CN102206635A - 油菜抗裂角性状结构和主效基因位点Psr9及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了油菜抗裂角性状结构和主效基因位点Psr9及其应用，其步骤：a)利用油菜高低抗裂角组合zy72360和R1进行杂交，F1代自交产生F2代分离群体；b)提取亲本zy72360和R1、F1代及F2代分离群体的叶片总DNA；c)搜集油菜SSR标记公开数据库并自主开发SSR标记、利用亲本筛选多态性引物；d)通过在F2代分离群体中的分布构建遗传图谱，借助抗裂角指数数据进行QTL位点分析，并得到与抗裂角性状主效基因紧密连锁的SSR标记；e）通过解剖显微镜观察亲本以及F2代群体成熟角果的结构，测量果瓣与胎座框结合面积指数。本发明提高了选择效率，抗裂角主效基因位点位置明确，检测方便快速，快速筛选出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育种，育种选择目标明确，节约了成本。

Description

油菜抗裂角性状结构和主效基因位点Psr9及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域。更具体涉及一种油菜抗裂角性状结构、主效基因位点及主效基因位点紧密连锁的分子标记，同时还涉及油菜抗裂角性状结构、主效基因位点Psr9的鉴定方法，还涉及抗裂角性状结构、分子标记在油菜抗裂角育种中的应用。

背景技术

油菜是世界第三大油料作物，也是我国继水稻、小麦、玉米和大豆之后的第五大农作物，全世界大约13％的植物油来自于油菜。除了作为食用油的主要原料之外，油菜也是重要的工业原料和欧盟主要成员国可再生能源的主要生物资源。我国油菜的种植面积和总产量均占世界的30％左右，它不仅关系到我国种植业结构的调整、优化和近亿农民的增收，也关系到满足人民生活水平提高、膳食结构改善及保障国家食物安全的需要，因此，加强油菜生产意义重大。

机械化是现代农业发展的方向，而油菜角果易开裂正是目前制约油菜产业机械化收获的瓶颈，严重地影响着油菜产业生产效率的提高。由于目前生产上利用的甘蓝型油菜在成熟时特别容易裂角，一般都会造成产量损失10％左右，机械化收割损失将更加严重。如果遇到成熟期气候比较恶劣，产量损失可高达50％以上，造成丰产不丰收。而且，易裂角除了带来产量损失外还会造成一系列其他的不良影响，如落地籽粒在条件适宜时会萌发形成自生苗，影响下茬作物生长，同时也增加了使用除草剂去除再生苗的成本。未来随着转基因油菜的推广应用，角果开裂种子散落还会带来生态风险。目前生产上为了避免裂角造成的产量损失和对下茬作物的不良影响，通常是提前收获，但这样做会造成油菜籽含油量下降，种子中叶绿素含量过高，影响食用油的品质。因此，选育抗裂角的油菜品种对油菜生产显得极为重要。但一般甘蓝型油菜品种间抗裂角特性变异不大，在其他的近缘种中虽然存在抗裂角特性，但通过远缘杂交很难除去不良农艺性状的影响。虽然目前在拟南芥中已有许多与角果发育和开裂有关的基因被克隆，利用这些基因来抑制油菜角果开裂和防止种子损失已经成为可能，但有关基因转化的结果是导致角果成筒状结构，致使角果完全不能开裂，造成脱粒十分困难。因此，对甘蓝型油菜抗裂角资源的发掘以及对抗裂角性状主效基因位点的开发，有助于我们未来培育适用的抗裂角优异甘蓝型油菜品种。

大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状、含油量、成熟期、品质、抗旱性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法周期长，主要是由数量性状造成的。由于分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，像研究质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究。数量性状基因座(quantitative trait locus，简称QTL)是在高密度的遗传图谱基础上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmaker软件分析确定控制某一性状的基因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常有效。

本研究通过遗传分析及QTL定位，旨在筛选出对油菜抗裂角具有正向效应的QTL，用于油菜抗裂角的分子标记辅助选择、分子育种及抗裂角基因的克隆。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种油菜抗裂角性状的主效基因位点Psr9，主效基因位点不但有助于深入了解zy72360品系中抗裂角QTL位点的作用和分布，同时为今后主效基因的克隆提供了一定的基础。

