CN113588955A - 一种用于链格孢霉毒素的检测试纸 - Google Patents

一种用于链格孢霉毒素的检测试纸 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品安全检测技术领域，公开了一种用于链格孢霉毒素的检测试纸，设置有：试纸、微孔条、微孔试剂和微孔塞；试纸包括底板、反应膜、样品吸收垫和吸水垫；样品吸收垫、反应膜和吸水垫依次附着于底板上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；反应膜上由始端至末端具有T线和C线，T线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；T线上包被链格孢霉毒素‑载体蛋白偶联物；C线上包被可与链格孢霉毒素特异性抗体结合的抗体微孔试剂为冻干的链格孢霉毒素特异性抗体‑胶体金标记物。本发明能够有效检测链格孢霉毒素，方法耗时短，节约检测时间，重复性好，提高了工作效率。

Description

一种用于链格孢霉毒素的检测试纸
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，尤其涉及一种用于链格孢霉毒素的检测试纸。
背景技术
目前：链格孢霉毒素是一类重要的真菌毒素，但其限量标准目前仍未出台，导致该毒素检测技术发展较为缓慢。目前链格孢霉毒素的前处理方法通常采用QuEChERs法，但是存在前处理时间长、试剂消耗大、重复性查的缺点。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的检测方法前处理时间长、试剂消耗大、重复性查。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于链格孢霉毒素的检测试纸。
本发明是这样实现的，一种用于链格孢霉毒素的检测试纸，所述用于链格孢霉毒素的检测试纸设置有：
试纸、微孔条、微孔试剂和微孔塞；
所述试纸包括底板、反应膜、样品吸收垫和吸水垫；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；
所述反应膜上由始端至末端具有T线和C线，所述T线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T线上包被链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与链格孢霉毒素特异性抗体结合的抗抗体；
所述微孔条上具有微孔塞；所述微孔试剂为冻干的链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物；所述微孔试剂位于所述微孔条上。
本发明的另一目的在于提供一种所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法包括：
步骤一，制备链格孢霉毒素单抗，并进行纯化；进行胶体金溶液的制备；并制备链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物；取制备的胶体金溶液120ml，用摩尔浓度为0.5mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至7.8；
步骤二，将纯化后的链格孢霉毒素单抗1.8mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置一段时间；逐滴加入质量浓度为15％的无菌牛血清蛋白8ml，搅拌一段时间，静置过夜；
步骤三，将标记后的胶体金溶液离心，弃上清液，向沉淀中加入摩尔浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液2ml重悬，得到链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物；
步骤四，制备冻干有链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂的微孔条；制备包被所述链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物的检测线和包被抗抗体的质控线的反应膜；
步骤五，将制备好的反应膜与样品吸收垫、保护膜、吸水垫、底板组装成试纸；将制备好的冻干有链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂的微孔条、微孔塞和试纸组装成试纸条。
进一步，步骤一中，所述制备链格孢霉毒素单抗，并进行纯化包括：
(1)制备链格孢霉毒素人工抗原；基于制备的链格孢霉毒素人工抗原通过动物免疫和杂交瘤技术获得链格孢霉毒素单克隆抗体；
(2)取腹水4℃下12000r/min离心15min，去除杂质；取腹水：醋酸盐缓冲溶液按体积比1:2混合，室温搅拌下加入正辛酸，调整pH到4.8；室温搅拌混合30min，4℃静置2h，充分沉淀；
(3)4℃下12000r/min离心15min，弃沉淀；上清经砂芯漏斗过滤后，加入1/10体积的0.1mol/LpH 7.4的PBS，用2mol/LNaOH调pH值至7.4；
(4)冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸按，45％饱和度；4℃静置1h以上；4℃下10000r/min离心30min，弃上清；
(5)沉淀用适量pH 7.4PBS溶解，于5L的0.01mol/L,pH 7.4的PBS中4℃透析三天，每天换三次液；透析完毕后分装，即可。
进一步，步骤(1)中，所述制备链格孢霉毒素人工抗原包括：
1)称取半抗原0.1mmoL溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺即DMF溶剂中，搅拌加入0.0512g的0.2mmoL的DCC和0.023g的0.2mmoL的NHS，4℃下搅拌反应过夜，离心后上清液为记为A液；
2)称取载体蛋白0.02g溶于2mL浓度为0.1mol/L的pH值8.0的PBS中，充分溶解后标记为B液；
3)磁力搅拌下，将A液慢慢的逐渐滴入B液中，4℃下反应12h；反应完后离心去上清液，即得到偶联载体蛋白的完全抗原溶液；
4)4℃下用PBS溶液透析2天，每天更换3次透析液，得到的人工抗原。
进一步，步骤(2)中，每毫升腹水加入33μl正辛酸。
进一步，步骤一中，所述进行胶体金溶液的制备包括：
取质量浓度为0.01-0.015％的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为1.5％的柠檬酸三钠水溶液1.5ml，继续搅拌加热20h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有胶体金颗粒的胶体金溶液。
进一步，所述制备链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物包括：
利用链格孢霉毒素半抗原与载体蛋白偶联得到链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物。
