CN107760767A - 一种小麦抗赤霉病多重荧光ssr标记检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法。本发明首先提取待测小麦样品的DNA；以上述的DNA作为模板，采用多重荧光标记SSR引物(Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398)进行多重PCR扩增；PCR产物毛细管电泳检测；收集荧光信号进行数据分析，根据多重荧光标记SSR引物的扩增片段大小及其主峰，来判定待测小麦的3B、4B、5A和6B位点上是否含有赤霉病抗性分子标记。本发明首次将多重SSR荧光标记检测技术应用于小麦抗赤霉病的检测，可在一个反应中同时检测小麦不同染色体上的四个聚合位点，对选育具有赤霉病持久抗性和综合抗性的材料或小麦品种具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及小麦病害的检测新技术领域，具体是针对多个小麦抗赤霉病分子标记开发的多重SSR荧光标记检测新技术。
背景技术
小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)主要由真菌禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum Schwabe)引起的小麦穗部侵染病害，现已成为全球性的小麦病害，被称为小麦病害的癌症，常发病在长江中下游冬麦区、川滇冬麦区和华南冬麦区等地区。由于近几年全球气候变暖、多雨湿润，导致该病害呈由南向北扩展趋势，发病严重时可导致小麦减产达80％-90％，其中真菌脱氧雪腐镰刀菌稀醇(DON)和赤霉烯酮(ZEN)毒素的污染不仅影响小麦品质生产、人畜健康，而且还会严重威胁我国小麦粮食生产和安全。采用传统的育种技术进行抗赤霉病小麦品种选育，存在田间鉴定困难、费时费力、结果不可靠、鉴定标准不统一等问题。因而将分子标记鉴定技术与传统育种技术相结合，通过选育具有赤霉病持久抗性和综合抗性的材料或品种是减轻小麦赤霉病危害的有效手段。目前，利用分子标记进行基因聚合与选育方面的研究引起了大家广泛关注，国内近几年在水稻、小麦、大麦等作物的抗盐碱、抗病虫害多基因聚合研究较多。其中小麦抗赤霉病抗性基因聚合与育种方面的研究已成为热点。
在利用分子标记进行基因聚合与选育方面的研究已成为热点的基础上，随之而来的有关抗性检测技术的研究也有较大的进展。其中，与传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳相比较，SSR荧光标记毛细管电泳检测技术因具有高效、准确、自动化等优点，在玉米、水稻、油菜、大麦、黑麦草、烟草、莴苣和竹子等多种植物分子标记研究中显示出极为广阔的应用前景。然而，该技术在小麦中的研究应用目前还停留在单个位点的检测上，存在通量小、时间和试剂成本较高的问题。近些年，SSR荧光标记毛细管电泳检测技术在小麦的研究中也仅限于种子纯度检验、新品种测试、种质资源管理等领域，在小麦赤霉病抗病性的鉴定中还是空白，尤其是多重荧光SSR标记检测技术的研发。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法。本发明通过收集已报道的普通小麦染色体3BS(Fhb1)、6BS(Fhb2)、4B(Fhb4)和5AS(Fhb5)上与赤霉病抗性紧密连锁的24对SSR标记特异引物，利用常规PCR筛选出每条染色体上扩增效率高、多态性好的引物，使用不同颜色的荧光染料对其5’末端进行标记，根据扩增片段大小范围、信号强度将引物进行2+2(2个FAM荧光标记位点+2个HEX荧光标记位点)组合，应用ABI3730XL全自动DNA分析仪收集荧光信号，利用GeneMapper v4.0进行数据分析，从而建立可同时检测四个小麦抗赤霉病位点的SSR荧光标记检测体系。该技术与传统的聚丙烯酰胺电泳法相比，具有准确率高、检测通量大、耗时短和数据采集自动化等优势，为小麦赤霉病分子标记辅助选择提供了技术支撑，尤其适用于大规模样本筛选，该项技术的推广利用可以显著缩短小麦抗赤霉病新品种的育成年限，将极大提高育种效率。
本发明的技术方案是：一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，包括以下步骤：
1)提取待测小麦样品的DNA；
2)以上述的DNA作为模板，采用多重荧光标记SSR引物进行多重PCR扩增；
多重荧光标记SSR引物为Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398，其核苷酸序列依次如表2及序列表SEQ ID No.1～8所示；采用的荧光染料依次为：5'FAM、5'FAM、5'HEX和5'HEX。
其中多重PCR扩增反应体系为(15μL)：5×PCR Buffer(含2mmol/L Mg2+)3μL、2.5mmol/L dNTP 1.2μL、5U Taq酶0.1μL、引物mix 1μL，DNA模板1.8μL，超纯水7.9μL。其中引物mix为：4对引物(Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的正向引物、反向引物，共8条)的浓度均为1μmol/L，总的引物浓度为8μmol/L。