本发明的另一个目的是在于提供了一种主效基因位点Psr9的制备方法，主效基因位点是根据抗裂角指数差异极大的亲本材料(zy72360，抗裂角指数0.94和R1，抗裂角指数0.06)构建F2群体后，通过分子标记遗传图谱获得，该主效基因位点贡献率高达47％。

本发明的再一个目的是在于提供了一种与油菜抗裂角性状主效基因位点Psr9紧密连锁的分子标记和一个与油菜抗裂角性状高度相关的结构。该分子标记和与油菜抗裂角性状高度相关的结构对今后zy72360及其衍生品系以及其他油菜资源的抗裂角性状育种提供了极大的便利，分子标记筛选可以在苗期进行，缩短了筛选时间；该油菜抗裂角性状结构是首次被发现，结构观察简单，应用方便，可以在田间进行直观观察，免去了进行抗裂角指数测定的过程，大大提高了鉴定效率，节约了人力物力和时间。

本发明的还有一个目的在于提供了一种油菜抗裂角性状的主效基因位点Psr9在油菜高抗裂角性状育种中的应用。

本发明的还有一个目的在于提供了一种油菜抗裂角性状主效基因位点Psr9所在A9连锁群的P507序列在高抗裂角性状育种中的应用。

本发明的还有一个目的在于提供了一种与油菜角果抗裂角性状高度相关的解剖结构即果瓣与胎座框结合面积指数在油菜高抗裂角性状育种中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种油菜抗裂角性状主效基因位点Psr9的制备方法，它包括如下步骤：

a)利用油菜高低抗裂角组合zy72360(抗裂角指数0.94)和R1(抗裂角指数0.06)进行杂交，F1代自交产生F2代分离群体；

b)提取亲本zy72360和R1、F1代及F2代分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括CTAB提取液(0.2M Tris-Cl，0.25M NaCl，25mM EDTA，0.5％(质量比)SDS，pH 7.5)、氯仿、异戊醇、RNA酶和无水乙醇；

c)搜集油菜SSR标记公开数据库(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)并自主开发SSR标记、利用亲本筛选多态性引物。过程中所用到的主要试剂包括Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸和AgNO₃等；

d)通过在F2代分离群体中的分布构建遗传图谱，借助抗裂角指数数据进行QTL位点分析，并得到与抗裂角性状主效基因紧密连锁的标记或者抗裂角相关的基因标记，一种分离油菜抗裂角性状的基因位点Psr9，其特征在于：该主效基因位点Psr9，位于A9连锁群，由标记P507定位，其引物正向序列P507F为：TGGAGAAGGGGTCTCCAT，反向序列P507R为：TTGTTCCTAACAAACGGAAAA。即得到了Psr9。过程中所用到的主要软件包括Joinmap3.0、WinQTL cart2.5(商业途径获得)；

e)收集亲本和F2代群体成熟的油菜角果，干燥后裂开选取角果中间的胎座框，在体视显微镜下观察胎座框并照相，通过Image pro plus软件(商业途径获得)测量果瓣与胎座框结合面积指数(图5中果柄处胎座框高度L1与果柄处胎座框宽度L2之乘积，单位：mm²)。相关性分析表明果瓣与胎座框结合面积指数与抗裂角指数呈极显著正相关，并且当果瓣与胎座框结合面积指数≥2mm²时，抗裂角指数基本在0.8以上，为高裂角程度。因此我们定义果瓣与胎座框结合面积指数≥2mm²为抗裂角结构。

本研究中所用的亲本材料为抗裂角指数相差近16倍的zy72360(抗裂角指数0.94)和R1(抗裂角指数0.06)。其中zy72360为中国农业科学院油料作物研究所选育的国家审定品种中双4号的筛选株系，R1为中国农业科学院油料作物研究所选育的国家审定品种中油98D的父本。油菜两亲本、F1及F2分离群体单株抗裂角指数的测定参照文献(文雁成，甘蓝型油菜抗裂角品种的筛选与分析，作物学报，2008，1)中的随机碰撞法完成，植物叶片总DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳均为常用的分子生物学技术，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，和Draper等人，Blackwell，科学出版社，1988中的条件进行。实验过程中涉及的所有试剂[包括CTAB提取液(0.2M Tris-Cl，0.25M NaCl，25mM EDTA，0.5％(质量比)SDS，pH 7.5，Taq酶，dNTP，丙烯酰胺，尿素，冰醋酸，AgNO₃，氯仿，异戊醇，RNA酶和无水乙醇]均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。

