CN107488714A

CN107488714A - 鉴别节节麦和圆柱山羊草的dna条形码及其应用

Info

Publication number: CN107488714A
Application number: CN201710691028.8A
Authority: CN
Inventors: 姜翠兰; 魏守辉; 黄红娟; 张朝贤; 黄兆峰; 陈景超; 王慧敏; 赵丹丹
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2017-12-19

Abstract

本发明提供一种鉴别节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码及其应用，所述DNA条形码的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑2所示。本发明通过设计一对新的DNA条形码引物，并获得了最优鉴定序列，完善了GenBank数据库中节节麦、圆柱山羊草的DNA条形码序列，仅使用1对引物就能区分节节麦、圆柱山羊草、伞穗山羊草，可对未知的节节麦、圆柱山羊草样本进行快速鉴定。相比于生长后期通过形态特征辨认的方法，既打破了鉴定时期的限制，又大大提高了鉴定效率，同时提高了检测的速度和准确性，有利于指导农业生产机构和农民及时防除这两种麦田恶性杂草，保障小麦生产安全和农民增收，降低对国家粮食安全的威胁，具有良好的经济效益和社会效益。

Description

鉴别节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及生物信息学领域，具体地说，涉及一种鉴别节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码及其应用。

背景技术

我国已将节节麦和圆柱山羊草(具节山羊草)列入禁止进境检疫性有害生物名录。我国检验检疫部门在进口粮谷检疫中经常会截获节节麦和圆柱山羊草，这两种检疫性杂草在植株及种子形态上很相似，很难准确地识别鉴定。

节节麦(Aegilops tauschii Coss.)是世界恶性杂草，起源于东欧、西亚，中东地区，为越年生或1年生草本。是一种进境危险性杂草，我国首先在黄河中部地区和新疆伊犁河两岸发现其分布，随种子贸易的引种调种、大型联合收割机的跨区作业，以及除草剂使用导致的杂草群落演替，节节麦已成为我国冬小麦(Triticum aestivum)种植区危害最严重的恶性杂草之一。近年来，节节麦在河北、山东、山西、河南，重庆，陕西，新疆，内蒙古和江苏等省大面积发生。

圆柱山羊草(Aegilops cylindrica Host)分布于欧洲南部，20世纪早期从俄罗斯南部引种小麦品种“Turkey”时带入美国，现在已遍布于美国300多万公顷的冬小麦地中，在美国俄勒冈东部旱地春小麦种植区，这种草造成了严重的草害。我国检疫部门将其命名为具节山羊草，主要分布于河北省、陕西省、青海省。

节节麦、圆柱山羊草的分蘖、繁殖能力强，适应性强，适生范围广，易传播。能与小麦激烈竞争光、肥、水等资源，还是一些病虫害的越冬寄主，且生产上缺乏成熟有效的防除措施。收获后，节节麦、圆柱山羊草小穗混入小麦谷粒，难清除，降低小麦的质量与品质，严重影响经济贸易。

准确辨认节节麦、圆柱山羊草意义重大。节节麦、圆柱山羊草与小麦亲缘关系近，外部形态极为相似，生长习性也非常接近，特别是生长前期难以辨认。虽然抽穗期可通过形态特征辨认，进行人工拔除，但此时对小麦减产的影响已经形成。杂草的最佳防除时期在3叶期前，而针对3叶期前的辨认，只能靠植物分类专家的仔细甄别，目前在生产上还没有更好的辨认方法。

DNA条形码(DNA barcoding)是运用一个或多个DNA片段进行物种鉴定的技术。该技术鉴定结果准确率高、重复性好，不受环境、物种等因素限制，方法通用性强，为准确、有效地鉴定植物提供了更为方便捷的方法。

自DNA条形码概念提出至今，国内外诸多学者使用DNA条形码对各类植物都做了相关研究，使用合适的DNA条形码或组合可对不同科、属植物进行有效的区分和鉴定，是对形态学分类的一种有效补充。