PCR反应程序：95℃模板预变性5min，1个循环；95℃模板变性1min，60℃与模板靶位点结合45s，72℃引物延伸45s，共35个循环；最后60℃延伸30min，16℃保存。
3)PCR产物毛细管电泳检测
PCR产物荧光毛细管电泳检测为：向980μL去离子甲酰胺中加入20μL ROX500内标，涡旋混匀，短暂离心，以每孔10μL分装到新的96孔板内，取1μL PCR产物对应的加入各孔中，3000r/min离心1min；PCR仪上95℃变性5min，立即置于冰上5min后，利用ABI 3730XL DNA分析仪上进行荧光毛细管电泳检测。
4)收集荧光信号进行数据分析，根据多重荧光标记SSR引物Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的扩增片段大小及其主峰，来判定待测小麦中上述标记分别对应的3B、4B、5A和6B位点上是否含有赤霉病抗性分子标记。
优选应用ABI 3730XL全自动DNA分析仪收集荧光信号，利用GeneMapper v4.0进行数据分析。
本发明首次将多重SSR荧光标记检测技术应用于小麦抗赤霉病的检测，可在一个反应中同时检测小麦不同染色体上的四个聚合位点，这表明在小麦抗赤霉病病害的研究中，应用分子标记检测可以有效的节约成本、达到高效、准确的效果，有助于推动不同位点的抗病基因进行有针对性聚合方面的研究工作。该技术与传统的聚丙烯酰胺电泳法相比，具有准确率高、检测通量大、耗时短和数据采集自动化等优势，为小麦赤霉病分子标记辅助选择提供了技术支撑，尤其适用于大规模样本筛选。
本发明多重SSR荧光标记的四个位点都是主效QTL，其中4B、5AS来自于Ⅰ型抗性(抗侵染)，3BS、6BS来自于Ⅱ型抗性(抗扩展)，将这四个位点的QTL都聚合在一起，对选育具有赤霉病持久抗性和综合抗性的材料或小麦品种具有重要的意义。
附图说明
图1为抗赤霉病四个位点荧光检测的等位变异峰图；其中第一、二、三、四、五道的椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置，第六道的椭圆圈为每个等位变异的阴性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；
图2为抗赤霉病单个位点荧光检测的等位变异峰图；其中椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；
图3为抗赤霉病两个位点荧光检测的等位变异峰图；其中椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；
图4为抗赤霉病三个位点荧光检测的等位变异峰图；其中椭圆圈为每个等位变异的阳性主峰位置；纵坐标表示荧光信号强度；横坐标表示扩增片段大小(bp)；
图5为6个小麦亲本(望水白、NMAS018、NMAS020、NMAS019、济麦22、济麦44)分别采用Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398分子标记引物进行扩增的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图片；图中M：фX174-Hinc II digest DNA marker；其中，按分子标记区分：1-7泳道引物为GWM495，8-14泳道引物为Xgwm533，15-21泳道引物为WMC398，22-28泳道引物为BARC117；按小麦亲本区分，1、8、15、22泳道为望水白，2、9、16、23泳道为济麦22，3、10、17、24泳道为NMAS018，4、11、18、25泳道为NMAS019，5、12、19、26泳道为NMAS020，6、13、20、27泳道为济麦44，7、14、21、28泳道为H2O对照。
具体实施方式
实施例1：
1.材料与方法
1.1材料
试验材料于2016年10月种植在山东省农业科学院作物研究所实验基地，亲本6份，F2分离世代2080份，其中6份亲本为：望水白、NMAS018、NMAS020、NMAS019、济麦22、济麦44，按照挂牌单株取样，每个材料选取40个单株，每个单株取叶片100-200mg，置于-20℃冰箱保存。
1.2DNA提取
将所取叶片液氮磨碎，采用Allen报道的CTAB法提取基因组DNA。提取的DNA加适量TE溶液溶解，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。
1.3引物多态性的筛选
通过收集已报道的普通小麦染色体3BS(Fhb1)、6BS(Fhb2)、4B(Fhb4)和5AS(Fhb5)上与赤霉病抗性紧密连锁的24对SSR标记特异引物(表1)，利用常规PCR筛选出每条染色体上扩增效率高、多态性好的引物，使用不同颜色的荧光染料对其5’末端进行标记，根据扩增片段大小范围、信号强度将引物进行“2+2”组合(如表2所示)，引物和标记均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1已报道的24对不同位点SSR引物信息
表2四对荧光标记引物
1.4利用筛选得到的4对荧光标记引物对待测品种DNA模板进行多重PCR扩增与产物荧光检测
多重PCR扩增反应体系为15μL：5×PCR Buffer(含2mmol/L Mg2+)3μL、2.5mmol/LdNTP 1.2μL、5U Taq酶0.1μL、引物mix 1μL，DNA模板1.8μL，超纯水7.9μL。引物mix制备见表3。
