CN104046697B - 基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的ssr引物组及其在种质鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的SSR引物组及其在种质鉴定中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明所述SSR引物组有42对引物，其中第1至42对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.84所示。实验证实：本发明获得的SSR引物组具有多态性丰富、重复性好、电泳条带清晰等优点，该SSR引物组可有效用于种质鉴定和DNA指纹图谱构建等研究，且方法灵敏、可靠，能快速准确地实现和完成白蜡种质的区分和鉴别，对我国白蜡种质资源的鉴定、知识产权保护以及促进白蜡分子遗传育种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一套基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的SSR引物组及其在种质鉴定中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
绒毛白蜡(Fraxinus Velutina Torr.)为木犀科(leaceae)白蜡属(Fraxinus Linn.)落叶乔木，原产于美国，1911年引入我国山东济南(孟昭和等，2001)，速生、美观、抗逆,已成为我国华北、华东主要沿海城市园林绿化树种和优良盐碱地造林树种(时明芝，1996；王勤等，2000；倪国祥等，1995；王友平等，2007)，也是唯一的盐碱地大乔木树种。由于缺乏大量的多态性分子标记，其遗传学和基因组学方面的研究滞后于林木树种杨树。因此，查清我国绒毛白蜡种质资源的遗传背景、开展相应的遗传学基础研究、定位重要经济性状是我国白蜡选育工作中首先需要解决的问题。此外，传统的白蜡分类主要依靠果实形状和果翅数目的不同，该分类方法无法有效的在幼树早期进行应用，同时在还存在着分类混淆问题，导致目前白蜡命名上存在一些争议(洪亚平等，2004)。利用分子生物学办法、建立有效、快捷的种质鉴别方法对解决我国白蜡树种间的分类问题与良种早期选育具有重要的意义。
目前在木本植物的遗传学分析中，应用较多的主要是RAPD，ISSR，AFLP等分子标记，但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得到，虽然具有一定的应用价值，但是随机性强、稳定性差。SSR(Simple Sequence repeats)即简单重复序列，又称微卫星DNA(Mierosatellites)，是一种由2-6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，存在于绝大多数真核生物基因组中，且分布在整个基因组的不同位置上。与其他分子标记相比，SSR技术具有共显性、多态性相对丰富、基因组覆盖较多等特点，且该技术具有简便、快速、稳定性高和等位基因多样性高等优点，是目前进行遗传多样性分析、遗传图谱构建、品种鉴定和DNA指纹图谱构建等研究的首选标记(Maetal.2004；吴晓雷等，2001)。由于林木自身固有的长周期育种特性，分子标记在林木育种研究中应用将更加广泛。随着测序技术的发展和成本的降低，部分木本树种已完成转录组测序，在此基础上便于对这些植物进行转录组SSR标记的挖掘和分析。白蜡与杨树、茶树等木本植物相比，目前报道的仅有欧洲白蜡SSR标记(只有11对)，王建兵等通过EST数据库开发了具有多态性的3对绒毛白蜡SSR标记(2014年)，数量极少，远不能满足白蜡研究的需要，因此大量开发SSR标记仍是目前白蜡研究的重要工作之一。鉴于此，开发基于白蜡转录组序列的SSR引物组，将有助于高效的构建白蜡的遗传图谱，开展与重要经济性状相关的QTL定位，从而推动白蜡分子标记辅助育种的进程。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目是提供一套基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的SSR引物组及其在种质鉴定中的应用。
本发明所述的基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的SSR引物组，其特征在于，该SSR引物组有42对引物，其中：
第1对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的反向引物序列组成，
第2对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的反向引物序列组成，
第3对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示的反向引物序列组成，
第4对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示的反向引物序列组成，
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第21对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.41所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.42所示的反向引物序列组成，
第22对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.43所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.44所示的反向引物序列组成，
第23对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.45所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.46所示的反向引物序列组成，
第24对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.47所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.48所示的反向引物序列组成，
第25对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.49所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.50所示的反向引物序列组成，