目前，已有应用DNA条形码技术进行植物鉴定的报道，并形成了一定的规范性文件(高连明等，《关于植物DNA条形码研究技术规范》，植物分类与资源学报2012，34(6):592～606)，如何将DNA条形码技术应用于入侵性杂草节节麦、圆柱山羊草的鉴定中，面临以下突出难题：

问题一，DNA条形码试验材料的来源问题。自DNA条形码提出后，该技术在生物多样性调查和编目、物种鉴定及物种发现等方面已得到广泛应用，事实上，样品采集的数量应最大限度地覆盖物种的整个遗传变异范围，这样的物种参考数据库才能真正代表该物种的遗传多样性，利用DNA条形码鉴定的物种才更可靠。因为来自不同地域和居群的样品(个体)比来自相同地域和居群的多个样品(个体)更能代表物种的遗传多样性，所以用于DNA条形码研究的材料，最好采集来自不同地域和居群的样品，其来源应尽可能地覆盖物种的整个分布区。在我国，节节麦在河北、山东、山西、河南，重庆，陕西，新疆，内蒙古和江苏等省大面积发生，因此，如何获取并整合所有地域的节节麦、圆柱山羊草的DNA条形码序列，是面临的首要问题。

问题二，植物DNA条形码目标基因的选择问题。DNA条形码目标基因的选择，一直是影响物种鉴别可靠性的关键因素。作为DNA条形码鉴定的目标基因，应具备较高的物种间多态性和物种内稳定性，从而在序列比对中表现出较强的物种区分能力。与动物的DNA条形码普遍使用COI基因不同，目前尚未有一种理想的DNA条形码基因或基因组合可区分所有的已知植物。国际生命条形码联盟植物工作组(CBOL Plant Working Group,2009)推荐成熟酶K编码基因(matK)和核酮糖-1，5-二磷酸化/加氧酶大亚基编码基因(rbcL)组合作为陆地植物的核心DNA条形码。此外，在第三届国际生命条形码大会上，提出核基因(ITS)和叶绿体基因间隔区序列(trnH-psbA)可作为植物条形码的辅助条形码。但是，这些基因在用于植物DNA条形码构建时，在对不同种属的鉴定效率、引物设计难度等方面各有利弊，在Genbank等公共数据库中，已有少数节节麦和圆柱山羊草的基因序列资料，但是，选取的DNA条形码目标基因不同，鉴定效率也有很大差距。例如，节节麦、圆柱山羊草的rbcL基因完全一致，鉴定效率为0，无法区分这两种入侵性杂草。因此，构建DNA条形码数据库过程中，DNA条形码目标基因的选择，何种基因或基因组合最为有效，是本发明的关键问题。

问题三，DNA条形码的鉴定准确性问题。由于节节麦与圆柱山羊草亲缘关系近，外部形态极为相似，生长习性也非常接近，难以辨认，因此实验样本的准确鉴定、DNA样本的获取时期和方式极为重要，鉴定准确与否，直接影响结果的可信度。因此，实验样本的准确鉴定，是将该技术应用于节节麦和圆柱山羊草鉴别的难题之一。另外现有的GenBank数据库中，节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码序列极少，节节麦trnH-psbA条形码序列仅有1条，未见圆柱山羊草的该序列报道及上传。

问题四，DNA条形码序列的数据分析问题。在获得目标基因序列后，经过序列的编辑、比对、质量与矩阵核查后，进行数据分析。一般有3种不同的生物信息学分析方法，分别是基于频率的局部比对算法BLAST搜索工具法、基于Kimura-2-parameter(K2P)概率的遗传距离法(distance)和基于聚类分析的系统发生树法(Tree-building)。这三种方法数据处理的原理不同，因而进行判别时的准确性和适用范围都有所差异。因此，要对节节麦和圆柱山羊草这两种亲缘关系极近的植物群体进行准确鉴别，采取何种数据库构建和序列分析方法至关重要，这需要在获取序列信息的基础上，摸索不同参数并验证大量已知样本，从而确保方法的准确度和实用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA条形码鉴别技术，能够快速、准确鉴别节节麦和圆柱山羊草。

