CN110940690A - 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法 - Google Patents
一种黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，包括取样、切丝固定、负染色、电镜观察等步骤。整个过程仅用时十几分钟，具有快速、准确、高效等特点。
Description
技术领域
本发明属于植物保护领域，进一步属于植物病毒的鉴定与检测，具体涉及一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法。
背景技术
黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员，是葫芦科等作物的重要病毒病原之一。CGMMV主要种子带毒传播，也可通过机械磨擦接触传播，以及土壤中的病残体传播。自然寄主主要有葫芦科等11属植物。CGMMV在德国、巴西、伊朗、印度、日本、韩国以及中国葫芦科作物产区广泛发生分布。CGMMV侵染的植物出现绿色斑驳、花叶黄化、果实空心等症状，通过种子远距离传播，已成为葫芦科作物生产中的重要病害病原。CGMMV是单分基因组正义RNA病毒，由2个病毒基因组和3个亚基因组编码6个蛋白，其中17.5kDa为外壳蛋白，30kDa为运动蛋白。CGMMV病毒粒体为杆状，直径平均为18 nm，长度平均为300 nm 。
CGMMV在葫芦科作物生产上以蚜虫和机械磨擦接触传播为主，带毒果实与种子造成远距离传播，导致病害发生日益严重，发生范围不断扩大。葫芦科作物生产上CGMMV的防控方法主要是检测筛选应用无病毒种子种苗，检测方法以酶联免疫吸附试验（ELISA）为主，通过制备CGMMV外壳蛋白抗体进行间接检测，灵敏度较低且需要样品量较大。同时也应用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）检测，通过设计外壳蛋白基因引物，从病组织提取RNA为模版进行扩增，灵敏度较高，但是成本较高且耗时较长，而且是间接检测方法。间接检测方法如ELISA的优势是成本低，可用于大量样品检测，其局限是可能会出现假阳性反应（或非特异性反应）的问题。常规电子显微镜检测以病组织研磨制样或通过化学沉淀差速离心进行负染色制样，容易破坏病毒粒体结构及难以反映其原位分布或聚集特征，观察结果不易判断。
为此，本发明改进了现有的透射电镜的样品制备方法，提供了一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）取1mm×2mm×6mm大小的感病组织；
（2）将所述感病组织用徒手切片法切成细丝；
（3）加入固定液固定2~3min；
（4）将覆盖有Formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；
（5）将染液滴于疏水膜上，再将所述铜网面朝下置于染液染色1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；
（6）透射电镜上样、观察和拍照；
（7）根据病毒粒体的分布与聚集特征进行判断。
附图说明
图1 CGMMV完整的单个病毒粒体散布与聚集；
图A中，病毒粒体散布（黑箭头），束状聚集（宽箭头）；图B中，病毒粒体散布（黑箭头）与放射状聚集（宽箭头）。
图2 CGMMV病毒粒体散布（A）与交叉聚集（B）；
图中，有宽（白箭头）、窄（黑箭头）2种组分。
图3 CGMMV病毒粒体变形；
图A中，粗短杆状粒体（单箭头），25nm×50～200nm，中等长杆状粒体（双箭头），18nm×350～575nm；图B中，粗短杆状粒体（单箭头），25～60nm×200～350nm，细杆状粒体（双箭头），12nm×150～350nm，分布大量囊泡（Ve）。
图4 CGMMV病毒粒体交叉聚集与堆积；
图A中，交叉聚集（黑箭头），纵向排列堆积（宽白箭头）；图B中，交叉聚集（黑箭头）；大量粒体堆积（宽白箭头）。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤。
（1）取1mm×2mm×6mm大小的感病组织；所述感病组织可以为叶、茎或块茎。
（2）将所述感病组织用徒手切片法切成细丝；细丝的直径约为0.01~0.03mm。
（3） 加入固定液固定2~3min，使得原生质体中的病毒粒体或其聚集体自然浸出。作为本发明的一种优选，所述固定液为2.5%戊二醛，用量为0.2 mL。
（4）将覆盖有Formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min。作为本发明的一种优选，吸附样品浸出液的时间为2 min。
（5）将染液滴于疏水膜上，再将所述铜网面朝下置于染液染色1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min。作为本发明的一种优选，所述染液为2%钼酸铵染液，用量为0.1 mL，染色时间2 min。
（6）透射电镜上样、观察和拍照。作为本发明的一种优选，所述透射电镜的参数设置为：
（a）加速电压：60～80 kV；
（b）放大倍数: 20,000～50,000倍。
（7）根据病毒粒体的分布与聚集特征进行判断。所述CGMMV病毒粒体在寄主组织细胞中的分布与聚集特征包括以下几个方面：
（a）个体特征：杆状，直径粗细不均，直径13～18 nm，长度350～575nm，散布或规则排列；
