CN106932370A - 同步检测黄曲霉毒素b1等五种真菌毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及应用 - Google Patents

同步检测黄曲霉毒素b1等五种真菌毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及同步检测黄曲霉毒素B1等五种真菌毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及应用。其包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的各单克隆抗体冻干品的样品反应瓶；其中荧光试纸条包括PVC衬底，衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，自上而下设置横向质控线和5条检测线，分别包被各毒素的牛血清白蛋白偶联物，伏马毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201636的杂交瘤细胞株Fm7A11分泌产生。可用于黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染的同步检测，操作简单、快速、灵敏度高。

Description

同步检测黄曲霉毒素B1等五种真菌毒素混合污染的免疫层析 时间分辨荧光试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及真菌毒素免疫层析时间分辨荧光试剂盒，具体涉及一种同步检测黄曲霉毒素B1等五种真菌毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及应用。
背景技术
真菌毒素是真菌在粮油或饲料中生长代谢所产生的一系列有毒有害物质，目前在自然界中已发现的真菌毒素多达400多种。按照主要产毒菌种，真菌毒素可以分为曲霉菌毒素(如黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素等)、青霉菌毒素和镰刀菌毒素(如玉米赤霉烯酮等)等几大类。真菌毒素具有致癌、致畸、致突变的作用，可引起人体的急性或慢性中毒，严重危害人体健康。真菌毒素污染农作物、食品及饲料，给人类和家畜的生命健康带来巨大威胁。为了保障粮食卫生安全，我国对粮食中的真菌毒素制定了相关的限量标准(GB 2761—2011)。当前污染农产品食品及饲料等的主要真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素。黄曲霉毒素主要出现在谷物和豆类植物中，若禽类接触到被黄曲霉毒素污染后的饲料，则在牛奶、奶制品、鸡蛋和肉类中也会检测到黄曲霉毒素。黄曲霉毒素主要通过食物消化感染，长期的皮肤接触也会造成慢性感染，引发急性或者慢性肝损伤、急性肝炎、肝细胞脂肪变性，最终导致肝癌。伏马毒素是由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢产物，主要由多氢醇和丙三酸组成双酯类化合物，现已发现11种伏马毒素，其中伏马毒素B1危害最严重，主要感染玉米、高粱、大米等农作物。伏马毒素是一种致癌剂，引发脑水肿，脑坏死以及肝脏毒性，严重损伤免疫系统。赭曲霉毒素主要感染谷类农作物以及豆类植物，如玉米、大麦、小麦、咖啡豆、豌豆、可可豆等。赭曲霉毒素在机体内胃肠道，如十二指肠、空肠段被吸收，具有强肾毒性。玉米赤霉烯酮污染广泛，在世界各大洲的谷物以及农副产品中都能都检测到，多污染玉米、燕麦、小麦、大麦、小米等农产品食品，以及奶制品、牛肉等食品。杂色曲霉毒素主要是由黄曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、细皱曲霉等真菌产生的次级代谢产物，其毒性仅次于黄曲霉毒素，可诱发肝癌、肺癌及其他肿瘤
目前，真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法。薄层色谱法简捷、便利，但重现性差、精度低；酶联免疫法特异性强、前处理简单，但假阳性率高，不能作为确证方法；液相色谱、液相色谱-质谱联用法稳定性好、灵敏度较高，但样品前处理过程复杂，检测时间长，所使用的仪器昂贵，对实验环境和检测人员要求高，难以实现快速检测。免疫层析荧光检测技术是20世纪80年代初期开发的一种免疫分析方法，它是在单克隆抗体技术、荧光标记免疫技术和新材料技术基础上发展起来的快速 检测技术。该技术以微孔膜为固相载体，将已知的特异性抗原固定于硝酸纤维素膜上作为检测线。当加入待测样品后，样品经毛细管的扩散作用首先与免疫探针相结合，并继续层析至检测线，标记物与待测物的复合物被检测线的抗原截获，从而呈现荧光条带。该法具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简单等优点，结果判断直观可靠，容易被基层单位人员掌握，适合现场快速筛查和基层大面积推广，特别适合农产品食品及饲料等领域迫切需要的能快速、同步检测真菌毒素混合污染的检测技术，以实现对农产品食品及饲料中真菌毒素混合污染的同步、快速监测。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种能同步检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒、制备方法及其应用。该免疫层析时间分辨荧光试剂盒可用于黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
同步检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体、铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体、铕标记的杂色曲霉单克隆抗体冻干品的样品反应瓶。其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括PVC衬底，衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和5条检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述5条线上分别包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物，所述的伏马毒素B1单克隆抗体为由保藏编号CCTCC NO.C201636的杂交瘤细胞株Fm7A11分泌产生的单克隆抗体。该杂交瘤细胞株已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201636。
按上述方案，所述铕标记的单克隆抗体是按照以下方法制备得到：
铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体将黄曲霉毒素B1单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联黄曲霉毒素B1单克隆抗体：30μg-80μg。
铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体将赭曲霉毒素A单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼 酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体：40μg-90μg。
铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体将玉米赤霉烯酮单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联玉米赤霉烯酮单克隆抗体：30μg-90μg。
铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体将伏马毒素B1单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联伏马毒素B1单克隆抗体：30μg-80μg。
铕标记的杂色曲霉单克隆抗体将杂色曲霉单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的杂色曲霉单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联杂色曲霉单克隆抗体：30μg-80μg。
按上述方案，所述的活化方法为取铕标记试剂，用pH 8.2 0.2mol/L的硼酸缓冲液中超声分散，然后缓慢加入碳二亚胺溶液，室温振荡活化，离心去上清液，用pH 8.20.2mol/L的硼酸缓冲液复溶，备用，所述的活化时间为15-30min。
按上述方案，上述配制好的铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体、铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体、铕标记的杂色曲霉单克隆抗体复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01mol/LpH 8.2的磷酸缓冲液中备用，使用时，将其l放入样品反应瓶中，置于冷冻干燥机中冻干，得到各铕标记的单克隆抗体冻干品，备用。