为了实现本发明目的，从解决上述四大难点问题出发，首先从DNA条形码试验的样品来源、鉴定入手，选择最佳的DNA条形码目标基因，合并Genbank数据库中已发表的节节麦序列，并首次公开圆柱山羊草序列，同时创新数据库序列来源，并验证其鉴别的准确性。

DNA条形码目标基因的选择：采用核心DNA条形码rbcL、matK，以及辅助条形码ITS(包括ITS2)和trnH-psbA，对实验样本进行PCR扩增和测序，筛选最佳的DNA条形码目标基因或基因组合，分析数据，并设计新的DNA条形码引物，获得最优鉴定序列。

DNA条形码鉴定的准确性验证：1)大样本量验证：整合中国农科院植物保护研究所杂草组收集的节节麦、圆柱山羊草的种子，采集时间为2007年至2016年，包括节节麦27份，圆柱山羊草3份，另外在GenBank中下载同种(节节麦)和近缘种(伞穗山羊草)序列2份。培养箱培养，提取DNA，用新设计的DNA条形码引物进行PCR扩增和测序，通过软件Vector NTI和MEGA6.0分析序列，验证该DNA条形码鉴定的准确性问题。2)特异性验证：以16种禾本科植物为实验材料(节节麦、圆柱山羊草、小麦、雀麦、早熟禾、鹅观草、野燕麦、毒麦、菵草、看麦娘、日本看麦娘、狗尾草、虎尾草、马唐、牛筋草、长芒稗)，提取DNA，PCR扩增、测序和分析，通过序列特异性验证该DNA条形码鉴定的准确性问题。

本发明提供的用于鉴别节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码，节节麦trnH-psbA基因的DNA条形码序列如SEQ ID NO:2所示，圆柱山羊草trnH-psbA基因的DNA条形码序列如SEQID NO:1所示。所述DNA条形码可通过以下方法获得和验证：

①节节麦、圆柱山羊草样本和DNA条形码引物的选择；

②样本基因组DNA的提取；

③DNA条形码基因片段的扩增、检测与测序；

④序列的编辑、比对、质量核查，以及数据整合分析；

⑤DNA条形码最优鉴定引物的设计和序列获得；

⑥大样本量验证新设计引物鉴定的准确性；

⑦新设计引物特异性和灵敏度分析；

⑧田间疑似样本的验证。

本发明还提供用于检测节节麦和圆柱山羊草DNA条形码的特异性PCR引物对：

trnH-619 5′-AATCCACTGCCTTGATCCAC-3′(SEQ ID NO:3)

psbA-619 5′-GCTGTTGAGTTCCATCTATT-3′(SEQ ID NO:4)

本发明还提供含有上述引物对的检测试剂或试剂盒。

本发明进一步提供所述引物对、或所述检测试剂或试剂盒在鉴别节节麦和圆柱山羊草中的应用。

所述应用具体为：

1)提取待测植株样品的DNA；

2)以步骤1)的DNA为模板，利用SEQ ID NO:3-4所示引物对，进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

PCR反应体系为：30ng/μL DNA 1μL，2×TSINGKE Master Mix 15μL，10μmol上、下游引物各1μL，ddH₂O 12μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

步骤3)具体为：使用1％琼脂糖凝胶电泳分离、检测PCR扩增产物，并对PCR扩增产物进行测序，然后采用3种不同的生物信息学分析方法分析测序结果：基于频率的局部比对算法BLAST法、基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的系统发生树法。