进一步，所述链格孢霉毒素半抗原制备方法包括：
取链格孢霉毒素1.g、羧甲基羟胺0.6g和吡啶2ml于20ml DMSO中的混合液，在室温下搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到链格孢霉毒素与羧甲基羟胺的缩合物。
进一步，步骤三中，所述离心包括：于16000r/min离心15-20min。
本发明的另一目的在于提供一种所述用于链格孢霉毒素的检测试纸在检测链格孢霉毒素残留中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明能够有效检测链格孢霉毒素，方法耗时短，节约检测时间，重复性好，提高了工作效率。采用本发明方法回收率高，且适用范围广，本发明的检测试纸进行检测方法操作简便、检出限低，灵敏度强，重现性好，准确性高，完全可以满足日常对于链孢霉毒素的检测要求。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的制备链格孢霉毒素单抗，并进行纯化的方法流程图。
图3是本发明实施例提供的制备链格孢霉毒素人工抗原的方法流程图。
图4是本发明实施例提供的进行胶体金溶液的制备的方法流程图。
图5是本发明实施例提供的链格孢霉毒素半抗原制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于链格孢霉毒素的检测试纸，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的用于链格孢霉毒素的检测试纸设置有：
试纸、微孔条、微孔试剂和微孔塞；
所述试纸包括底板、反应膜、样品吸收垫和吸水垫；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；
所述反应膜上由始端至末端具有T线和C线，所述T线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T线上包被链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与链格孢霉毒素特异性抗体结合的抗抗体；
所述微孔条上具有微孔塞；所述微孔试剂为冻干的链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物；所述微孔试剂位于所述微孔条上。
如图1所示，本发明实施例提供的用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法包括：
S101，制备链格孢霉毒素单抗，并进行纯化；进行胶体金溶液的制备；并制备链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物；取制备的胶体金溶液120ml，用摩尔浓度为0.5mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至7.8；
S102，将纯化后的链格孢霉毒素单抗1.8mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置一段时间；逐滴加入质量浓度为15％的无菌牛血清蛋白8ml，搅拌一段时间，静置过夜；
S103，将标记后的胶体金溶液于16000r/min离心15-20min，弃上清液，向沉淀中加入摩尔浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液2ml重悬，得到链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物；
S104，制备冻干有链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂的微孔条；制备包被所述链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物的检测线和包被抗抗体的质控线的反应膜；
S105，将制备好的反应膜与样品吸收垫、保护膜、吸水垫、底板组装成试纸；将制备好的冻干有链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂的微孔条、微孔塞和试纸组装成试纸条。
如图2所示，本发明实施例提供的制备链格孢霉毒素单抗，并进行纯化包括：
S201，制备链格孢霉毒素人工抗原；基于制备的链格孢霉毒素人工抗原通过动物免疫和杂交瘤技术获得链格孢霉毒素单克隆抗体；
S202，取腹水4℃下12000r/min离心15min，去除杂质；取腹水：醋酸盐缓冲溶液按体积比1:2混合，室温搅拌下加入正辛酸，调整pH到4.8；室温搅拌混合30min，4℃静置2h，充分沉淀；
S203，4℃下12000r/min离心15min，弃沉淀；上清经砂芯漏斗过滤后，加入1/10体积的0.1mol/LpH 7.4的PBS，用2mol/LNaOH调pH值至7.4；
S204，冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸按，45％饱和度；4℃静置1h以上；4℃下10000r/min离心30min，弃上清；
S205，沉淀用适量pH 7.4PBS溶解，于5L的0.01mol/L,pH 7.4的PBS中4℃透析三天，每天换三次液；透析完毕后分装，即可。
如图3所示，本发明实施例提供的制备链格孢霉毒素人工抗原包括：
S301，称取半抗原0.1mmoL溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺即DMF溶剂中，搅拌加入0.0512g的0.2mmoL的DCC和0.023g的0.2mmoL的NHS，4℃下搅拌反应过夜，离心后上清液为记为A液；
S302，称取载体蛋白0.02g溶于2mL浓度为0.1mol/L的pH值8.0的PBS中，充分溶解后标记为B液；磁力搅拌下，将A液慢慢的逐渐滴入B液中，4℃下反应12h；反应完后离心去上清液，即得到偶联载体蛋白的完全抗原溶液；
S303，4℃下用PBS溶液透析2天，每天更换3次透析液，得到的人工抗原。
本发明实施例提供的每毫升腹水加入33μl正辛酸。
如图4所示，本发明实施例提供的进行胶体金溶液的制备包括：
S401，取质量浓度为0.01-0.015％的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾；
S402，一次性快速加入质量浓度为1.5％的柠檬酸三钠水溶液1.5ml；
S403，继续搅拌加热20h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有胶体金颗粒的胶体金溶液。
本发明实施例提供的制备链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物包括：
利用链格孢霉毒素半抗原与载体蛋白偶联得到链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物。
如图5所示，本发明实施例提供的链格孢霉毒素半抗原制备方法包括：
