CN105116145B - 一种用单抗金标试验检测百合斑驳病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用单抗金标试验检测百合斑驳病毒的方法，从天然感染LMoV并具有明显斑驳症状的东方百合叶片上提取和纯化天然的LMoV，纯化后的LMoV粒子用来制备单克隆抗体Mab1和Mab2，用胶体金标记第一单克隆抗体Mab1，将其作为失踪标记物，在检测线和对照线与第二单克隆抗体Mab2及羊抗鼠IgG纯化抗体发生特异性结合而显色，根据检测线、对照线显色与否来判定阴阳性结果；该方法无需专门培训，可快速、简便、准确检测百合斑驳病毒。

Description

一种用单抗金标试验检测百合斑驳病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种用单抗金标试验检测百合斑驳病毒的方法，具体是一种将单克隆抗体应用于胶体金免疫层析试验检测百合斑驳病毒的方法。
背景技术
百合斑驳病毒（Lily mottle virus, LMoV）是严重危害百合生产的主要病毒，其在世界范围内广泛分布，特别是在适合其寄主生长的所有温带地区及蚜虫媒介丰富的地区尤为普遍。LMoV侵染百合科植物常造成叶片有斑驳条纹甚至坏死斑，后期发展为花、叶片卷曲畸形，开碎色花，并常伴随植株矮小、花与球茎的减产等。LMoV属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属（Potyvirus），病毒粒子为弯曲线状且呈螺旋对称，大小（650～900）nm ×（11～15）nm。病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，具有potyvirus属成员的典型基因组结构特征，包括一个Poly（A）尾巴，编码一个由3095个氨基酸组成的分子量为351.0 kDa的多聚蛋白。多聚蛋白通过自我剪切后形成外壳蛋白（CP）等10个不同大小的功能蛋白。LMoV CP亚基由274 aa组成，大小为30kDa左右，组装成外壳包裹病毒RNA。
目前关于LMoV的检测研究，虽然有电子显微镜技术、酶联免疫法（ELISA）以及分子生物学技术（RT-PCR、Real-time PCR、基因芯片技术）等的相关报道，但都还停留在研究和实验室阶段，无法满足百合种植现场及田间快速检测的需求，从而无法掌握田间病毒感染的准确信息。此外，包括ELISA和RT-PCR方法在内的传统实验室检测方法都需要专业人员用专门的仪器设备在实验室花很长时间才能完成，其程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，因此使用范围受到很大的局限。
胶体金免疫层析是以硝酸纤维素膜为载体，通过液体的渗移，利用抗原抗体的结合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体。该方法可以避免以上几种检测方法的缺点，以其特异性强、成本低、操作简便、不需任何仪器、适合现场快速检测等优点已被广泛接受，已用于多种植物病毒的检测，包括烟草斑驳病毒、南瓜花叶病毒等。作为一种快速筛查植物病毒的手段，将胶体金免疫层析用于百合病毒的检测，既可节省检测成本，又可用于广大基层单位开展百合病毒的检测和防控工作中，具有重要的经济效益和社会效益。然而，目前虽然已有用胶体金免疫层析法检测LMoV的相关报道，但是其检测的关键步骤-胶体金结合垫和检测线的制备都是依赖LMoV的多克隆抗体来完成的，虽然多克隆抗体制备时间短、成本低，并对所需的技术和技能要求低，但其特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限；而百合种球鳞茎中多糖多酚的含量高，感病种球的病毒含量相对较低，现有的包括胶体金免疫层析法等技术和方法对百合种球鳞茎LMoV检测的特异性和灵敏性均有待提高。
单克隆抗体技术由于其具有特异性强、均质性好、可无限量标准化和大规模生产等优势，已经在人类传染病、动物病毒、激素和生物活性分子检测上广泛应用；此外，单克隆抗体的特异性能使其在混合物中与低浓度抗原高效地结合，对于丰度偏低的蛋白等也更容易检出，因而是公认的抗体“金标准”，若用其检测百合种球鳞茎中的LMoV将是非常理想的选择。但是至今国内外还没有关于LMoV单克隆抗体制备的相关报道，LMoV的单抗也未用于胶体金免疫层析试验。据此，为了进一步提高检测效率，实现对百合种球鳞茎病毒的快速准确检测，可通过一系列优化实验，将单克隆抗体应用于胶体金免疫层析试验，研制能快速检测LMoV的单抗金标卡，满足百合大规模脱毒及商业和田间对种球鳞茎病毒快速检测的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供一种快速、准确、简便地用单克隆抗体检测LMoV的方法，利用天然LMoV的第一单克隆抗体Mab1来捕获LMoV，天然LMoV的第二单克隆抗体Mab2与所捕获的LMoV特异性结合，胶体金作为失踪标记物，通过夹心法的胶体金免疫层析方法进行检测。