表3.引物Mix的配置
PCR反应程序：95℃模板预变性5min，1个循环；95℃模板变性1min，60℃与模板靶位点结合45s，72℃引物延伸45s，共35个循环；最后60℃延伸30min，16℃保存。
PCR产物荧光毛细管电泳检测：向980μL去离子甲酰胺中加入20μL ROX500内标，涡旋混匀，短暂离心，以每孔10μL分装到新的96孔板内，取1μL PCR产物对应的加入各孔中，3000r/min离心1min；PCR仪上95℃变性5min，立即置于冰上5min后，利用ABI 3730XL DNA分析仪上进行毛细管电泳荧光检测。
1.5数据采集与分析
应用ABI 3730XL全自动DNA分析仪收集荧光信号，利用GeneMapper v4.0进行数据分析。
2.结果与分析
2.1引物筛选
通过对24个不同位点的SSR引物进行PCR扩增，将多态性差的引物进行淘汰，筛选出带型清晰、多态性高，扩增片段长度在100-300bp之间的4对引物(表4)，将Xgwm533(3B)、GWM495(4B)、BARC117(5A)和WMC398(6B)进行“2+2”组合并进行荧光检测(见图1)。结果显示：4对引物均在不同位点有特异主峰(第一、二、三、四道)，并且在阳性对照望水白(第五道)和阴性对照济麦22(第六道)中被清晰的分开。
2.2亲本检测
望水白、NMAS020的等位变异峰如图1的第5泳道所示；济麦22、济麦44的等位变异峰如图1的第6泳道所示；NMAS018的变异峰如图3的泳道3所示，NMAS019的变异峰如图3的泳道2所示。因此，检测结果为：望水白(聚合四个位点3B+4B+5A+6B)、NMAS018(聚合三个位点3B+5A+6B)、NMAS020(聚合四个位点3B+4B+5A+6B)、NMAS019(聚合三个位点3B+4B+6B)、济麦22(阴性)、济麦44(阴性)。这与目前报道的结果一致。
2.3对聚合四个位点的2080株F2分离世代进行检测
与此同时，利用该体系对聚合四个位点的2080株F2分离世代进行检测，结果见表4，其中抗赤霉病单个位点、两个位点和三个位点的荧光检测的等位变异峰分别如图2-4所示。四个位点和阴性的荧光检测的等位变异峰如图1所示。
表4 2080株F2分离世代检测结果汇总
可见，本发明的技术具有检测通量大、耗时短和数据采集自动化等优势，尤其适用于大规模样本筛选(如上述2080株F2分离世代)。可见分子标记辅助选择是可以将不同位点的基因进行有针对性性地聚合，为田间抗病性鉴定提供了参考。
2.4利用上述4对引物对6个亲本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
采用上述1.2中的6个小麦亲本(望水白、NMAS018、NMAS020、NMAS019、济麦22、济麦44)的基因组DNA分别采用Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398分子标记引物进行扩增，同时以清水作为对照，然后将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果如图5。
PCR扩增反应体系为15μL：5×PCR Buffer(含2mmol/L Mg2+)3μL、2.5mmol/L dNTP1.2μL、5U Taq酶0.1μL、引物mix(正向引物和反向引物，浓度均为1μmol/L)1μL，DNA模板1.8μL，超纯水7.9μL。
PCR反应程序：95℃模板预变性5min，1个循环；95℃模板变性1min，60℃与模板靶位点结合45s，72℃引物延伸45s，共35个循环；最后60℃延伸30min，16℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：取扩增的产物2μL，加3μL的6×loading buffer(大连宝生物公司)，在6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上电泳1-1.5h(60W恒功率)。
银染检测扩增产物：在盘中加入10％的乙醇和500μL的冰乙酸，摇匀后放入聚丙烯酰胺凝胶，在水平摇床上摇3-5分钟进行定影；在盘中加入1ml 1％的AgNO3，再水平摇20分钟染色；倒掉定影液，用蒸馏水洗涤2-3次；在盘中加入3％NaOH溶液和500μL甲醛，继续在水平摇床上摇动，直到显影；显影后，再用蒸馏水洗涤2-3次，以免保存时受显影液的影响而变色；最后对理想的聚丙烯酰胺凝胶用数码相机拍照保存，结果如图5所示。
结果讨论：从图5可以看出：望水白(聚合四个位点3B+4B+5A+6B)、NMAS018(聚合三个位点3B+5A+6B)、NMAS020(聚合四个位点3B+4B+5A+6B)、NMAS019(聚合三个位点3B+4B+6B)、济麦22(阴性)、济麦44(阴性)。亲本检测结果与上述的毛细管电泳检测方法完全一致，也与文献报道的结果一致，进一步证明了本发明检测技术的准确可靠性。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法
<130> 0
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Xgwm533-F
<400> 1
aaggcgaatc aaacggaata 20