（b）聚集特征：呈集块状交叉聚集和束状、少部分交叉聚集；
（c）CGMMV病毒粒体变形包括3种类型：粗短杆状，25～60nm×50～350nm；中等长杆状，18nm×350～575nm；细杆状，12nm×150～350nm，伴随分布大量囊泡；
（d）分布特征：CGMMV病毒粒体交叉聚集与束状堆积和不规则堆积；
该方法对西瓜、南瓜、小西葫芦花叶病样品的快速检测，与ELISA及RT-PCR检测结果符合率达到95%以上。
本发明通过处理新鲜病组织，直接裂解细胞原生质体，使完整病毒粒体或其聚集体游离出并快速固定，通过负染色制样与电镜观察统计分析，建立了CGMMV原位分布与聚集特征的电子显微镜快速精准检测方法，整个过程仅用时十几分钟，具有直观、快速、精准的特点，所需样品量少，可应用于种子种苗的检测筛选。该检测方法与ELISA及RT-PCR检测结果比较，符合率达到95%以上，检测结果可靠。
本发明可高效应用于无病毒种子种苗的检测筛选，从源头保障种子种苗的质量，对生产中的病植株进行适时监测。对大田生产的葫芦科作物植株疑似病样实现快速精准诊断，有利于采取针对性强的绿色防控措施的制定和实施，保障葫芦科作物生产的产量和品质。还可以对ELISA检测结果进行复测验证，提高检测结果的可靠性。
下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。
实施例1：原位分离固定负染色电子显微镜诊断。
取感染CGMMV的西瓜染病叶片，切取1mm×2mm×6mm大小。将所取样品置于消毒载玻片上，用消毒刀片将样品切成直径约为0.01~0.03 mm的细丝。
应用移液枪吸取0.2 mL 2.5%戊二醛固定液（0.2 mol/L PBS，pH7.2配制）滴于样品上。将覆盖有Formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液3 min。用专用镊子取铜网，滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min。移液枪吸取0.1 mL 2%钼酸铵染液（pH6.4）（0.2 mol/L PBS ，pH7.2配制）滴于疏水膜上，将吸附样品的铜网膜面朝下置于染液上2min，用专用镊子取铜网，滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min。
将上述制备样品的铜网放入透射电子显微镜样品杆，插入样品杆，设备处于观察调试状态。设置透射电子显微镜观察参数为：
（1）加速电压：60～80 kv；
（2）放大倍数: 20,000～50,000倍。
电镜观察染病西瓜叶片30个样品，每个样品观察30个有效视野（有病毒粒体分布的视野）下的病毒粒体分布与聚集特征，进行拍照与文字描述记录。
观测结果如下：
（1）如图1所示：完整的单个CGMMV病毒粒体呈杆状，90%以上的粒体直径18 nm，平均长度为300 nm，散布、束状和放射状聚集；
（2）如图2所示：多个CGMMV病毒粒体散布或交叉聚集，病毒粒体分为宽窄2种组分，宽组分直径为18 nm，窄组分直径为12 nm，长度均为300 nm左右；
（3）如图3所示：CGMMV病毒粒体变形存在3种类型：粗短杆状，25～60nm×50～350nm；中等长杆状，18nm×350～575nm；细杆状，12nm×150～350nm，伴随分布大量囊泡；
（4）如图4所示：CGMMV病毒粒体交叉聚集与束状堆积和不规则堆积；
该观察结果与CGMMV的原位分布与聚集特征相符合，鉴定该病毒为CGMMV。
实施例2： DAS-ELISA检测验证。
（1）主要试剂与材料。
（a）包被抗体：CGMMV外壳蛋白多克隆抗体和单克隆抗体，4℃保存、备用。
（b）酶标抗体：4℃保存，备用。
（c）包被缓冲液：
溶解于1000mL双蒸水中，调pH值为9.6。
（d）洗液PBST :
溶解于1000mL双蒸水中，加入0.5% Tween20。
（e）病毒抽提缓冲液：
溶解于1000mL PBST中，调pH值为7.4。
（f）封闭缓冲液：PBST中加入5%的脱脂奶粉，溶解（即用即配）。
（g）底物缓冲液：10% 乙二醇胺（pH9.8），底物为硝基苯磷酸盐（p-NPP）。
（h）阴性对照：经电子显微镜、ELISA、RT-PCR检测无病毒的脱毒马铃薯组培苗作为阴性对照。
（i）阳性对照：经电子显微镜、ELISA、RT-PCR检测含有PVX的铃薯组培苗作为阳性对照。
（j）空白对照：仅加病毒抽提缓冲液作为空白对照。
（k）待测样品：取上述经电子显微镜制样观察的样品（阴性、阳性对照同样处理）1g，加入病毒抽提缓冲液（约5~10倍，重量体积比）研磨样品，作为待测样品。
（2）CGMMV的DAS-ELISA操作步骤。
（a）包被抗体加入酶标板（包被缓冲液稀释），每孔加入100 µL，37℃下放置2 h。
（b）PBST洗板6次，快速3次，慢速3次（3 min/次），拍干。
（c）将待测样品（包括阴性、阳性、空白对照）每孔100 µL加入酶标板，37℃下放置2h。
（d）同上洗板。
（e）每孔加入200 µL封闭缓冲液，37℃下放置30 min。
（f）抛弃孔中液体，拍干。
（g）酶标抗体（PBST稀释），加入酶标板，每孔加入100 µL, 37℃下放置2 h。
（h）同上洗板。
（i） 用底物缓冲液溶解底物（1 mg/mL），加入酶标板，每孔100 µL，室温（25℃）下至充分显色（每孔加入50 µL 1N NaOH终止显色）。肉眼判别或酶标仪读数。
