTH RALALEALAA SPTYRALALE CYSALAGLAL ATHRASNMET CYSARGTHRA 8220
LASERASNPH EASPGLNPRH ISSERASPGL SERALALEGL NHISLEARGT HRALAVALPR 8280
ILEASNGLYP RASPSERPRG LYTHRPRGLG LYVALLYSTH RASPTYRSER VALCYSGLYG 8340
LTHRTHRILE PHELYSTHRG LYTYRVALAS NTYRASNVAL ASPTHRTHRA SNLEARGTHR 8400
ILEPHEGLYT RPASPILEAL AGLGLYGLNL YSTHRILESE RASNVALVAL ASPASNGLLE 8460
ALAARGTHRI LEVALSERPR ASPGLYPHEA SNTRPASPTY RGLYSERTHR ARGTHRLEGL 8520
YILEASPILE ALAARGTHRL ESERTHRASN GLGLGLYTYR GLTHRSERAL AVALARGTHR 8580
METLEVALGL YMETASPVAL THRHISPRSE RPRGLYSERS ERALAASNAL APRSERVALA 8640
LAGLYMETVA LALASERVAL ASPSERTHRL ESERGLNTRP PRALAGLILE ARGVALGLNA 8700
RGTHRASNTH RGLNVALPRA SPALACYSTH RGLNCYSPHE GLNLYSTHRG LNGLYPRHIS 8760
SERTHRPHEA SPARGTHRSE RGLYSERGLY SERSERSERP RGLPRARGTH RTHRASPVAL 8820
GLYTHRPHEG LYGLNLYSTH RTHRGLYALA PHEASPGLSE RGLYPRPRLE SERGLNLYST 8880
HRTHRASNGL YILEVALSER THRASNGLSE RGLYARGTHR THRSERGLNT RPASNVALLE 8940
ASPLELYSTH RTHRTHRLEA SPGLNGLYHI STYRGLNSER ARGTHRTHRT YRASNVALVA 9000
LALAGLNTHR LYSTHRVALA SNVALASNAS NLELYSVALA LALEVALTYR GLYASPARGV 9060
ALALATHRIL EGLYSERALA THRPHEALAA RGVALCYSAS NLEILEGLYL EMETGLYLEA 9120
RGVALASPPH ETYRASNASN LELYSVALGL LEGLNSERLY SVALGLARGT HRGLYTYRAL 9180
AALAPHEARG VALGLSERAL ASERALAASP LEILESERTH RILETHRLYS VALPHEASPA 9240
LAGLYHISTH RVALPRALAP HEGLNPRGLT HRMETPHEAR GVALPHEGLA LAGLYHISGL 9300
VALPRALATY RGLNPRGLTH RALATYRGLI LEPHEHISAR GVALGLYGLG LGLTHRPRAL 9360
ALEVALHISA SPLEASNTHR ALAMETARGV ALGLYPHELE ALASERVALG LTHRPRALAS 9420
ERILEGLALA ALASERGLLE SERLYSVALG LYGLYTHRLE ALATYRVALS ERVALGLILE 9480
GLLYSVALLY SVALGLYTHR ILEILETHRG LYASPPRLEA SPPRPRVALL ELYSVALILE 9540
PRLEGLNGLY CYSASPALAA SPGLTYRGLY ARGVALLELE HISPRLELET HRALAALAAL 9600
ALELEGLYAL ASERALAARG ALAGLNSERV ALVALGLYTH RPRPHEGLYP HEALASERGL 9660
YTHRTHRGLY GLYGLYASNA LAALAPRALA ALAPRLYSVA LASNGLYVAL GLTYRGLYGL 9720
THRARGVALG LNLEASPGLG LYLELYSARG VALSERILET RPTHRGLSER TYRGLYGLYA 9780
RGVALSERAS NASPLEALAA RGVALSERGL NILESERGLY ASNARGPRLE ASPALALEAS 9840
PGLNGLYTHR ARGVALSERT YRTHRGLTYR ASPSERTYRT YRASPHISTY RASNLYSVAL 9900
THRASNSERP RSERASNLEV ALTRPTYRSE RILESERTHR ARGVALVALA LAVALASPTH 9960
RALASERASN LYSVALVALA SNTYRTYRSE RASPASPPRT HRGLYMETSE RASPSERGLY 10020
GLASPALAPH EASPMETARG LYSVALTYRA LATHRPRASP GLNASPILEG LHISGLYARG 10080