利用上述技术措施，发明人最终获得了与抗裂角性状相关的一个主效基因位点和一个与抗裂角性状高度相关的结构，具体如下：

该主效基因位点Psr9，位于A9连锁群，由标记P507(为本发明开发的SSR标记)定位，其引物正向序列P507F为：TGGAGAAGGGGTCTCCAT，反向序列P507R为：TTGTTCCTAACAAACGGAAAA。利用Joinmap3.0软件分析测得与抗裂角性状极显著相关(不相关的概率P值为0.000)，贡献率为47％；

一种油菜抗裂角性状的主效基因位点Psr9在油菜高抗裂角性状育种、所在A9连锁群的P507序列在油菜高抗裂角性状育种中的应用。

利用高抗裂角品系zy72360(抗裂角指数0.94)和易裂角品系R1(抗裂角指数0.06)杂交后种植F2代，在F2代苗期分别取叶片提取DNA，利用主效基因位点Psr9的分子标记引物P507进行分子鉴定，筛选出带有抗裂角亲本特征带型的单株。对筛选出的F2代单株在角果成熟收获后通过前文所述的随机碰撞法检测抗裂角指数，结果表明，通过分子标记辅助选择得到的植株基本上都带有连锁标记P507所在的主效基因位点psr9，89％的单株抗裂角程度都高于双亲的中亲值，并且51％的单株达到高抗裂角水平。说明分子标记筛选能有效地获得抗裂角的单株。

利用高抗裂角品系zy72360(抗裂角指数0.94)和易裂角品系R1(抗裂角指数0.06)杂交后种植F2代，角果成熟时分别取角果胎座框测量果瓣与胎座框结合面积指数，筛选出果瓣与胎座框结合面积指数≥2mm²的单株。结果表明，通过果瓣与胎座框结合面积指数筛选得到的植株抗裂角指数超过0.80的占63％，说明通过抗裂角结构筛选能有效地获得抗裂角的单株。如果同时结合分子标记筛选，选择带有抗裂角分子标记并同时结合面积指数≥2mm²的单株，通过随机碰撞法检测抗裂角指数，结果表明，抗裂角指数超过0.80的占86％，进一步提高了筛选的准确性。在保留下来的植株中再借助近红外分析仪、抗倒仪和测千粒重的方法筛选出高含油量、抗倒伏高产的株系。

通过鉴定上述主效基因位点和果瓣与胎座框结合面积指数来预测油菜角果抗裂角性，可迅速提高油菜高抗裂角品种的育种进程。

本发明的主要优点在于：

本发明首次定位了油菜品系zy72360中的一个影响抗裂角性状的主效基因位点Psr9，它对油菜抗裂角性状的贡献率达到47％，使得油菜抗裂角性状主效基因位点的定位工作居同领域前列。在传统育种方法中，表型鉴定要等到收获角果时测定抗裂角指数，且受环境影响较大，抗裂角性状表现不稳定，往往第一年选出的高抗裂角品系第二年又表现出不高抗裂角，给选育工作带来极大困扰。因此抗裂角育种不仅费时费工，而且难度大，成本高。通过检测抗裂角性状主效QTL位点，遗传稳定性高，而且可以在苗期进行淘汰，同时结合果瓣与胎座框结合面积指数进一步筛选，不仅节约了生产成本而且大大提高了选择效率，在实施例3中，分子标记P507结合抗裂角结构筛选的准确率达到了86％。本发明中抗裂角主效基因位点位置明确，检测方便快速，不受环境影响。通过检测与抗裂角性状相关的分子标记和果瓣与胎座框结合面积指数，即可以预测抗裂角指数的高低，进而可以快速筛选出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育种，辅助育种选择目标明确，节约了育种成本。