按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长10-16mm，宽3-5mm；检测垫长25-33mm，宽3-5mm；样品垫长12-18mm，宽3-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-2mm；所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为5-10mm，每相邻两条检测线之间的间距为1.5-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线3-6mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。
按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为80-200ng。
所述样品反应瓶中铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的杂色曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg。
按上述方案，所述的同步检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01％-0.30％的吐温-20水溶液。
按上述方案，所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下：
(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；
(2)检测垫的制备：
将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物配制成浓度为0.08-0.50mg/mL的包被液，用线喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到5条检测线，然后于37-40℃条件下干燥60-120min；
将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.5mg/mL的包被液，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线然后于37-40℃条件下干燥60-120min；
(3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-6h，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：
在PVC底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条。
按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物包被液、伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物包被液、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物包被液、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清蛋白0.5g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
上述免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应6-10min后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；基于预先获得的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素的含量。
按上述方案，所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：
(1)配制得到系列梯度浓度的黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和杂色曲霉毒素标准溶液；
(2)将适量上述梯度的黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应6min，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的荧光强度，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)；
(3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线。
本发明的有益效果：
(1)快速、同步定量检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和杂色曲霉毒素。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒能在一条试纸条上实现对黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和杂色曲霉毒素的同步、快速定量检测，使用的抗体均为单克隆抗体，特异性好、灵敏度高，各真菌毒素的检测之间无干扰，简单、快速。
(2)灵敏度高。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒对检测溶液中黄曲霉毒素B1的最低检测限为0.06ng/mL，伏马毒素B1的最低检测限为0.2ng/mL，赭曲霉毒素A的最低检测限为0.5ng/mL，玉米赤霉烯酮的最低检测限为1ng/mL，杂色曲霉毒素的最低检测限为0.3ng/mL，该检测限能满足欧盟对食品中这5种真菌毒素的限量要求。
附图说明
图1为本发明提供的黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒中免疫层析时间分辨荧光试纸条的结构示意图。图中：1吸水垫、2检测垫、3样品垫、4质控线、5黄曲霉毒素B1检测线、6伏马毒素B1检测线、7赭曲霉毒素A检测线、8玉米赤霉烯酮检测线、9杂色曲霉毒素检测线。
具体实施方式
实施例1黄曲霉毒素B1单克隆抗体的获得
黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201014的杂交瘤细胞株3G1分泌产生，具体根据授权号为ZL201210117614.9的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将获得的杂交瘤细胞株3G1注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集小鼠的腹水，纯化处理后获得黄曲霉毒素B1单克隆抗体。其中，纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得；
实施例2赭曲霉毒素A单克隆抗体的获得
赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，具体根据申请号为201310115921.8的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将杂交瘤细胞株1H2注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，纯化即得赭曲霉毒素A单克隆抗体。所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的赭曲霉毒素A单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得；
实施例3玉米赤霉烯酮单克隆抗体的获得
玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生，具体根据申请号为201310115825.3的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将杂交瘤细胞株2D3注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，纯化即得玉米赤霉烯酮单克隆抗体；所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得；
实施例4杂色曲霉毒素单克隆抗体的获得