本方法对百合叶片，尤其是对种球鳞茎LMoV检测的准确率高，特异性强，重复性好，可标准化生产，无需任何仪器和设备。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明先从感染LMoV并具有明显斑驳症状的东方百合叶片上提取和纯化天然的LMoV，用纯化后的LMoV粒子制备2个单克隆抗体Mab1和Mab2，用胶体金标记第一单克隆抗体Mab1，将其作为失踪标记物，在检测线（由第二单克隆抗体Mab2制成）、对照线（羊抗鼠IgG纯化抗体）与相应的抗原抗体发生特异性结合而显色，根据检测线、对照线显色与否来判定阴阳性结果。
本发明的技术方案如下：
①收集自然感病的东方百合叶片，经RT-PCR验证为LMoV单一感染，纯化天然的LMoV，纯化产物经2%磷钨酸（pH 6.7）负染色后置日本JEOL公司的JEM-1230透射电镜下观察粒子形态，并经RT-PCR和Western blotting 鉴定。
②将步骤①纯化的天然LMoV抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫8周龄BALB/C小鼠，每只0.3 mL；三周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量进行再次免疫；三周后，用不加佐剂的抗原0.3 mL进行第三次加强免疫，于免疫5天后用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测效价，效价达到1:10000以上时采用杂交瘤技术进行细胞融合，用间接ELISA筛选2个阳性细胞孔，采用有限稀释法分别对2个阳性孔进行连续克隆，然后扩大培养以制备腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水，获得2个纯化的抗天然LMoV的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体，分别命名为Mab1和Mab2。
③运用1%的柠檬酸三钠还原法制备30nm的胶体金。确定标记的单克隆抗体蛋白的最适稳定量和最适pH，然后用制备好的30nm的胶体金来标记LMoV的单克隆抗体Mab1。
④将标记好的LMoV的第一单克隆抗体Mab1喷涂到玻璃纤维素膜上，制成单抗金标垫，再将LMoV的第二单克隆抗体Mab2喷涂到检测线，羊抗鼠IgG纯化抗体喷涂到对照线，然后组装好试纸条，固定于金标卡的下壳体中，最后连接金标卡的上壳体与下壳体，37℃烘箱干燥，在4℃保存备用。
⑤待检百合样品的处理，即待检百合叶片或种球鳞茎组织样品，用病毒提取缓冲液以适当比例研磨后，10000 r/min离心5 min，吸取上清液备用。
⑥将少量百合待检溶液加入到金标卡的加样孔内，由于毛细效应，液体朝检测线和对照线方向渗移，与固定在检测线、对照线上的抗体发生结合被截留而显色，根据反应窗内相应检测线、对照线的显色情况判定阴阳性结果。
本发明步骤①中，所述天然LMoV粒子的纯化，是由0.05 mol/L的Tris-HCl提取的，pH为7.4，缓冲液中还含有0.01 mol/L EDTA.Na2、0.01 mol/L MgSO4、0.1 mol/L NaCl、0.1% （w/v）PVPP和0.1% （w/v）β-巯基乙醇 。
本发明步骤③中，所述胶体金颗粒的制备，具体为：先将100mL的0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，一次性迅速加入1.4 mL的1% 柠檬酸三钠水溶液，继续加热至溶液由淡黄色转变为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积（100mL），制备得到30nm的胶体金溶液。
本发明步骤③中，所述用制备好的30nm的胶体金来标记单克隆抗体，具体为：标记前用0.1 mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH为 9.0，于100mL金溶液中缓慢加入1.5 mL 1mg/mL的第一单克隆抗体Mab1，通过磁力搅拌震荡1h使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的单抗和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，将沉淀缓慢悬浮于一定体积的缓冲液中，继续离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，反复3次，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单抗结合物，最后将沉淀溶于原体积的1/10同一缓冲液中备用。