TRPASNGLTH RILETYRVAL ILEILETHRS ERPHESERAS PTHRLETHRI LEGLNPRTYR 10140
ASPTRPASNG LPHEARGLYS TRPASNPHEI LEMETASNSE RARGTRPARG HISTYRTYRL 10200
EARGTYRALA GLYGLTYRGL PHEGLNALAA SPLEPHELYS TYRCYSALAS ERALAGLNGL 10260
ASPASNALAT HRLEGLNALA LELEARGTYR ASPLEASNLE GLASNLYSTY RGLYPRSERP 10320
HETHRALAPH EPHEGLNGLG LNASNGLLYS TYRLYSGLPR GLYALAGLGL YVALCYSGLT 10380
HRTHRPRGLY VALLYSTYRL EALASERTHR GLNMETGLPR THRASPALAA RGTYRLEASP 10440
GLNGLNILET HRALAGLTHR LYSTYRLEAS PTHRLEPRGL ILELYSTYRL ETHRASNSER 10500
GLNALALEAL AASPLEPRTY RPHEALAGLL YSTYRLEVAL ASPGLNLEAS NPRGLGLYLY 10560
STYRGLNGLY ALASERGLNC YSPRPHEARG TYRGLNPRHI STHRVALTHR THRVALSERA 10620
LAGLYALASE RASPPRARGG LYSERPRGLG LYGLYGLYAR GTYRVALASP ALAGLYGLYP 10680
HEGLPRSERI LELYSTYRVA LTHRSERASN ALAVALSERV ALGLYVALTH RHISPHEALA 10740
GLYSERARGA LAALAALALE ALAGLLEVAL TRPSERGLYA SNARGALAAL AALAPRLYSS 10800
ERALAALALE ASPALALEGL NGLNSERILE TYRLEGLNPR LYSALAALAT HRTYRCYSPR 10860
GLASNILEGL LYSALAGLAS PTYRLELEAS NPRSERPRLY SALAGLHISC YSPHEASPTY 10920
RASPLESERT YRLYSPRALA ASPLYSALAG LASNGLNALA VALALAVALG LYARGALAGL 10980
YALAVALALA ALAVALVALT YRASNASNGL LYSALAGLYL YSPRTHRLEG LYPHELEASN 11040
PRLELETYRS ERGLYALALE LYSALAGLYS ERSERPRTHR ASPILEILES ERGLYILESE 11100
RASPLYSALA ILEHISASPG LVALSERPRV ALGLYASPTH RASPALALEL EGLARGALAI 11160
LEMETGLYAL AGLGLALAAL ALYSALALES ERGLMETILE LEGLNSERGL LYSALALEVA 11220
LGLGLYSERT HRPHEALALY SALALETYRS ERSERALAAL ATHRGLYTHR TYRALASERS 11280
ERTHRTHRVA LTYRLYSALA ASNGLGLNPR THRTRPVALT YRARGALAAS NPHEGLVALG 11340
LTHRPRARGA LAASNASNTY RCYSSERASN GLNVALGLGL YPRTYRSERL ETYRSERGLY 11400
ARGALAPRVA LVALGLNTYR ALALEASNAR GALAGLNASN ASPPRASNAL APHEGLYVAL 11460
VALALAALAA RGALASERAL AILEGLNLEA SPGLYILEIL ETYRARGALA SERMETVALT 11520
RPGLGLALAG LNGLNVALSE RGLYLYSALA SERASNSERL EGLNTYRVAL ASNVALGLNV 11580
ALLYSALATH RGLYASPVAL LEPHEASNTH RLYSALAVAL GLYGLNALAT HRGLARGALA 11640
VALHISGLAS PLEASPVALA LAALAILEAS PALAALAGLV ALARGALAVA LLELELEASP 11700
GLALAASPVA LPHEMETGLG LARGALAVAL SERPRSERPH EGLASPVALT RPSERGLNPR 11760
ARGCYSGLNS ERVALPHEAS NPRASNILEP RLYSASPALA TYRSERPRHI SGLILETYRS 11820
ERARGASPPH ETHRASPILE THRALAGLYS ERSERILEGL YCYSASPGLY VALASNPRGL 11880
NTHRGLYLYS ASPGLYLEGL GLYSERPHEL YSASPLYSAS PPRGLLYSAS PPRLYSALAI 11940