附图说明

图1为一种在武汉种植的来源于zy72360(抗裂角指数0.94)和R1(抗裂角指数0.06)杂交获得抗裂角性状分离的F2代群体抗裂角指数频率分布图。

结果表明抗裂角指数表现分布呈连续性分布，但变异分布不呈正态分布，证明抗裂角性状属于数量性状且存在主效基因位点；

图2为一种位于A9连锁群上的QTL位点示意图。

图中竖线表示为A9连锁群上的Psr9主效基因位点，其连锁的分子标记P507为SSR标记；

图3为一种分子标记P507在F2代抗裂角极端群体(抗裂角指数0.9以上)与易裂角极端群体(抗裂角指数0.1以下)中的电泳示意图。

证明分子标记P507与抗裂角形状高度连锁。图中P1为易裂角亲本R1，P2为抗裂角亲本zy72360；

图4为一种分子标记P507在F2代株系中的筛选(A)及对高含油量、高抗倒伏优质油菜新品种中双11号的鉴定(B)示意图。

A中2、3、6、13号为高抗裂角株系，B中P1为易裂角亲本R1，P2为抗裂角亲本zy72360，1-3为中双11号不同单株；

图5为一种与角果抗裂角性状高度相关的解剖结构示意图。

果瓣与胎座框结合面积指数为图中L1与L2长度之乘积，单位：mm²。

具体实施方式

按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)和Draper等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，以及按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1：

一种油菜抗裂角性状主效基因位点Psr9的制备方法，其步骤是：

a)本实施例中使用的群体为高低抗裂角亲本(抗裂角指数高达0.94的zy72360和抗裂角指数为0.06的R1)杂交后代F2代。亲本、F1及F2种子抗裂角指数由随机碰撞法测定。F2代分离群体抗裂角指数数据分布结果表明抗裂角性状表现分布呈连续性分布，但变异分布不呈正态分布，证明抗裂角性状属于数量性状且存在主效基因位点(见图1)。利用油菜高低抗裂角组合zy72360和R1进行杂交，F1代自交产生F2代分离群体；

b)利用CTAB法提取提取亲本zy72360和R1、F1代及F2代分离群体的叶片总DNA，具体步骤如下：

A.将样品从超低温冰箱(-70℃)中取出，取1-5克叶片样品，立即放入冰冻过的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入20ml在60℃的水浴锅中预热过的提取液(0.2M Tris-Cl，0.25M NaCl，25mM EDTA，0.5％(质量比)SDS，pH7.5)，混合均匀后，放入60℃的水浴锅中水浴40min；

B.取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合物(氯仿和异戊醇的体积比为24∶1)，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10分钟；

C.取上清于另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合物(氯仿和异戊醇的体积比为24∶1)，重新抽提一次。取上清加入0.6倍体积的4℃冰箱中预冷的异戊醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。静止30min，挑出沉淀，70v/v％乙醇洗2-3次，再用无水乙醇洗一次，干燥后加5-10ml 65℃无菌水溶解20min；

D.再次加入等体积的氯仿和异戊醇混合物(氯仿和异戊醇的体积比为24∶1)，重新抽提。取上清，加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，PH5.2)缓冲溶液，混匀后缓慢加入2倍体积的-20℃冰箱中预冷的无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，70v/v％乙醇洗2-3次，再用无水乙醇洗一次，干燥后加1ml无菌水溶解，检测浓度后于-20℃冰箱中保存备用。

c)搜集油菜SSR标记公开数据库(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)并自主开发SSR标记、利用亲本筛选多态性引物。根据已报道的SSR标记引物以及自主开发的抗裂角相关的功能基因设计的分子标记进行引物的筛选。筛选结果表明，有160对引物在双亲间有差异。多态性筛选程序如下：

(1)自父母本中各随机选择5株的DNA模板等量混合，构成两个亲本的DNA样本用来筛选引物。

(2)PCR体系及程序：

PCR反应程序：

(3)凝胶电泳：

凝胶配制：6％(质量比)PAGE胶：6％(质量比)丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5×TBE缓冲液，灌胶前加入300μl 10％(质量比)NH₄S₂O₄，30μl TEMED；

电泳缓冲液10×TBE配制：Tris碱C₄H₁₁NO₃108g，硼酸55g，0.5M EDTA(pH8.0)40ml，定容至1000ml，使用时稀释为0.5×TBE工作液。

PAGE胶制备：将长、短玻璃胶板用10％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗净，凉干。长胶板用餐巾纸均匀涂抹硅烷化剂(acryl-glide glass plate coating，AMRESCO)，短胶板涂抹1ml反硅烷化剂(0.5v/v％冰醋酸，97.5v/v％乙醇，2v/v％粘合剂M-6514)，放置5分钟后，用95v/v％乙醇轻轻洗擦以除去多余的反硅烷化剂和硅烷化剂。将玻璃装好，并以边条隔开，小心套入制胶夹(GIBCO/BRL)中。准备就绪后在短胶板上用注射器将50ml变性胶混合液(每50ml凝胶溶液中加入250μl过硫酸氨溶剂和25μl TEMED溶剂)，长胶板上用注射器将80ml变性胶混合液缓慢注入，避免产生气泡。插入梳子，并用夹子夹牢，凝聚2小时后即可电泳。