本发明步骤中⑥中，若待检溶液中含有LMoV，当检测液进入样品垫后，由于毛细效应往检测线方向移动，LMoV与金标垫上的金标第一单克隆抗体（Au-Mab1）形成Au-Mab1-LMoV二联复合物，复合物在硝酸纤维素膜上继续层析泳动，与检测线（T线）上的第二单克隆抗体Mab2结合形成Au-Mab1-LMoV-Mab2三联复合物，并被固定在T线的第二单克隆抗体截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的Au-Mab1-LMoV复合物由于层析作用，继续往对照线方向迁移，与固定在对照线（C线）上的羊抗鼠IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阳性结果是在检测线和对照线上均呈现棕红色的条带。
本发明步骤中⑥中，若待检溶液中不含LMoV，固定于金标垫上的金标第一单克隆抗体Au-Mab1因毛细效应随待测溶液向检测线方向移动，则不能与检测线（T线）上的第二单克隆抗体Mab2结合，因此也不能截留金标第一单克隆抗体Au-Mab1，Au-Mab1继续层析往对照线方向移动，与固定在对照线（C线）上的羊抗鼠IgG纯化抗体结合形成二联复合物而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阴性结果只在对照线上形成棕红色条带。
本发明是鉴于待检样品中若有LMoV，由于毛细效应向检测线方向移动，样品液中的LMoV与金标第一单克隆抗体Mab1形成复合物，与检测线上的第二单克隆抗体Mab2结合形成三联复合物被截留，胶体金沉积在检测线显色来判定百合样品中有LMoV；相应地待检样品若没有LMoV，检测线则不显色，由此判定检测样品中没有LMoV。用纯化的天然LMoV粒子作为免疫原制备单克隆抗体，通过胶体金标记物的层析移动是否在检测线显色，来判定百合样品中是否感染了LMoV。
本发明检测针对性强，操作简便，快速，结果直观、准确性高，灵敏性强，容易判定，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，可以满足现场及田间检测的需要，尤其适合对百合种球鳞茎LMoV进行快速准确的检测，从而从种源上严格控制LMoV对百合产业的危害，减少经济损失，因而本发明非常适合百合生产的企业、公司以及百合种植的农户使用。
附图说明
图1为本发明实施例单抗金标卡的平面结构示意图。
图2为本发明实施例单抗金标卡的内部结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实例首先从天然感染LMoV并已呈现斑驳症状的东方百合叶片中提纯天然的LMoV粒子，将天然LMoV作为免疫原免疫BALB/C小鼠制备并筛选及纯化2个单克隆抗体Mab1和Mab2；用1%的柠檬酸三钠还原法制备30nm的胶体金，用此胶体金标记纯化的第一单克隆抗体Mab1并制备成金标垫；再将第二单克隆抗体Mab2和羊抗鼠IgG纯化抗体喷涂检测线（T线）和对照线（C线），然后组装好试纸条，固定于金标卡内，置37℃烘箱干燥，在4℃保存备用；检测时，将少量百合待检溶液加入到金标卡的加样孔内，5分钟左右在金标卡的反应窗内观察结果。
实施例
1、天然LMoV抗原的制备
收集于甘肃兰州天然感染LMoV并已呈现斑驳症状的东方百合叶片，经RT-PCR验证为LMoV单一感染，参照陈剑平等的方法略作修改，以0.05 mol/L的Tris-HCl（ pH 7.4，含0.01 mol/L EDTA.Na2、0.01 mol/L MgSO4、0.1 mol/L NaCl、0.1% （w/v）PVPP和0.1% （w/v）β-巯基乙醇 ）为缓冲液提取LMoV。纯化的病毒经2%磷钨酸（pH 6.7）负染色后置日本JEOL公司的JEM-1230透射电镜下观察粒子形态；并经RT-PCR和Western blotting 验证为LMoV。
2、单克隆抗体的制备
将纯化的天然LMoV抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫8周龄BALB/C小鼠，每只0.3 mL；三周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量进行再次免疫；三周后，用不加佐剂的抗原0.3 mL进行第三次加强免疫，于免疫5天后用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测效价，效价达到1:10000以上时采用杂交瘤技术进行细胞融合，用间接ELISA筛选2个阳性细胞孔，采用有限稀释法分别对2个阳性孔进行连续克隆，然后扩大培养以制备腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水，获得2个纯化的抗天然LMoV的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体，分别命名为Mab1和Mab2。
3、胶体金的制备