LEGLLEPRAR GASPGLNILE ILEGLCYSAR GASPSERGLY LEVALMETLY SASPSERPRL 12000
ETYRPRTYRA RGASPVALHI SGLYPHEALA THRARGASPV ALLYSSERME TLYSASPVAL 12060
VALVALVALG LYGLYGLYAL ASERGLYALA TYRALAALAV ALARGASPTY RGLNVALGLM 12120
ETVALASNLY SGLALAGLYL EVALPRPHEG LNVALSERPR THRTHRLYSG LGLPRSERPH 12180
EGLNPRASPA SPVALTHRLE LELESERGLN ASPPRGLYHI STRPGLLYSG LGLYILESER 12240
ILEHISTHRC YSASPGLNAR GGLHISHISG LLEALAILEA LASERLYSGL ILEPRVALGL 12300
YTYRSERALA ALAASPILEA SPTHRASNAR GGLLEASPTH RGLNHISILE HISPRPRASP 12360
SERTYRPHEV ALSERPRLET HRARGGLPRG LYILECYSGL THRTHRPRGL YVALLYSGLP 12420
RSERASNASP PRASNPRPRG LTHRTYRSER LYSGLSERLE GLASPILEAR GLYSGLTYRL 12480
EVALALAASN GLYVALGLNA LAGLNALALE VALPRLYSPH EGLPRPRALA VALTYRASNA 12540
SPGLLELYSP HEGLYALATH RGLYASPGLT YRARGPHEGL YLYSPRVALG LYALAVALGL 12600
YSERALAALA THRALALELY SPHELEASPG LALALETHRT YRPRPRPRLY SPHEASNVAL 12660
ASPGLTHRAL APHETHRGLY ALATRPGLYA RGPHEARGGL NASPLEILES ERGLILELYS 12720
PRCYSCYSGL GLLYSPHETH RALAVALPHE THRPRSERIL EVALGLARGP HETHRASPTH 12780
RPRVALLETY RGLYPRLYSP HEVALTHRAS PASNGLYASP SERLYSPHEV ALTHRASNME 12840
TGLNALAALA LELELYSGLY PHEPRASPVA LALAALAHIS SERLETHRPR ARGGLYGLYS 12900
ERILELEPRM ETGLNGLVAL ALALETHRTH RARGGLYILE ASPVALALAL YSPRTHRGLY 12960
ARGGLYILEM ETLEASPTHR GLYARGGLYL YSGLSERCYS LYSGLYLETY RALAGLYHIS 13020
ARGGLYMETV ALPHESERIL EASPALAGLN GLYGLLYSGL YPRALAARGA RGARGGLYGL 13080
NLEGLYPHET RPGLYASNLY SGLYSERILE VALGLYPRAR GTRPLYSLEP RPHEMETGLY 13140
PRPHELEGLN SERVALASNP RLYSGLYTHR VALPHEPRSE RGLTHRGLGL YGLSERMETA 13200
LASERARGGL YVALASPPHE THRGLASPPR LELEGLNGLY ARGGLYVALL YSILESERGL 13260
YTRPASPVAL GLTHRLEGLY ASPGLILETH RHISVALGLY GLLYSPHETH RLYSGLYTYR 13320
LYSPRSERAL ASERSERGLY SERLYSHISA LAGLYGLNCY SGLYGLTYRH ISGLASNLYS 13380
HISPHETHRS ERLEGLGLLY SHISPHEVAL ASPTHRPHEG LYLEHISGLY HISLYSHISG 13440
LYGLYPRASN PHEGLGLNLE PRILEASNGL NPRARGHISG LYILEPRGLY GLYGLYILEA 13500
LATHRGLYAL AGLGLYILEL YSHISMETPH EGLYLEVALA LASERGLASP ALAGLYARGH 13560
ISPRVALGLV ALALAGLGLG LALASERLYS PRLYSHISVA LASPGLYPHE GLYILEHIST 13620
HRPHEARGHI SVALGLNLEL EGLNLEASNM ETGLTYRASP ASPASPILEL ECYSARGLYS 13680
SERLYSHISV ALTYRASPAL AVALGLNASP LYSILEALAP HEALASERTY RLEGLGLTYR 13740
ALAARGILEA SPALATHRTH RASNPRGLYM ETARGILEAS PTYRILEGLY GLYGLYASPL 13800