本发明具有以下优点：

本发明设计了新的DNA条形码引物，并获得了最优鉴定序列，完善了节节麦、圆柱山羊草的DNA条形码数据库，仅使用1对引物就能区分节节麦、圆柱山羊草、伞穗山羊草，可对未知的节节麦、圆柱山羊草样本进行快速鉴定。相比于生长后期通过形态特征辨认的方法，既打破了鉴定时期的限制，又大大提高了鉴定效率，同时，也提高了检测的速度和准确性，并极大地减少了对鉴定人员经验的依赖性，可广泛适用于具备分子生物学实验室的植物鉴定与研究机构、农业科学院所、农技推广中心等，提升检测机构的技术平台和水平，有利于指导农业生产机构和农民及时防除这两种恶性杂草，减轻对小麦生产的危害，减少经济损失，降低对国家粮食安全的威胁，创造更好的经济效益和社会效益。

本发明首次公开了圆柱山羊草的trnH-psbA条形码序列，完善已有的节节麦trnH-psbA条形码序列，最大限度地增加了节节麦、圆柱山羊草数据库的容量，加之同时使用3种算法进行鉴定，其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的DNA条形码方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中DNA条形码序列测序图谱(A)及序列差异比对图(B)；其中，HE-4、HA-8、SN-23为节节麦；HE-29、HE-30为圆柱山羊草；GB-32为Genbank下载的伞穗山羊草(SEQ ID NO:5)。

图2为本发明实施例2中节节麦和圆柱山羊草的试验样本；其中，小穗(A)，HA-14,HE-3,SD-17,SN-21,SX-26是节节麦小穗，BJ-28是圆柱山羊草小穗；幼苗(B)，3,14,17,21,26,23是节节麦幼苗，28是圆柱山羊草幼苗；花序(C)及田间危害图(D)。

图3为本发明实施例2中部分样本的trnH-psbA(619)条形码基因扩增电泳图。

图4为本发明实施例2中DNA条形码数据的3种生物信息学分析方法截图：基于频率的局部比对算法BLAST法(A)、基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法(B)和基于聚类分析的系统发生树法(C)。其中BLAST法(A)序列为节节麦的trnH-psbA(619)。

图5为本发明实施例3中PCR特异性检测扩增结果，其中，1为节节麦，2为圆柱山羊草，3为小麦，4为雀麦，5为早熟禾，6为鹅观草，7为野燕麦，8为菵草，9为看麦娘，10为日本看麦娘，11为狗尾草，12为毒麦，13为虎尾草，14为马唐，15为牛筋草，16为长芒稗，M为DL2000DNA Marker。

图6为本发明实施例3中PCR特异性检测的序列比对结果，其中，1为节节麦，2为圆柱山羊草，3为小麦，4为雀麦，5为早熟禾，6为鹅观草，7为野燕麦，8为菵草，9为看麦娘，10为日本看麦娘，11为狗尾草，13为虎尾草，14为马唐，15为牛筋草，16为长芒稗。

图7为本发明实施例3中PCR特异性检测的系统发育树(NJ树)结果，图中标注为1-16号实验样本的拉丁文名称。

图8为本发明实施例3中引物trnH-psbA(619)的PCR灵敏度检测结果，其中，1-10分别代表DNA样品经10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹及10¹⁰倍稀释，NC为阴性对照，M为DL2000DNA Marker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1鉴别节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码获得

本发明对国际生命条形码联盟植物工作组(CBOL Plant Working Group,2009)推荐的陆地植物的核心DNA条形码成熟酶K编码基因(matK)和核酮糖-1，5-二磷酸化/加氧酶大亚基编码基因(rbcL)，辅助条形码核基因(ITS)和叶绿体基因间隔区序列(trnH-psbA)均进行了筛选验证，方法如下：

实验材料：

选用节节麦HE-4，HA-8，SN-23，圆柱山羊草HE-29，HE-30作为模板DNA，样本信息见表1，对4个片段(matK、rbcL、trnH-psbA和ITS)的引物进行PCR扩增测序。各片段引物信息见表2。

表1样本来源

注：HE:河北省；HA:河南省；SN:陕西；GB:GenBank

表2条形码片段引物信息

DNA提取：

将实施例1中5份样本的种子，培养箱播种培养，取2-3叶龄时的幼嫩叶片，采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司生产)提取基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳技术及微量紫外分光光度计(NanoDrop1000)检测DNA的纯度和浓度。稀释至其工作浓度30ng/μL。