电泳：从制胶夹中取出胶板，擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml 0.5×TBE缓冲液，将梳子拔出后立即冲洗点样孔，接通电源1500伏恒压预热30min。在PCR产物中加入等体积的上样缓冲液(98v/v％去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005％(质量比)二甲苯青FF，0.005％(质量比)溴酚蓝)，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样5μl，1800伏恒压电泳80min。当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。

染色：采用银染法进行染色：10v/v％冰醋酸固定至胶板无色，ddH₂O漂洗两次，每次2-3分钟。然后染色0.1％(质量比)AgNO₃，0.56v/v％甲醛30分钟。取出胶板，再ddH₂O漂洗10s，再在4℃预冷的显影液(3％(质量比)Na₂CO₃，0.56v/v％甲醛，2mg/LNa₂S₂O₃·5H₂O)中轻轻摇动至条带清晰可见，然后倒入中止液(10v/v％冰醋酸)中，停止显影。用蒸馏水漂洗3分钟，室温(20-25℃，以下同)下自然凉干，拍照保存。

d)在亲本中筛选到有多态性的引物后，分析其在F2群体中的分布。通过在F2代分离群体中的分布进行数据分析，根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建油菜的遗传图谱，所用软件为Joinmap3.0，最小LOD值设为2.5，获得连锁图谱(图2为A9连锁群图谱)。将F2群体的188个单株的抗裂角指数数据及多态性引物的分布情况输入计算机，运行WinQTL cart2.5软件对数据进行关联性分析，单向方差分析测得与抗裂角性状相关的位点对抗裂角性状的贡献率为47％，且与抗裂角性状不相关的概率P值＜0.01，表明该分子标记与一个主效基因位点连锁，其引物序列为P507F：TGGAGAAGGGGTCTCCAT，P507R：TTGTTCCTAACAAACGGAAAA。

实施例2：

一种油菜抗裂角性状的主效基因位点Psr9在油菜高抗裂角性状育种、所在A9连锁群的P507序列在油菜高抗裂角性状育种中的应用，其步骤是：

a)本实施例中使用的群体为高低抗裂角亲本(抗裂角指数高达0.94的zy72360和抗裂角指数为0.06的R1)杂交后代F2代。F2代材料种植在田间，按单株编号，本实施例中编号了400个单株，编号为001-400。

b)对编号为001-400的400个F2代单株在苗期分别取一小片叶片提取DNA，提取方法参照实施例1中DNA提取方法。

c)利用油菜抗裂角性状的主效基因位点Psr9的标记P507引物，对编号为001-400的400个F2代单株DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法参照实施例1中的方法。

d)结果如图4A中P507引物所扩增的F2不同单株的条带所示，2号中的条带为抗裂角材料的特征条带。89个单株含有P507标记的特征条带。因此，图4A中的F2代单株2、3、6、13号油菜苗即可保留下来。

e)保留下来的89个单株在角果成熟后收获，利用随机碰撞法测定它们的抗裂角指数。结果表明在带有标记P507抗裂角特征条带的F2单株中，89％的单株(79株)抗裂角指数高于两个亲本抗裂角指数的中亲值0.50；抗裂角指数最低为0.19，也是易裂角亲本抗裂角指数0.06的3倍；并且其中的46株(占51％)抗裂角指数在0.80以上，为高抗裂角单株。实验结果表明通过分子标记辅助选择得到的植株，基本上都带有连锁标记P507所在的主效基因位点psr9，89％的单株抗裂角程度都高于双亲的中亲值，并且51％的单株达到高抗裂角水平。在保留下来的植株中再借助近红外分析仪、抗倒仪和测千粒重的方法筛选高含油量、抗倒伏高产的株系。通过检测与抗裂角性状相关的分子标记，即可以预测抗裂角程度的高低，在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选高抗裂角株系，用于油菜抗裂角育种。

f)图4B为利用与抗裂角连锁的标记P507引物鉴定本课题组培育的拥有自主知识产权的高抗裂角、高含油量、高抗倒伏的优质油菜新品种中双11号。结果显示中双11号具有与抗裂角材料ZY72360同样的带型，且其抗裂角指数也高达0.83，说明中双11号也带有该抗裂角主效基因位点。