EPHEARGILE GLILEGLASN SERILEARGI LEGLASNGLN SERASPALAA SPGLYTYRSE 13860
RSERCYSSER THRLELYSIL EPHEGLGLNL EGLGLYMETS ERLESERLYS ILEPHESERT 13920
YRLYSMETAS NSERTHRLEA RGTYRLEPRP HEARGILEGL YLEHISPHEA RGTHRARGIL 13980
EHISLETHRV ALPRGLASPL EARGILEGLN ASPGLYSERG LNVALLYSIL EGLNGLYILE 14040
SERASNPRSE RGLYALALES ERSERGLYGL YLEGLYGLPR LYSILEGLNS ERLYSLEARG 14100
GLYLEVALGL NARGILEARG ASPALAMETA RGGLNARGIL EARGLEHISL EGLARGTHRG 14160
LYGLNLEGLY VALGLYSERA SPGLYASNPR VALVALALAG LYARGILESE RALATYRVAL 14220
GLGLYSERSE RARGILEVAL PRGLGLTYRV ALPRILETHR LYSILETYRS ERPHEPHEVA 14280
LGLYGLYALA VALPRGLASN LEARGILETY RVALTHRGLY GLSERTYRAL AGLYARGLYS 14340
ASPILEARGH ISGLYHISLY SLYSGLHISA SPLYSSERLY SPHETHRASP THRPRVALLE 14400
TYRGLYPRLY SLYSGLYASP ALAPRTHRIL EASPTHRSER ASNTYRPHEL EPHEGLYLYS 14460
LYSMETGLAS PASPLEARGL YSTYRTHRVA LPRSERTHRC YSGLYVALLY SLEGLMETTY 14520
RGLNGLYGLY ILEGLLESER ALALELEGLN METILEGLNA SPALAILEAR GLEPHESERT 14580
YRLEASPTHR GLNLEASNAR GLEGLYILET HRTYRTHRTH RTYRSERLYS LELYSASPLE 14640
VALLESERLE LEASNALALE GLNGLYGLYA RGLEASNTHR GLYALAVALI LEPRVALLEV 14700
ALARGLEASN VALILEASPP HEPRLYSLEG LNVALARGAL AALAALAARG ARGLESERAL 14760
AGLYSERARG LESERGLLEG LTRPILEARG LESERGLNLE GLSERGLYLY SLESERSERI 14820
LEALALEPRA RGLETHRASP LEGLILEASN ARGLEVALAL AHISSERVAL ALATHRTYRA 14880
LAARGLEVAL CYSPHEPHEP RTHRLYSLEV ALGLNASNAS PPHEASNTHR LELEARGMET 14940
ALAPRMETSE RGLGLASPLE ALATRPPHEA RGSERTHRPH EHISPRILEP RLYSMETGLY 15000
SERLESERAS PVALARGMET LYSSERILEG LGLLYSGLYG LGLYMETTHR ASNASPTYRI 15060
LESERALALE THRLYSASNA LAPHEILETH RASNTYRPRS ERGLGLNARG ASNALAGLYI 15120
LEGLNTHRSE RARGASNPHE SERARGPRLY SASNHISGLY THRSERTHRV ALALAPRGLN 15180
VALGLNALAS ERVALTYRAR GASNHISASN VALLESERAL AILEPRGLNG LPRTYRARGA 15240
SNILEASNME TLELETYRGL YTHRASPASP CYSSERGLYL YSASNLEASP GLLETRPILE 15300
VALGLYHISG LYALAVALAL AARGASNLEV ALGLYTHRSE RGLYPHETHR SERALAARGA 15360
SNMETHISAS PVALILEGLY ASNASPGLYT HRVALPRSER GLPHEARGAS NASNVALILE 15420
ILEGLNLEAS NARGASNSER METTHRASPC YSCYSILEGL THRTYRLEME TLYSSERGLA 15480
RGASNTHRLE ALAPHEPHES ERGLYASNGL VALILEASNA SPGLYPRSER SERLYSASNT 15540
HRPRVALPRS ERCYSPHEHI SPHEPHEILE TYRLYSGLYC YSTRPMETPH ELETYRARGA 15600
SNTYRPHEAL AGLTHRGLGL NVALMETPHE GLNPRGLYHI SILEVALARG PRASPGLYTH 15660