第26对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.51所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.52所示的反向引物序列组成，
第27对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.53所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.54所示的反向引物序列组成，
第28对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.55所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.56所示的反向引物序列组成，
第29对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.57所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.58所示的反向引物序列组成，
第30对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.59所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.60所示的反向引物序列组成，
第31对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.61所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.62所示的反向引物序列组成，
第32对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.63所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.64所示的反向引物序列组成，
第33对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.65所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.66所示的反向引物序列组成，
第34对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.67所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.68所示的反向引物序列组成，
第35对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.69所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.70所示的反向引物序列组成，
第36对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.71所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.72所示的反向引物序列组成，
第37对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.73所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.74所示的反向引物序列组成，
第38对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.75所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.76所示的反向引物序列组成，
第39对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.77所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.78所示的反向引物序列组成，
第40对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.79所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.80所示的反向引物序列组成，
第41对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.81所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.82所示的反向引物序列组成，
第42对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.83所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.84所示的反向引物序列组成。
具体的，各对引物的核苷酸序列见如下列表。
本发明所述基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的SSR引物组在白蜡种质鉴定中的应用。
其中，利用所述的SSR引物组进行白蜡种质鉴定的方法是：
(1)DNA提取：利用改良的CTAB法提取待测白蜡样品基因组DNA；
(2)SSR-PCR扩增：
以步骤(1)提取的DNA样品为模板，采用如序列表SEQ ID No.1-84所示引物进行SSR-PCR扩增；
SSR-PCR采用10ul反应体系：25mmol·l-1Mg2+0.8μl、10μmol·l-1引物0.2μl、10mmol·l-1dNTP 0.3μl、5U·μl-1Taq酶0.05μl、5-10ng·μl-1DNA模板2.00μl、10×PCR缓冲液1.0μl，ddH2O 5.45μl；
PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，54℃-58℃退火1min，72℃延伸l min，共35个循环；最后72℃延伸5延伸l min，4℃10min终止反应；
(3)电泳检测及统计：将步骤(2)的SSR-PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计带型，某位置若有条带记为1，若无则记为0，以此方式建立供试材料SSR基因型信息数据库，进行白蜡种质鉴定分析。