PCR反应：

PCR反应用30μL体系，其中基因组DNA 1μL，2×TSINGKE Master Mix 15μL，上下游引物各1μL，ddH₂O 12μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，最适退火温度退火30s，72℃延伸相应时间，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

使用1％琼脂糖凝胶电泳分离、检测PCR产物，同时电泳3μL的DL 2000Maker。条带清晰、单一的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司。为保证序列的可靠性，所有片段都进行双向测序。

数据分析：

对5个模板测序获得的4种DNA条形码序列进行分析。利用VectorNTI软件观察序列峰图质量，检查、校对每个碱基，对序列进行剪切拼接，序列测序图谱见图1(A)序列差异比对见图1(B)。图1(A)中可以看出，测序峰明显，重叠峰较少，测序样本纯度高。

通过MEGA6.0软件，计算样本种内和种间的双参数遗传距离(Kimura 2-parameter，K2P)，采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，基于K2P距离模型及自举检验法(Bootstrap method)检验各分支的置信值，测定1000次循环。

实验结果：(见表3)

1、节节麦和圆柱山羊草的rbcL序列一致，片段长度542bp，比对后长度542bp，PCR扩增及测序成功率100％，核苷酸差异数0，种内遗传距离均值0，种间遗传距离均值0。种内、种间差异均为0，无法用于鉴别节节麦与圆柱山羊草；

2、蛋白酶K(matK)片段长度827-898bp，比对后长度920bp，PCR扩增及测序成功率80％。PCR扩增测序结果不理想，经多次PCR检查，SN-23的PCR结果无条带，其他试验材料测序结果也都是Poly结构，同一材料双向测序结果有差异，比对分析结果不理想，故不选用matK鉴别节节麦和圆柱山羊草；

3、核基因(ITS)片段长度788bp，比对后长度788bp，PCR扩增及测序成功率100％，存在8个核苷酸差异位点，种内平均遗传距离0.0007，小于种间平均遗传距离0.0096，可用于节节麦与圆柱山羊草的鉴别，但是因存在种内差异，在鉴定过程中更为复杂，故不是最佳选择；

4、trnH-psbA序列片段长度591-597bp，比对后长度600bp，PCR扩增及测序成功率100％，存在6个信息位点，15个核苷酸差异数，种内遗传距离0，种间平均遗传距离0.0051，即种内无差异，种间有差异，更适用于鉴别节节麦和圆柱山羊草。

表3各片段的PCR扩增和测序成功率及各自的序列信息

在此基础上设计合成条形码引物trnH-psbA(619)：

trnH-619 5′-AATCCACTGCCTTGATCCAC-3′(SEQ ID NO:3)

psbA-619 5′-GCTGTTGAGTTCCATCTATT-3′(SEQ ID NO:4)

该引物序列区段包含trnH-psbA序列中所有差异位点，在节节麦和圆柱山羊草的鉴别中，扩增及测序效率高于国际生命条形码联盟植物工作组推荐的trnH-psbA，可作为目标DNA条形码序列扩增的引物。使用该引物进行PCR扩增测序：

获得的圆柱山羊草trnH-psbA(619)序列，其大小为587bp，序列如SEQ ID NO:1所示；

获得的节节麦trnH-psbA(619)序列，其大小为593bp，序列如SEQID NO:2所示。

实施例2大样本量验证DNA条形码引物trnH-psbA(619)鉴定的准确性

整合中国农科院植物保护研究所杂草组收集的节节麦、圆柱山羊草的种子，采集时间为2007年至2016年，保存在低温种子库中。经过详细的物种特征比对，由杂草形态鉴定专家确定了每份材料的物种名称。包括节节麦(Aegilops tauschii)27份，圆柱山羊草(Aegilops cylindrica)3份，节节麦和圆柱山羊草部分实验材料见图2：小穗(A)、幼苗(B)、花序(C)及田间危害图(D)。另外在GenBank中下载同种(节节麦)和近缘种(伞穗山羊草)序列2份，见表4。