RGLYPHEARG LYSPRLETRP ARGHISTYRP HEGLNASNTH RGLNGLYILE ILEPHEVALV 15720
ALASPSERAS NASPARGPRV ALVALGLNVA LLEMETPRGL GLYMETASPS ERASPGLSER 15780
GLNALAILEL EASNASNILE GLYALAASPG LYGLNSERAL AGLNGLYALA SERPRGLYVA 15840
LVALILEALA SERPRSERLY SGLNASPLEP HEGLALAILE GLALAGLYAR GGLNTHRTYR 15900
ALASERCYST RPGLYGLYVA LGLYGLNGLY GLCYSARGGL YSERSERASN CYSLYSARGC 15960
YSTRPSERGL YVALPHETYR SERASNTRPI LEGLNGLLEL EARGARGSER METGLYLEGL 16020
SERARGSERA LAALAASPGL YLEALASERA LAILETHRSE RLYSSERALA ILESERGLNT 16080
YRGLYASPSE RPHEALALYS SERALAMETT HRLEPRARGS ERALAVALGL NSERASPVAL 16140
TRPARGSERA SPGLYGLNCY SSERASPLEL ELYSSERASP LYSLEASNVA LILEASPPHE 16200
PRLYSSERAS PTYRASPALA PHEILEARGS ERASPTYRGL NGLCYSALAA SPALAPRGLY 16260
GLNLYSSERA SPTYRSERAL ALEGLNSERG LNGLYLEILE LESERLEARG SERGLMETLE 16320
ALAGLGLNAS PLYSSERGLS ERASNPRGLY VALMETSERT HRARGSERGL YALAASPTHR 16380
HISLYSSERI LEVALILEAR GSERILETYR ALAILEASNS ERGLYARGSE RLEPRLEILE 16440
VALGLYASNS ERASPGLNGL GLYLYSSERG LNSERASPPH EGLSERGLPH ESERTHRALA 16500
LYSSERSERG LYALAVALTH RGLYGLNSER THRARGSERS ERSERALATY RGLSERLETH 16560
RSERALAVAL LYSSERTHRA SPTHRSERIL EASNVALARG SERVALVALG LASNASNASN 16620
ASPGLYLETH RALAALATYR ARGTHRALAL EPHEASPSER HISGLTYRAR GTHRALASER 16680
ASNPHEASPG LNPRHISSER ASPGLSERAL ALEGLNHISL EARGTHRCYS HISARGCYSC 16740
YSTHRTHRPH EALAPRASPA LATHRGLCYS GLASNCYSLY SHISTHRARG THRASPTYRS 16800
ERVALCYSGL YGLTHRTHRI LEPHELYSTH RGLYGLTHRT HRGLNILEHI SALAARGTHR 16860
GLYPRSERIL EGLNASPARG THRILESERA SNVALVALAS PASNGLLEAL AARGTHRLYS 16920
SERLEPRARG THRLEPRPRL EGLNTYRARG ASPLEASPLE LEPRLEHISG LNASNLEILE 16980
LYSTHRLEVA LSERTHRGLY ARGTHRPRAL AALAHISARG ALAARGTHRS ERGLYSERGL 17040
YSERSERSER PRGLPRARGT HRTHRASPVA LGLYTHRPHE GLYGLNLYST HRTHRGLMET 17100
THRGLNARGT HRTHRSERAS NPRGLTHRAR GTHRVALGLY SERSERCYSP RTYRCYSASP 17160
SERGLNALAP RGLNVALARG THRVALASNG LYGLYPHEGL NILEALAARG THRVALASNV 17220
ALASNASNLE LYSTHRVALT YRALAPHEAS PVALSERGLA SPGLYSERTY RLELYSTHRT 17280
YRGLVALVAL GLYASNVALT YRLYSVALAL ALEVALTYRG LYASPARGVA LALAPRASNS 17340
ERGLYALATY RLEASNGLAL AASPPHEARG VALALASERL ELEGLNARGV ALALATHRIL 17400
EGLYSERALA THRPHEALAA RGVALCYSAS NLEILEGLYL EMETGLYLEA RGVALASPAS 17460
NVALVALALA SERPHELYSV ALGLTYRSER ASPALAALAL YSVALPHEGL ALAGLYHISG 17520
LVALPRALAT YRGLNPRGLT HRALATYRGL ILEPHEHISA RGVALGLYSE RILEGLPHET 17580