杂色曲霉毒素单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生，具体根据申请号为201410115952.8的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将获得的杂交瘤细胞株ST03注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的Balb/c小鼠的腹部，收集小鼠的腹水，纯化后得到杂色曲霉毒素单克隆抗体。所述的纯化为辛酸-硫酸铵纯化法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的杂色曲霉毒素单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得。
实施例5伏马毒素B1单克隆抗体的获得
杂交瘤细胞株Fm7A11的筛选
1.抗原合成及动物免疫
购买市售的伏马毒素B1标准品进行完全抗原合成，具体合成步骤如下:将2mg的FB1标准品粉末与2mg的EDC分别溶于500μL的0.01mol/LPBS溶液，得到EDC溶液和FB1溶 液，将4mg/mL(溶液为0.01mol/LPBS)的EDC溶液逐滴加入溶解好的FB1溶液中，室温下轻轻搅拌10分钟。将5mg/mL(溶液为0.01mol/LPBS)的BSA溶液逐滴加入到上述混合液中，室温搅拌反应4小时。透析3天。最后进行常规紫外扫描法鉴定，鉴定结果表明FB1-BSA完全抗原制备成功。
购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫实验室合成的伏马毒素完全抗原FB1-BSA。第一次免疫将伏马毒素完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的伏马毒素完全抗原乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射。第三次与第四次免疫分别与上一次免疫间隔两周，免疫方式与第二次相同。四次免疫剂量相同，仅为100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前量的2倍。
2.细胞融合
于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死待融合小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5：1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，1200rpm，离心5min。弃去上清，控干，加入1mLPEG，融合1分钟，缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，弃上清，沉淀即为融合细胞，用20mL完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。
所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，2％(体积百分数)生长因子(HFCS)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于sigma-Aldrich公司。
3.细胞株的筛选及克隆
待细胞融合后2-3周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用HAT液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接ELISA方法，筛选出抗伏马毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用伏马毒 素B1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦IC50值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株Fm7A11。
抗伏马毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株Fm7A11抗体可变区序列测定
(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株Fm7A11的总RNA；
(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScriptTM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；
(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-CAG GTS MAR CTG MAG GAG TCW G-3’(22mer)和5’-CAG GGG CCA GTGGAT AGA CAG ATG GGG G-3’(28mer),其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATC AAG ATG ACC CAG TCT CCA-3’(24mer)和5’-CCGTTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。
得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长379bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由126个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长348bp,序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由116个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。
5.抗伏马毒素B1单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定
将实施例1获得的抗伏马毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株Fm7A11注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上， 弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/LPBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗伏马毒素B1单克隆抗体；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。
用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株Fm7A11分泌的抗伏马毒素B1单克隆抗体的亚型为IgG2b。
用常规非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)测得小鼠腹水纯化得到的抗体效价可达到3.2×105，即抗体稀释3.2×105倍时溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA测定其对伏马毒素B1灵敏度为0.32ng/mL。对伏马毒素B2、B3的交叉反应率为4.3％和12.8％。与黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素的交叉反应率均小于0.1％。
实施例6
取铕荧光微球，加入1mL 0.2mol/L pH8.2的硼酸缓冲液中，300w超声处理40秒，然后缓慢加入40uL 15mg/mL的碳二亚胺，室温振摇20min后，17000g离心15min，收集沉淀，用0.2mol/L pH 8.2的硼酸缓冲液复溶，将活化的荧光微球加入1mg/ml抗体(黄曲霉毒素B1单克隆抗体35ul、赭曲霉毒素A单克隆抗体45ul、玉米赤霉烯酮单克隆抗体55ul、伏马毒素B1单克隆抗体40ul、杂色曲霉毒素单克隆抗体50ul)，4℃振摇搅拌反应12h后，12000g离心10min，含1％BSA的0.2mol/L pH8.2的硼酸缓冲液复溶，4℃振摇搅拌反应4h，12000g离心10min收集沉淀，复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.2mol/LpH8.2的硼酸缓冲液中，即得铕标记的真菌毒素抗体，置于4℃保存备用。
同步检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染同步检测的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用
黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染同步检测免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒，它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条、含有铕标 记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体、铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体冻干品、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品、铕标记的杂色曲霉毒素单克隆抗体冻干品的样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括PVC衬底，PVC衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm；
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长16mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；
2)检测垫的制备
检测线的包被：
将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.25mg/mL的溶液，于距硝酸纤维素膜上沿6mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线I，每厘米检测线I上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100ng；将伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.25mg/mL的包被液，于距检测线I 4mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线II，每厘米检测线II上所需伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为200ng；将赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.45mg/mL的包被液，于距检测线II4mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线III，每厘米检测线III上所需赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为160ng；将玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.35mg/mL的包被液，于距检测线III 4mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线IV，每厘米检测线IV上所需玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为200ng；将杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.4mg/mL的包被液，于距检测线IV 4mm的位置，用线喷方式将其包被于硝酸纤维素膜上得到检测线V，每厘米检测线V上所需杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为200ng；然后于37℃条件下干燥120min；
质控线的包被：
将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.4mg/mL的包被液；于距检测线I4.5mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为120ng，然后于37℃条件下干燥120min；
所述的包被缓冲液为：0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容至10mL所得；
所述的硝酸纤维素膜长33mm，宽4mm。
(3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜剪裁成长12mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于40℃条件下干燥4小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
所述的封闭液为1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；
(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：
在PVC衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得，见图1；
所述的样品反应瓶的获得：配制好的铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体、铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体、铕标记的杂色曲霉单克隆抗体；复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01mol/L pH 8.2的磷酸缓冲液中，各取一定量放入样品反应瓶中，置于冷冻干燥机中冻干，备用。所述样品反应瓶中铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg，所述样品反应瓶中铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体冻干品的含量为0.25μg，所述样品反应瓶中铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg，所述样品反应瓶中铕标记的杂色曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.3μg；
所述黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染同步检测免疫层析时间分辨荧光检测试剂盒在饲料样品黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素检测中的应用：
取经确认的阴性饲料样品20g加入100mL 70％(体积分数)的甲醇溶液，均质2min，静置、用双层滤纸过滤，收集滤液1mL，加入5mL样品稀释液稀释滤液，混匀，得到空白基质溶液；
配置黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1分别对应为以下浓度梯度的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1混合标准溶液6个，黄曲霉毒素B1(0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL)、伏马毒素B1(0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL)、赭曲霉毒素A(0ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL)、玉米赤霉烯酮(0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL)、杂色曲霉毒素(0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL)配置成梯度 的混合标准溶液。标准溶液每个浓度点重复5次，用多毒素检测试纸条进行检测，用时间分辨荧光检测仪检测：将上述标准品溶液150μL加入样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应6min后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测，(激发波长：365nm，测定波长：615nm)，读取检测区域的荧光信号强度值，计算5次重复平均值。以标准系列浓度值自然对数(Lnc)和T线的荧光信号强度值/C线的荧光信号强度值(T/C)绘制标准曲线，标准曲线公式如Y＝a*lnc+b，5种检测对象的标准曲线参数如下表所示：
a b R2 检测限/ng/mL
黄曲霉毒素B1 -1.425 3.524 0.991 0.06
伏马毒素B1 -1.750 3.448 0.989 0.2
赭曲霉毒素A -1.594 4.788 0.989 0.5
玉米赤霉烯酮 -1.750 5.751 0.979 1.0
杂色曲霉 -1.643 3.364 0.976 0.3