表4鉴定准确性验证的样本来源

注：HE:河北省；HA:河南省；SD:山东省；SN:陕西；JS:江苏省；SX:山西省；XJ:新疆维吾尔自治区；BJ:北京市；GB:GenBank

DNA提取：

将27份节节麦和3份圆柱山羊草样本的种子，培养箱播种培养，取2-3叶龄时的幼嫩叶片，采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司生产)提取基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳技术及微量紫外分光光度计(NanoDrop1000)检测DNA的纯度和浓度，稀释至其工作浓度30ng/μL。

PCR反应：

以上步骤提取的DNA为模板，使用trnH-psbA(619)特异引物(SEQ ID NO:3-4)进行PCR扩增。

PCR反应体系：使用30μL体系，其中基因组DNA 1μL，2×TSINGKE Master Mix 15μL，10μmol上、下游引物各1μL，ddH₂O 12μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40S，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

扩增产物检测：使用1％琼脂糖凝胶电泳分离、检测PCR产物，同时电泳3μL的DL2000Maker，各样本均获得单一明亮的条带，产物大小均为600bp左右，参阅图3扩增电泳图。

目标条带测序：将PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司。为保证序列的可靠性，所有片段均采用双向测序。

数据分析：

序列的编辑、比对、质量核查，以及数据整合：利用Vector NTI软件观察测序结果、峰图质量，校对每个碱基，对序列进行编辑、比对。通过MEGA 6.0软件，计算样本种内和种间的双参数遗传距离(Kimura 2-parameter，K2P)，形成遗传距离矩阵，采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，进行聚类分析。并基于K2P距离模型及自举检验法(Bootstrap method)检验各分支的置信值，测定1000次循环。

实验结果：

(i)使用Vector NTI进行序列比对时，发现不同来源的节节麦序列完全一致，不同圆柱山羊草序列完全一致，将节节麦trnH-psbA(619)序列输入GenBank的BLAST数据库，获得比对结果，与数据库中节节麦序列相同(Query cover 100％，Ident 100％)，检索到与伞穗山羊草的识别率为99％，见图4(A)。将圆柱山羊草trnH-psbA(619)序列输入GenBank的BLAST数据库，数据库中没有检索到相同序列，检索到与伞穗山羊草的识别率为98％，与节节麦的识别率为97％。

(ii)使用MEGA6.0软件计算节节麦、圆柱山羊草、伞穗山羊草的遗传距离时，显示节节麦、圆柱山羊草trnH-psbA(619)序列种内遗传距离为0，节节麦与圆柱山羊草种间遗传距离0.0051，与伞穗山羊草种间遗传距离0.0017，见图4(B)，明确了该序列种内无差异，种间存在差异。

(iii)使用MEGA6.0的NJ树聚类分析时，28个节节麦样本聚为一类，3个圆柱山羊草样本聚为一类，伞穗山羊草单独聚为一类，见图4(C)。进一步证明了trnH-psbA(619)序列种内无差异，种间存在差异，trnH-psbA(619)序列可用于节节麦和圆柱山羊草的鉴别。

实施例3 PCR引物trnH-psbA(619)的特异性和灵敏度分析

样本来源：

本实施例中采用的禾本科植物包括小麦及麦田常见杂草雀麦、早熟禾、鹅观草、野燕麦、毒麦、菵草、看麦娘、日本看麦娘，以及非麦田常见禾本科杂草狗尾草、虎尾草、马唐、牛筋草、长芒稗(表5)。其中，编号1,2为对照。种子及标本保存于中国农业科学院植物保护研究所杂草组标本室；试验用DNA保存于该组超低温冰箱中。

表5用于PCR特异性检测的样本来源

DNA提取：

将用于特异性检测试验的植物种子(编号3-16)，培养箱播种培养，取2-3叶龄时的幼嫩叶片，采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司生产)提取基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳技术及微量紫外分光光度计(NanoDrop1000)检测DNA的纯度和浓度。