HRALALEPRG LNLEGLNSER LEASPPHETH RLYSVALILE PRGLILEASP METPRSERHI 17640
SSERSERSER GLYTRPLYSV ALLEASPARG ASPPRASNHI SALALYSVAL LEPHELEGLY 17700
ARGVALLEIL EALAASPMET CYSARGARGV ALLEPRGLNV ALILEGLALA THRASNARGV 17760
ALGLNASNGL YALAVALTHR TRPGLSERAS PPRASNARGV ALGLNASNGL YALAVALTHR 17820
TRPGLSERAS PPRASNARGL YSVALSERAS NASPLEALAA RGVALTHRAL AMETARGTYR 17880
TRPTRPLECY SGLILEALAT YRCYSPHEAL ASERVALGLY GLYLYSVALV ALTHRASPSE 17940
RPHEARGVAL TYRSERVALA SPASNSERLY STRPASPASN LEASPSERAL AALALEASNT 18000
HRLYSTRPPH EALAGLASPP RSERARGTYR CYSALASERA LAGLNGLASP ASNALATHRL 18060
EGLNALALEL EARGTYRCYS GLYVALGLYV ALASNILELE TYRGLARGTY RGLALAALAI 18120
LEGLNGLYVA LALAALATHR ASPLYSTYRP HETYRGLYAS PASNTYRALA THRLEARGTY 18180
RGLYALATYR SERVALCYSS ERPRLYSTYR GLYGLTHRGL LYSSERGLYL EGLSERILEA 18240
LAALAALAAR GTYRILEALA ARGPRASPIL EMETLYSTYR LEASPGLNGL NILETHRALA 18300
GLTHRLYSTY RLEVALASPG LNLEASNPRG LGLYLYSTYR GLNPHEPRGL NTHRPRSERA 18360
RGTYRARGHI SLEPRPRGLT HRVALTHRGL YILELEGLYA RGALATHRPH ETRPTRPILE 18420
ASNSERILEL ELYSTYRTHR ALAGLGLYTY RGLALAALAT HRLYSTYRVA LASPALAGLY 18480
GLYPHEGLPR SERILELYS 18499

Claims (10)

1.黄曲霉预警分子参考物质，其特征在于：其由黄曲霉产毒菌制备获得，含有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008，黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的氨基酸序列如SEQ IDNO.1 所示，黄曲霉预警分子参考物质通过检测标定其中预警分子AFT-YJFZP008的含量，作为参考物质使用。
2.权利要求1所述的黄曲霉预警分子参考物质的制备方法，其特征在于：包括：将含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌接种到察氏培养基中培养，收集长成的菌丝，用液氮研磨菌丝至粉末状，再将菌丝粉末置于水或常规缓冲液中，随后用高压均质仪裂解菌丝粉末，获得黄曲霉产毒菌裂解液，裂解液经过脱盐处理,并通过检测标定其中预警分子AFT-YJFZP008的含量，得到黄曲霉预警分子参考物质。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：还包括将脱盐后裂解液，再通过常规的冷冻干燥去除水分，获得黄曲霉产毒菌裂解液干物质，通过检测标定黄曲霉产毒菌裂解液干物质中预警分子AFT-YJFZP008的含量。
4.一种样品中黄曲霉预警分子参考物质含量或黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量的检测方法，其特征在于：以权利要求1所述的黄曲霉预警分子参考物质建立标准曲线，测定样品中黄曲霉预警分子参考物质含量，以及进一步地，结合黄曲霉预警分子参考物质中AFT-YJFZP008的黄曲霉毒素预警分子标定含量，用于黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量的检测，所述的黄曲霉毒素预警分子是指AFT-YJFZP008肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1 所示。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：标定黄曲霉预警分子参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量为通过黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008检测方法标定黄曲霉产毒菌裂解液或者黄曲霉产毒菌裂解液干物质中AFT-YJFZP008含量，具体的过程为：