先将100mL的0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，一次性迅速加入1.4 mL的1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热至溶液由淡黄色转变为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，最会加三蒸水至100mL，即得到30nm的胶体金溶液。制备的胶体金溶液用透射电镜镜检，确保金颗粒大小一致、均匀，颗粒直径在30nm左右，否则重新制备。
4、第一单克隆抗体Mab1的标记
标记前先用0.1 mol/L K2CO3调节上述30nm胶体金溶液的pH为9.0，于100mL金溶液中缓慢加入1.5 mL 1 mg/mL的第一单克隆抗体Mab1，磁力搅拌器缓慢搅拌1h使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的单抗和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，将沉淀缓慢悬浮于一定体积的缓冲液中，继续离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，反复3次，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单抗结合物，最后将沉淀溶于原体积的1/10同一缓冲液中备用。
5、单抗金标卡的组装
将标记好的第一单克隆抗体Mab1喷涂到玻璃纤维素膜上，制成单抗金标垫，再在硝酸纤维素膜上喷涂天然LMoV的第二单克隆抗体Mab 2 到检测线（T线）、羊抗鼠IgG纯化抗体到对照线（C线），然后组装好试纸条，再将试纸条固定于金标卡的下壳体中，最后连接金标卡的上壳体与下壳体，37℃烘箱干燥，在4℃保存备用。试纸条的组装顺序如图2，由左至右的顺序为10为聚氯乙烯衬板、6为样品垫、7为单抗胶体金结合垫、8为硝酸纤维素、4为检测线、5为对照线、9为吸水滤纸；而金标卡的平面结构如图1所示，金标卡1由上壳体和下壳体组成，其中上壳体设有加样孔2和反应窗3，样品垫6置于加样孔2下方，硝酸纤维素膜8置于反应窗3下方。
6、待检百合样品的处理
将待检百合叶片或种球鳞茎等组织样品，用上述步骤1中的病毒提取缓冲液以适当比例研磨后，10000 r/min离心5 min，吸取上清液备用。
7、单抗金标卡的使用及结果判定
把待检溶液加入到金标卡的加样孔内，若待检溶液中含有LMoV，当检测液进入样品垫后，由于毛细效应往检测线方向移动，LMoV与金标垫上的金标第一单克隆抗体（Au-Mab1）形成Au-Mab1-LMoV二联复合物，复合物在硝酸纤维素膜（NC膜）上继续层析泳动，与检测线（T线）上的第二单克隆抗体Mab2结合形成Au-Mab1-LMoV-Mab2三联复合物，并被固定在T线上的单克隆抗体截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的Au-Mab1-LMoV复合物由于层析作用，继续往对照线方向迁移，与固定在对照线（C线）上的羊抗鼠IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阳性结果是在检测线和对照线上均呈现棕红色的条带。
若待检溶液中不含LMoV，固定于金标垫上的金标第一单克隆抗体Au-Mab1因毛细效应随待测溶液往检测线方向移动，则不能与检测线（T线）上的第二单克隆抗体Mab2结合，因此也不能截留金标第一单克隆抗体Au-Mab1，Au-Mab1继续层析往对照线方向移动，与固定在对照线（C线）上的羊抗鼠IgG纯化抗体结合形成二联复合物而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阴性结果只在对照线上形成棕红色条带。
上述实施例可以看出，本发明可直接对百合叶片，尤其对种球鳞茎的LMoV进行快速检测，一般人员不需专门培训即可操作，5分钟左右就可出结果，从而达到快速、简便、准确检测该病毒的目的。

Claims (1)

1.一种用单抗金标试验检测百合斑驳病毒的方法，其特征在于按以下步骤进行：
①天然LMoV抗原的制备：收集感染LMoV并已呈现斑驳症状的东方百合叶片，经RT-PCR验证为LMoV单一感染，以0.05 mol/L的Tris-HCl为缓冲液提取LMoV；纯化的病毒经2%磷钨酸负染色后置JEM-1230透射电镜下观察粒子形态；并经RT-PCR和Western blotting 验证为LMoV；其中所述缓冲液Tris-HCl的pH值为 7.4，缓冲液Tris-HCl包括0.01mol/L EDTA.Na2、0.01mol/L MgSO4、0.1mol/L NaCl、0.1% （w/v）PVPP和0.1% （w/v）β-巯基乙醇；所述2%磷钨酸的pH 值为6.7；