<210> 2
<211> 20
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<213> Artificial
<220>
<223> Xgwm533-R
<400> 2
gttgctttag gggaaaagcc 20
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gagagcctcg cgaaatatag g 21
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<223> GWM495-R
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tgcttctggt gttccttcg 19
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<213> Artificial
<220>
<223> BARC117-F
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<212> DNA
<213> Artificial
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gagggcagga aaaagtgact 20
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<213> Artificial
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ggagattgac cgagtggat 19
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<220>
<223> WMC398-R
<400> 8
cgtgagagcg gttctttg 18
Claims (7)
1.一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，包括以下步骤：
1)提取待测小麦样品的DNA；
2)以上述的DNA作为模板，采用多重荧光标记SSR引物进行多重PCR扩增；多重荧光标记SSR引物为Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398；
3)PCR产物毛细管电泳检测；
4)收集荧光信号进行数据分析，根据多重荧光标记SSR引物Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的扩增片段大小及其主峰，来判定待测小麦中Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398分别对应的3B、4B、5A和6B位点上是否含有赤霉病抗性分子标记。
2.如权利要求1所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398采用的荧光染料依次为：5'FAM、5'FAM、5'HEX和5'HEX。
3.如权利要求2所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述步骤2)多重PCR扩增，采用的15μL的多重PCR扩增反应体系为：含2mmol/L Mg2+的5×PCRBuffer 3μL、2.5mmol/L dNTP 1.2μL、5U Taq酶0.1μL、引物mix 1μL，DNA模板1.8μL，超纯水7.9μL；其中引物mix为：含有Xgwm533、GWM495、BARC117和WMC398的各自的正向引物和反向引物，浓度均为1μmol/L。
4.如权利要求3所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述步骤2)多重PCR扩增，PCR反应程序：95℃模板预变性5min，1个循环；95℃模板变性1min，60℃与模板靶位点结合45s，72℃引物延伸45s，共35个循环；最后60℃延伸30min，16℃保存。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述步骤3)的PCR产物荧光毛细管电泳利用ABI 3730XL DNA分析仪检测。
6.如权利要求5所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述步骤3)的PCR产物荧光毛细管电泳检测为：向980μL去离子甲酰胺中加入20μL ROX500内标，涡旋混匀，离心，以每孔10μL分装到新的96孔板内，取1μL PCR产物对应的加入各孔中，3000r/min离心1min；PCR仪上95℃变性5min，立即置于冰上5min后，利用ABI 3730XL DNA分析仪上进行荧光毛细管电泳检测。
7.如权利要求5或6所述的一种小麦抗赤霉病多重荧光SSR标记检测方法，其特性是，所述步骤4)利用GeneMapper v4.0进行数据分析。
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2017
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