a制备黄曲霉预警分子参考物质溶液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度；
用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力预警分子AFT-YJFZP008纯品溶液，替换待测液，用于制作标准曲线，得到黄曲霉预警分子参考物质中AFT-YJFZP008的浓度，标定黄曲霉预警分子参考物质中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：其使用的检测方法为间接非竞争双抗体夹心ELISA法或荧光免疫层析法；
所述非竞争双抗体夹心ELISA法为：
a制备待测样品待测液，加入到孔底包被有黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；
b加入黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体反应，洗板；
c加入与黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；
d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度；
以系列浓度的黄曲霉预警分子参考物质替换待测液，用于制作标准曲线，用于计算得到待测样品中黄曲霉预警分子参考物质的含量，计算得到待测样品中黄曲霉预警分子参考物质的含量，进一步结合黄曲霉预警分子参考物质中AFT-YJFZP008的黄曲霉毒素预警分子标定含量，得到样品中黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量；
所述的荧光免疫层析法为：
提供黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡，包括黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体、信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板、羊抗兔抗体，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线上包被有羊抗兔抗体，所述的检测线上包被有黄曲霉毒素预警分子纳米抗体或者黄曲霉毒素预警分子单克隆抗体，所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体装载在样品垫上，或者单独装载，所述的黄曲霉毒素预警分子是指AFT-YJFZP008肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示；
配制待测样品的待测液，然后即可用上述黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡测定黄曲霉毒素预警分子AFT-YJFZP008含量，具体方法为：样品垫上装载有信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体时，将待测样品的待测液加到黄曲霉毒素风险预警智能感知卡的样品垫上，反应一段时间，读取分析结果；
样品垫上没有装载信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体时，将待测样品的待测液加到信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体中，然后将黄曲霉毒素污染早期风险预警智能感知卡插入待鉴菌株或待鉴别样品的待测液中，反应一段时间，读取分析结果。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的信号材料是指常规的铕乳胶微球或金纳米颗粒。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的信号材料标记的黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体，是指信号材料通过常规标记方法与黄曲霉毒素预警分子兔多克隆抗体发生偶联以后的产物。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述的样品为农田土壤、农产品或饲料。
10.一种权利要求4所述的检测方法在预警黄曲霉毒素污染风险水平的应用，应用方法为：根据权利要求4所述的方法，测定样品中黄曲霉预警分子参考物质含量，根据黄曲霉预警分子参考物质含量预警黄曲霉毒素污染风险水平，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质在0.667mg/g以下时属于低风险区域，当含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉预警分子参考物质在6.67mg/g以上时属于高风险区域。
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