取待检饲料样品20g加入100mL 70％(体积分数)的甲醇溶液，均质2min，静置、用双层滤纸过滤，收集滤液1mL，加入5mL样品稀释液稀释滤液，混匀；取待检饲料样品检测液150μL加入样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应6min后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长：365nm，测定波长：615nm)，获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条5条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)，然后将其分别代入上述得到的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素B1浓度、伏马毒素B1浓度、赭曲霉毒素A浓度、玉米赤霉烯酮浓度、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线，得该饲料样品中的黄曲霉毒素B1含量为6.4μg/kg、伏马毒素B1含量为4.1μg/kg、赭曲霉毒素含量为0μg/kg、玉米赤霉烯酮含量为0μg/kg、杂色曲霉毒素含量为3.3μg/kg。
实施例7
与实施例6不同的是：免疫层析时间分辨荧光试纸条中吸水垫长14mm，宽3mm；检测垫长30mm，宽3mm；样品垫长16mm，宽3mm，相邻各垫的交叠长度为2mm；所述荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8mm，每相邻两条检测线之间的间距为4mm。所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为200ng，每厘米检测线所需的伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为250ng，每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为200ng，每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为250ng，每厘米检测线所需的杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为300ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为150ng；所述样品反应瓶中铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg，所述样品反应瓶中铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体冻干品的含量为0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为0.2μg，所述样品反应瓶中铕标记的杂色曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.3μg；
取经高效液相色谱确认的含多种毒素的饲料样品(黄曲霉毒素B1含量为5.1μg/kg、伏马毒素B1含量为3.9μg/kg、赭曲霉毒素含量为1.5μg/kg、玉米赤霉烯酮含量为41.2μg/kg、杂色曲霉毒素含量为5.3μg/kg)。
取待检饲料样品10g加入30mL 70％(体积分数)的甲醇溶液，均质2min，静置、用双层滤纸过滤，收集滤液1mL，加入9mL样品稀释液稀释滤液，混匀；取待检饲料样品检测液150μL加入样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应6min后，用吸水纸吸干样品垫残留液体，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长：365nm，测定波长：615nm)，获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条5条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)，然后将其分别代入上述得到的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素B1浓度、伏马毒素B1浓度、赭曲霉毒素A浓度、玉米赤霉烯酮浓度、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线，得该饲料样品中的黄曲霉毒素B1含量为5.3μg/kg、伏马毒素B1含量为3.7μg/kg、赭曲霉毒素含量为1.8μg/kg、玉米赤霉烯酮含量为41.8μg/kg、杂色曲霉毒素含量为5.7μg/kg。
序列表
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞同步检测黄曲霉毒素B1等五种真菌毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及应用
＜160＞ 4
＜210＞ 1
＜211＞ 379bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 1
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag 50
cctgtccatc acttgcactg tctctgggct ttcattaacc agctatggtg 100
tacactgggt tcgtcaggcc ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta 150
atttggggtg gtggaaacac aaattataat tcggctctca tgtccagact 200
gagcatcagc aaagacaact ccaggagcca agttttctta agaatgaaca 250
gtctgcaaat tgatgacaca gccatgtact attgtgccag aggcaggatg 300
gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcgtcag ccaaaacgac 350
acccccatct gtctatccac tggcccctg 379
＜210＞ 1
＜211＞ 348bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 2
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga 50
aagagtcact atcacttgca aggcgagtca ggacattagt agctatttag 100
gctggttaca gcagaaacca gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt 150
gcaaacacat tggtagaagg ggtcccatcc agattcagtg gcagtggatc 200
tggggaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat gaagatatgg 250
gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatcc 348
＜210＞ 1
＜211＞ 126
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 3
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 15
Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr 30
Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 45
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 60
Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg 75
Ser Gln Val Phe Leu Arg Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr 90
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln 105
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 120
Val Tyr Pro Leu Ala Pro 126
＜210＞ 1
＜211＞ 116
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 4
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu 15
Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser 30
Ser Tyr Leu Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys 45
Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Thr Leu Val Glu Gly Val Pro Ser 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 75
Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln 90
Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 105
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 116

Claims (10)

1.同步检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体、铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体、铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体、铕标记的杂色曲霉单克隆抗体冻干品的样品反应瓶。其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括PVC衬底，衬底的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和5条检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述5条线上分别包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物，所述的伏马毒素B1单克隆抗体为由保藏编号CCTCC NO.C201636的杂交瘤细胞株Fm7A11分泌产生的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述铕标记的单克隆抗体是按照以下方法制备得到：
铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体将黄曲霉毒素B1单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联黄曲霉毒素B1单克隆抗体：30μg-80μg；
铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体将赭曲霉毒素A单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体：40μg-90μg；
铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体将玉米赤霉烯酮单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联玉米赤霉烯酮单克隆抗体：30μg-90μg；
铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体将伏马毒素B1单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联伏马毒素B1单克隆抗体：30μg-80μg；
铕标记的杂色曲霉单克隆抗体将杂色曲霉单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的杂色曲霉单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联杂色曲霉单克隆抗体：30μg-80μg。
3.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的活化方法为取铕标记试剂，用pH 8.2 0.2mol/L的硼酸缓冲液中超声分散，然后缓慢加入碳二亚胺溶液，室温振荡活化，离心去上清液，用pH 8.2 0.2mol/L的硼酸缓冲液复溶，备用，所述的活化时间为15-30min。
4.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长10-16mm，宽3-5mm；检测垫长25-33mm，宽3-5mm；样品垫长12-18mm，宽3-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-2mm；所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为5-10mm，每相邻两条检测线之间的间距为1.5-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线3-6mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。
5.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng，每厘米检测线所需的杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100-400ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为80-200ng。
6.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述样品反应瓶中铕标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的伏马毒素B1单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的赭曲霉毒素A单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的杂色曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg。
7.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的同步检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素混合污染的免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01％-0.30％的吐温-20水溶液。
8.根据权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下：
(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；
(2)检测垫的制备：
将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物配制成浓度为0.08-0.50mg/mL的包被液，用线喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到5条检测线，然后于37-40℃条件下干燥60-120min；
将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.5mg/mL的包被液，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线然后于37-40℃条件下干燥60-120min；
(3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-6h，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：
在PVC底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条。
9.权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素含量检测中的应用，其特征在于：将待测样品经前处理获得待测样品溶液，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应6-10min后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；基于预先获得的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素的含量。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：
(1)配制得到系列梯度浓度的黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和杂色曲霉毒素标准溶液；
(2)将适量上述梯度的黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应6min，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的荧光强度，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)；
(3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素浓度的关系曲线。
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