（3）阴阳性判别。
目测待测样品颜色反应与阴性和空白对照颜色反应深浅对比，较深则为阳性，较浅则为阴性，同时观察阳性样品的颜色反应并与待测样品比较。
应用酶标仪进行检测结果判别，根据酶标仪在405 nm波长下酶标板每孔的OD数值，待测样品OD值与阴性对照OD值之比大于等于2.0时，待测样品为阳性，否则为阴性。
对实施例1的30个样品进行检测DAS-ELISA，待测样品与CGMMV外壳蛋白多克隆抗体和单克隆抗体DAS-ELISA检测均呈阳性反应，说明感染病毒染病南瓜的确为CGMMV病毒。
实施例3：RT-PCR检测验证。
（1）应用TRIOZL法提取RNA：
（a）取待测样品（包括阳性对照和阴性对照样品）1 g，样品加入液氮充分研磨至粉末状（研钵要进行灭菌，提前预冷），转移到1.5 mL离心管中（离心管需预先用液氮冷冻，防止RNA降解）；
（b）向装有样品的离心管中加入1 mL的TRIOZL，混匀5 min，让样品充分溶解；
（c）加入200 µL氯仿，充分混匀，4℃冷冻离心机中12000 rpm 离心15 min；
（d）转移上清于新的离心管，加入等体积的异丙醇混匀后静置15 min，4℃冷冻离心机中12000 rpm 离心10 min，弃上清；
（e）加入1 mL 70％的酒精，混匀，4℃冷冻离心机中12000 rpm 离心5 min，重复此操作1次；
（f）将离心管底部留有的沉淀于通风厨中干燥10 min后保存于-80℃冰箱。
（2）RT-PCR。
（a）引物：（目的片段大小为650 bp）：
CGMMV-F：5′-CGTGGTAAGCGGCATTC TAAACC TC-3′；
CGMMV-R：5′-CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3′。
（3）反应体系。
（a）逆转录。
（b）PCR体系（50µL）。
（c）反应条件: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35 cycles；72℃ 10 min。
（d）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
对实施例1中的30个染病样品进行RT-PCR。结果表明：与标准分子量相比较，样品和阳性对照条带的分子量大小均为650 bp左右，即为阳性。待测样品与阳性对照与预期结果相符，通过RT-PCR检测验证。
由此可见，本发明所述的黄瓜绿斑驳病毒的原位分离固定负染色电子显微镜诊断方法诊断准确率高，成本较低，大大缩短了检测时间。
Claims (9)
1.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取1mm×2mm×6mm大小的感病组织；
（2）将所述感病组织用徒手切片法切成细丝；
（3） 加入固定液固定2~3min；
（4）将覆盖有Formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；
（5）将染液滴于疏水膜上，再将所述铜网面朝下置于染液染色1~3 min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1 min；
（6）透射电镜上样、观察和拍照；
（7）根据病毒粒体的分布与聚集特征进行判断。
2.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，所述感病组织为叶片、茎或果实。
3.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，步骤（2）所述细丝直径为0.01~0.03 mm。
4.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，所述固定液为2.5%戊二醛，用量为0.2 mL。
5.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，步骤（4）吸附样品浸出液的时间为2 min。
6.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，所述染液为2%钼酸铵染液，用量为0.1mL。
7.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，步骤（5）所述染色时间为2 min。
8.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，所述透射电镜的参数设置为：
（1）加速电压：60～80 kV；
（2）放大倍数: 20,000～50,000倍。
9.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，其特征在于，步骤（7）所述病毒粒体的分布与聚集特征为：
（1）个体特征：杆状，直径粗细不均，直径13～18 nm，长度350～575nm，散布或规则排列；
（2）聚集特征：呈集块状交叉聚集和束状、少部分交叉聚集；
（3）CGMMV病毒粒体变形包括3种类型：粗短杆状，25～60nm×50～350nm；中等长杆状，18nm×350～575nm；细杆状，12nm×150～350nm，伴随分布大量囊泡；
（4）分布特征：CGMMV病毒粒体交叉聚集与束状堆积和不规则堆积。
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