样品DNA的梯度稀释：

用微量紫外分光光度计(NanoDrop1000)检测DNA的浓度(编号1,2)，编号1节节麦浓度为133.3ng/ul，编号2圆柱山羊草浓度为112.3ng/ul。将2份DNA样品进行10倍梯度稀释，共稀释10次，最高稀释至10¹⁰倍，于-20℃保存备用。

PCR反应：

反应体系(30μl)：

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃结束程序，保存PCR样品。

实验结果：

取扩增产物5μL，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在凝胶成像系统下检测结果，结果如图5所示，毒麦(编号12)PCR扩增具有双带，不予测序，其他样品送华大基因科技有限公司测序。

测序完成后，利用Vector NTI软件观察序列峰图质量，检查、校对每个碱基，对序列进行剪切拼接。结果见图6，序列比对后，节节麦48位碱基是G，其他试验材料48位碱基均是T；圆柱山羊草477位碱基是A，其他试验材料477位碱基均空缺，在供试材料中节节麦，与圆柱山羊草均存在特异碱基。

通过MEGA6.0软件，计算供试材料种间的双参数遗传距离(Kimura 2-parameter，K2P)。结果见表6，节节麦与圆柱山羊草之间的遗传距离为0.004，其他13份材料与节节麦的遗传距离0.01-0.055，与圆柱山羊草的遗传距离0.01-0.051，均大于节节麦与圆柱山羊草之间的遗传距离。说明节节麦与圆柱山羊草亲缘关系更近，PCR引物trnH-psbA(619)在15份供试材料中存在特异性。证明了PCR引物trnH-psbA(619)在节节麦、圆柱山羊草的鉴定中具有特异性。

表6特异性试验材料间的遗传距离

采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，基于K2P距离模型及自举检验法(Bootstrap method)检验各分支的置信值，测定1000次循环。结果见图7，用于特异性试验的其他13份材料与节节麦、圆柱山羊草均存在差异，上述结果表明引物trnH-psbA(619)的特异性强。

分别以上述10个浓度梯度稀释的DNA样品为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上。扩增产物检测：使用1％琼脂糖凝胶电泳分离、检测PCR产物，同时电泳3μL的空白对照(NC)及DL 2000Maker。结果如图8所示，当稀释至10⁵倍时，条带不明显。因此，在节节麦中该引物对的灵敏度可达13.33ng/ml，在圆柱山羊草中该引物对的灵敏度可达11.23ng/ml，即可检出样品中约13.33pg的节节麦DNA和11.23pg的圆柱山羊草DNA，检测灵敏度很高。

实施例4 trnH-psbA(619)对田间疑似样品的检测验证

样本来源：

本发明旨在对未知的节节麦、圆柱山羊草样本进行快速鉴定。相比于生长后期通过形态特征辨认的方法，即打破鉴定时期的限制，又大大提高鉴定效率。本实施例中共进行了76株疑似节节麦的幼苗的鉴别，分别采自江苏、陕西、山东、北京、河北等省31个乡镇，数量，来源及鉴定结果见表7。

表7疑似样本的来源及鉴定

DNA提取：

选用疑似样品的幼嫩新叶，采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司生产)提取基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳技术及微量紫外分光光度计(NanoDrop1000)检测DNA的纯度和浓度。稀释至其工作浓度30ng/μL。

PCR反应：

反应体系(30μl)：

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，共35个循环；72℃延伸10分钟；4℃结束程序、保存样品。送北京六合华大基因科技有限公司测序。

实验结果：

测序得到trnH-psbA(619)条形码序列，利用Vector NTI软件观察序列峰图质量，检查、校对碱基，剪切拼接序列。通过MEGA 6.0软件，计算样本种内和种间的双参数遗传距离(Kimura 2-parameter，K2P)，采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，进行聚类分析。trnH-psbA(619)DNA条形码鉴定结果显示，76份材料中含有节节麦58株，圆柱山羊草18株，与果穗成熟期鉴定结果一致，鉴定成功率达100％。证明本发明可用于苗期未知的节节麦、圆柱山羊草样品快速鉴定。即提高了检测的速度和准确性，又减少了对鉴定人员经验的依赖性，有利于指导农业生产机构和农民及时防除这两种恶性杂草，减少经济损失。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>鉴别节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码及其应用