实施例3：

一种油菜抗裂角性状高度相关的结构，果瓣与胎座框结合面积指数在抗裂角育种中的应用。其步骤是：

a)结合实施例2进行应用，对实施例2中分子标记筛选得到的89个F2代植株，在角果发育晚期分别取角果，通过解剖显微镜观察并测量果瓣与胎座框结合面积指数。

b)结果表明分子标记筛选出的89个F2代植株中，有56个(占63％)植株的果瓣与胎座框结合面积指数≥2mm²。种子收获后的抗裂角测试结果表明，通过分子标记和果瓣与胎座框结合面积指数筛选后的植株，56个中有48个(占86％)抗裂角指数在0.80以上。也就是说，通过分子标记P507和果瓣与胎座框结合面积指数同时筛选，获得的植株86％均为高抗裂角材料。在保留下来的植株中再借助近红外分析仪、抗倒仪和测千粒重的方法筛选高含油量、抗倒伏高产的株系。通过检测与抗裂角性状相关的分子标记和果瓣与胎座框结合面积指数，可以更准确地预测抗裂角程度的高低，在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育种。

c)利用与抗裂角连锁的标记P507引物和果瓣与胎座框结合面积指数鉴定本课题组培育的拥有自主知识产权的高抗裂角、高含油量、高抗倒伏的优质油菜新品种中双11号。结果显示中双11号既具有与抗裂角材料ZY72360同样的带型，其果瓣与胎座框结合面积指数也≥2mm²，且其抗裂角指数高达0.83，说明中双11号也带有该抗裂角主效基因位点。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

<120>  油菜抗裂角性状结构和主效基因位点Psr9及其应用

<130>  油菜抗裂角性状结构和主效基因位点Psr9及其应用

<140>  2011101272777

<141>  2011-05-17

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

tggagaaggg gtctccat                                                   18

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

ttgttcctaa caaacggaaa a                                               21

 

Claims (5)

1.一种分离油菜抗裂角性状的基因位点Psr9，其特征在于：主效基因位点Psr9，位于A9连锁群，由标记P507定位，其引物正向序列P507F为：TGGAGAAGGGGTCTCCAT，反向序列P507R为：TTGTTCCTAACAAACGGAAAA。

2.权利要求1所述的一种油菜抗裂角性状主效基因位点Psr9的制备方法，其步骤是：

a)利用油菜高低抗裂角组合zy72360和R1进行杂交，F1代自交产生F2代分离群体； 

b)提取亲本zy72360和R1、F1代及F2代分离群体的叶片总DNA，所用到的试剂包括CTAB提取液为0.2M Tris－Cl、0.25M NaCl、25mM EDTA、0.5%质量比SDS、pH 7.5、氯仿、异戊醇和无水乙醇； 

c)搜集油菜SSR标记公开数据库并开发SSR标记和SNP标记、利用亲本筛选多态性引物，所用到的试剂包括Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸和AgNO₃；

d) 通过在F2代分离群体中的分布构建遗传图谱，借助抗裂角指数数据进行QTL位点分析，并得到与抗裂角性状主效基因紧密连锁的标记或者抗裂角相关的基因标记，得到了Psr9；

e）收集亲本和F2代群体成熟的油菜角果，干燥后裂开选取角果中间的胎座框，在体视显微镜下观察胎座框并照相，通过Image pro plus软件测量果瓣与胎座框结合面积指数，相关性分析表明果瓣与胎座框结合面积指数与抗裂角指数呈极显著正相关，果瓣与胎座框结合面积指数≧2 mm²，抗裂角指数在0.8以上，为高裂角程度，果瓣与胎座框结合面积指数≧2 mm² 为抗裂角结构。

3.权利要求1所述的一种油菜抗裂角性状的主效基因位点Psr9在油菜高抗裂角性状育种中的应用。

4.权利要求1所述的一种油菜抗裂角性状主效基因位点Psr9所在A9连锁群的P507序列在抗裂角性状分子标记开发中的应用。

5.权利要求2所述的一种与油菜角果抗裂角性状高度相关的果瓣与胎座框结合面积指数在油菜高抗裂角性状育种中的应用。

Images