S501，取链格孢霉毒素1.g、羧甲基羟胺0.6g和吡啶2ml于20ml DMSO中的混合液；
S502，在室温下搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到链格孢霉毒素与羧甲基羟胺的缩合物。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于链格孢霉毒素的检测试纸，其特征在于，所述用于链格孢霉毒素的检测试纸设置有：
试纸、微孔条、微孔试剂和微孔塞；
所述试纸包括底板、反应膜、样品吸收垫和吸水垫；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；
所述反应膜上由始端至末端具有T线和C线，所述T线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T线上包被链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与链格孢霉毒素特异性抗体结合的抗抗体；
所述微孔条上具有微孔塞；所述微孔试剂为冻干的链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物；所述微孔试剂位于所述微孔条上。
2.一种如权利要求1所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法包括：
步骤一，制备链格孢霉毒素单抗，并进行纯化；进行胶体金溶液的制备；并制备链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物；取制备的胶体金溶液120ml，用摩尔浓度为0.5mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至7.8；
步骤二，将纯化后的链格孢霉毒素单抗1.8mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置一段时间；逐滴加入质量浓度为15％的无菌牛血清蛋白8ml，搅拌一段时间，静置过夜；
步骤三，将标记后的胶体金溶液离心，弃上清液，向沉淀中加入摩尔浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液2ml重悬，得到链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物；
步骤四，制备冻干有链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂的微孔条；制备包被所述链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物的检测线和包被抗抗体的质控线的反应膜；
步骤五，将制备好的反应膜与样品吸收垫、保护膜、吸水垫、底板组装成试纸；将制备好的冻干有链格孢霉毒素特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂的微孔条、微孔塞和试纸组装成试纸条。
3.如权利要求2所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述制备链格孢霉毒素单抗，并进行纯化包括：
(1)制备链格孢霉毒素人工抗原；基于制备的链格孢霉毒素人工抗原通过动物免疫和杂交瘤技术获得链格孢霉毒素单克隆抗体；
(2)取腹水4℃下12000r/min离心15min，去除杂质；取腹水：醋酸盐缓冲溶液按体积比1:2混合，室温搅拌下加入正辛酸，调整pH到4.8；室温搅拌混合30min，4℃静置2h，充分沉淀；
(3)4℃下12000r/min离心15min，弃沉淀；上清经砂芯漏斗过滤后，加入1/10体积的0.1mol/LpH 7.4的PBS，用2mol/LNaOH调pH值至7.4；
(4)冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸按，45％饱和度；4℃静置1h以上；4℃下10000r/min离心30min，弃上清；
(5)沉淀用适量pH 7.4PBS溶解，于5L的0.01mol/L,pH 7.4的PBS中4℃透析三天，每天换三次液；透析完毕后分装，即可。
4.如权利要求3所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述制备链格孢霉毒素人工抗原包括：
1)称取半抗原0.1mmoL溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺即DMF溶剂中，搅拌加入0.0512g的0.2mmoL的DCC和0.023g的0.2mmoL的NHS，4℃下搅拌反应过夜，离心后上清液为记为A液；
2)称取载体蛋白0.02g溶于2mL浓度为0.1mol/L的pH值8.0的PBS中，充分溶解后标记为B液；
3)磁力搅拌下，将A液慢慢的逐渐滴入B液中，4℃下反应12h；反应完后离心去上清液，即得到偶联载体蛋白的完全抗原溶液；
4)4℃下用PBS溶液透析2天，每天更换3次透析液，得到的人工抗原。
5.如权利要求4所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，每毫升腹水加入33μl正辛酸。
6.如权利要求2所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述进行胶体金溶液的制备包括：
取质量浓度为0.01-0.015％的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为1.5％的柠檬酸三钠水溶液1.5ml，继续搅拌加热20h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有胶体金颗粒的胶体金溶液。
7.如权利要求2所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，所述制备链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物包括：
利用链格孢霉毒素半抗原与载体蛋白偶联得到链格孢霉毒素-载体蛋白偶联物。
8.如权利要求7所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，所述链格孢霉毒素半抗原制备方法包括：
取链格孢霉毒素1.g、羧甲基羟胺0.6g和吡啶2ml于20ml DMSO中的混合液，在室温下搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到链格孢霉毒素与羧甲基羟胺的缩合物。
9.如权利要求2所述用于链格孢霉毒素的检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述离心包括：于16000r/min离心15-20min。
10.一种如权利要求1所述用于链格孢霉毒素的检测试纸在检测链格孢霉毒素残留中的应用。
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