②单克隆抗体的制备：将纯化的天然LMoV抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫8周龄BALB/C小鼠，每只0.3 mL；三周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量进行再次免疫；三周后，用不加佐剂的抗原0.3 mL进行第三次加强免疫，于免疫5天后用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测效价，效价达到1:10000以上时采用杂交瘤技术进行细胞融合，用间接ELISA筛选2个阳性细胞孔，采用有限稀释法分别对2个阳性细胞孔进行连续克隆，然后扩大培养以制备腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水，获得2个纯化的抗天然LMoV的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体，分别命名为Mab1和Mab2；
③胶体金的制备: 先将100mL的0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，一次性迅速加入1.4 mL的1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热至溶液由淡黄色转变为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，最会加三蒸水至100mL，即得到30nm的胶体金溶液；制备的胶体金溶液用透射电镜镜检，确保胶体金颗粒大小一致、均匀，颗粒直径在30nm左右，否则重新制备；
④第一单克隆抗体Mab1的标记：标记前先用0.1 mol/L K2CO3调节上述30nm胶体金溶液的pH为9.0，于100mL胶体金溶液中缓慢加入1.5mL 1 mg/mL的第一单克隆抗体Mab1，磁力搅拌器缓慢搅拌1h使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的单抗和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，将沉淀缓慢悬浮于一定体积的缓冲液中，继续离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，反复3次，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-单抗结合物，最后将沉淀溶于原体积的1/10同一缓冲液中备用；
⑤单抗金标卡的组装：将标记好的第一单克隆抗体Mab1喷涂到玻璃纤维膜上，制成单抗金标垫，再在硝酸纤维素膜上喷涂天然LMoV的第二单克隆抗体Mab 2 到检测线（T线）、羊抗鼠IgG纯化抗体到对照线（C线），然后将样品垫、单抗金标垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，组装好试纸条，再将试纸条固定于金标卡的下壳体中，最后连接金标卡的上壳体与下壳体，就得到能快速检测LMoV的单抗金标卡；其中上壳体设有加样孔和反应窗，样品垫置于加样孔下方，硝酸纤维素膜置于反应窗下方；
⑥待检百合样品的处理：即待检百合叶片或种球鳞茎组织样品，用上述步骤①中的病毒提取缓冲液以适当比例研磨后，10000 r/min离心5 min，吸取上清液备用；
⑦单抗金标卡的使用及结果判定：把上述待检百合样品溶液加入到金标卡的加样孔内，若待检溶液中含有LMoV，当检测液进入样品垫后，由于毛细效应往检测线方向移动，LMoV与金标垫上的金标第一单克隆抗体（Au-Mab1）形成Au-Mab1-LMoV二联复合物，复合物在硝酸纤维素膜（NC膜）上继续层析泳动，与检测线（T线）上的第二单克隆抗体Mab2结合形成Au-Mab1-LMoV-Mab2三联复合物，并被固定在检测线（T线）上的第二单克隆抗体截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的Au-Mab1-LMoV复合物由于层析作用，继续往对照线方向迁移，与固定在对照线（C线）上的羊抗鼠IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阳性结果是在检测线（T线）和对照线（C线）上均呈现棕红色的条带；若待检溶液中不含LMoV，固定于金标垫上的金标第一单克隆抗体Au-Mab1因毛细效应随待测溶液往检测线方向移动，则不能与检测线（T线）上的第二单克隆抗体Mab2结合，因此也不能截留金标第一单克隆抗体Au-Mab1，Au-Mab1继续层析往对照线方向移动，与固定在对照线（C线）上的羊抗鼠IgG纯化抗体结合形成二联复合物而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阴性结果只在对照线上形成棕红色条带。
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