<130>KHP171113372.6

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>587

<212>DNA

<213>圆柱山羊草DNA条形码

<400>1

tgatccactt ggctacatcc gccccttatc cagctaaagg atttttttct tttttccatt 60

gatcattatt ctatttattc tgacctccgt acttcgatcg agatattgga catagaatgc120

cactctttaa aaaggaaaaa aaaggagtaa tcagctgtga cacgaaaaaa aacgaatcct180

tttgtagctc atcatttatt ggcaaagata gaaaaggtca atatgaagga ggagaaagaa240

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gcgattcata atggaaagga acatatacct atttacataa caaatcctat ggtaggtcgc360

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caaaaattct tatatgttag cagaaaaacc ttatccatta atagatg587

<210>2

<211>593

<212>DNA

<213>节节麦DNA条形码

<400>2

tgatccactt ggctacatcc gccccttatc cagctaaagg attttttgct tttttccatt 60

gatcattatt ctatttattc tgacctccgt acttcgatcg agatattgga catagaatgc120

cactctttaa aaaggaaaaa aggagtaatc agctgtgaca cgaaaaaaaa cgaatccttt180

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tttcttcaaa aattcttata tgttagcaga aaaaccttat ccattaatag atg 593

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aatccactgc cttgatccac 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gctgttgagt tccatctatt 20

<210>5

<211>595

<212>DNA

<213>伞穗山羊草DNA条形码

<400>5

tgatccactt ggctacatcc gccccttatc cagctaaagg atttttttct tttttccatt 60

gatcattatt ctatttattc tgacctccgt acttcgatcg agatattgga catagaatgc120

cactctttaa aaaggaaaaa aaaaggagta atcagctgtg acacgaaaaa aaacgaatcc180

ttttgtagct catcatttat tggcaaagat agaaaaggtc aatatgaagg aggagaaaga240

aacaatagta acgtggtccc gggcatctag cattctaccc acaatggttg gccatacaat300

cgcgattcat aatggaaagg aacatatacc tatttacata acaaatccta tggtaggtcg360

caaattgggg gaattcgtgc ctactcggca tttcacgagt tatgaaaatg caagaaagga420

tactaaatct cgtcgttaac tgaattctga atagaaagat taagaagaaa aaaaagattc480

aaaataaaga cagaaatacc caatatcttg ctagaacaag atattgggta tttctgtctt540

ttctttcttc aaaaattctt atatgttagc agaaaaacct tatccataat agatg 595

Claims

1.鉴别节节麦和圆柱山羊草的DNA条形码，其特征在于，节节麦trnH-psbA基因的DNA条形码序列如SEQ ID NO:2所示，圆柱山羊草trnH-psbA基因的DNA条形码序列如SEQ ID NO:1所示。

2.用于检测节节麦和圆柱山羊草DNA条形码的特异性PCR引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3-4所示。

3.含有权利要求2所述引物对的检测试剂或试剂盒。

4.权利要求2所述引物对、或权利要求3所述检测试剂或试剂盒在鉴别节节麦和圆柱山羊草中的应用。

5.根据4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测植株样品的DNA；

2)以步骤1)的DNA为模板，利用权利要求2所述引物对，进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)PCR反应体系为：30ng/μL DNA 1μL，2×TSINGKE Master Mix 15μL，10μmol上、下游引物各1μL，ddH₂O 12μL；

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤3)具体为：使用1％琼脂糖凝胶电泳分离、检测PCR扩增产物，并对PCR扩增产物进行测序，然后采用3种不同的生物信息学分析方法分析测序结果：基于频率的局部比对算法BLAST法、基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的系统发生树法。