进一步的，步骤(3)中所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法是：将步骤(2)SSR-PCR扩增后的产物与等体积95％去离子甲酰胺混匀后，取4μl点样，PCR产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中，60W恒功率电泳2-3h；其中，电极缓冲液为1×TBE，使用10bp DNA Ladder(InvitrogenInc.)来确定等位基因大小。
本发明基于绒毛白蜡转录组序列开发的42对多态性的核心SSR引物组具有多态性丰富、重复性好、电泳条带清晰的优点，该SSR引物组可有效用于种质鉴定和DNA指纹图谱构建等研究，且方法灵敏、可靠，能快速准确地实现和完成白蜡种质的区分和鉴别，对我国白蜡种质资源的鉴定、知识产权保护以及促进白蜡分子遗传育种具有重要意义。
本发明突出的效果是：1)本发明以提取的白蜡总DNA为鉴定材料,在任何生长时期和部位取材都不影响反应结果,从而避免对品种鉴别的干扰与影响；2)本发明的42对SSR引物在白蜡基因组中分布均匀，多态性丰富，扩增稳定，扩增条带易于鉴定，具有简便、快捷、特异等特点；3)通过大量的筛选工作,得到了多态性的核心SSR引物组,进行白蜡品种鉴定、多样性评价、亲缘关系分析和品种权保护等提供分子水平上的依据，促进了白蜡遗传育种水平的提高和白蜡产业的发展。
附图说明
图1：引物18对12份白蜡树种的扩增结果。
其中：M为Marker；1为金叶白蜡；2为欧洲白蜡；3为白梣；4为花曲柳；5为水曲柳；6为鲁蜡6号；7为鲁蜡3号；8为鲁蜡2号；9为对节白蜡；10为红叶白蜡；11为中国白蜡；12为新疆小叶白蜡。
图2：引物30对12份白蜡树种的扩增结果。
其中：M为Marker；1为金叶白蜡；2为欧洲白蜡；3为白梣；4为花曲柳；5为水曲柳；6为鲁蜡6号；7为鲁蜡3号；8为鲁蜡2号；9为对节白蜡；10为红叶白蜡；11为中国白蜡；12为新疆小叶白蜡。
图3：引物42对12份白蜡树种的扩增结果。
其中：M为Marker；1为金叶白蜡；2为欧洲白蜡；3为白梣；4为花曲柳；5为水曲柳；6为鲁蜡6号；7为鲁蜡3号；8为鲁蜡2号；9为对节白蜡；10为红叶白蜡；11为中国白蜡；12为新疆小叶白蜡。
具体实施方式
实施例1
1、白蜡基因组DNA的提取：
(1)材料
从白蜡核心种质材料中选取12份有代表性的种，分别为新疆小叶白蜡(Fraxinussogdiana)、中国白蜡(Fraxinus chinensis Roxb)、红叶白蜡(Fraxinus velutina TorrHongyebaila)、对节白蜡(Fraxinus hupehensis)、鲁蜡2号(Fraxinus velutina Torr Lula No.2)、鲁蜡3号(Fraxinus velutina Torr Lula No.3)、鲁蜡6号(Fraxinus pennsylvanica Lula No.6)、水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr)、花曲柳(Fraxinus rhynchophylla)、白梣(Fraxinus americanaLinn)、欧洲白蜡(Fraxinus Excelsior)、金叶白蜡(Fraxinus Linn)。
每年5月，取春季刚长出的新鲜叶片，用保鲜袋封存后置于冰盒带回山东省林业科学研究院，液氮冷冻后放置于–70℃冰箱中保存待用。
(2)采用CTAB法提取白蜡叶片基因组DNA
1)将配制好的CTAB提取缓冲液置于65℃的水浴锅中预热30min，氯仿:异戊醇(24:1)、无水乙醇、70％乙醇置于-20℃冰箱预冷备用，研钵需提前预冷，使用前再用少量液氮预冷。
2)取0.1-0.2g白蜡幼叶，加充足液氮(分两次加)研磨至粉末状，迅速转入2ml离心管中，加入600μl 2％的CTAB提取液(含2％β-巯基乙醇)，充分混匀。在65℃的水浴锅中水浴30min，其间轻轻颠倒3-4次。
3)冷至室温后加入600μl的氯仿:异戊醇(24：1)抽提10min，其间不停地轻轻地摇动，冷却至室温，在12000r·min-1离心10min。
4)将上清液(约500μl)转入另一离心管中，加等体积氯仿:异戊醇(24:l)重复步骤3。
5)取出上清液并移到另一个干净的1.5ml的离心管中，再加1ml的预冷无水乙醇沉淀DNA(-20℃放置30min)，轻轻旋转离心管，出现絮状DNA，-20℃放置1h，观察沉淀生成。
6)8000rmp室温离心5min，倒掉上清液，沉淀用1ml 75％的酒精洗涤两次，超净工作台静置乙醇挥发干净。
7)待DNA风干后(DNA不宜过分干燥，否则极难溶解)，用适量的TE(PH8.0、50μl)或纯水溶解，4℃放置6-12h使其充分溶解。
8)加入2μl RNA酶10mg/ml，37℃水浴1h，利用微量分光光度计检测DNA质量，将DNA浓度按1:50稀释，置于-20℃保存备用。
2、SSR-PCR扩增反应
以提取的DNA样品为模板，采用如序列表SEQ ID No.1-84所示引物进行SSR-PCR扩增；SSR-PCR采用10μl反应体系：Mg2+(25mmol·l-1)0.8μl、引物(10μmol·l-1)0.2μl、dNTP(10mmol·l-1)0.3μl、Taq酶(5U·μl-1)0.05μl、DNA模板(5-10ng·μl-1)2.00μL、10×PCR缓冲液1.0μl，ddH2O 5.45μl；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，54℃-58℃退火1min，72℃延伸l min，共35个循环；最后72℃延伸5延伸l min，4℃10min终止反应，PCR反应于RCR System 9700(ABI Inc.)上进行。
3、扩增产物的检测
PCR产物用6％的变性PAGE电泳检测，电泳结束后用硝酸银染色观察结果，步骤如下：
(1)清洗玻璃板：用自来水和洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用双蒸水擦洗两遍，再用95％酒精擦洗两遍，晾干。
(2)组装胶板：用无屑纸巾在晾干的长板上均匀涂抹0.5％Binding Silane，在短板上均匀涂抹2％Repel Silane。干燥5min之后，将长板涂有Binding Silane的一面与短板涂有RepelSilane的一面相扣，两侧用夹子夹紧，水平放置。
(3)灌胶：取10mL双蒸水，加入8mL 20％的Acr-Bis，2ml 10×TBE，8.4g尿素。尿素溶解以后加入24μL TEMED和300μL 10％的过硫酸氨(APS)，轻轻混匀，把胶沿灌胶口灌进，灌胶过程中注意防止出现气泡。然后插入梳子，静置使其聚合60min。
(4)PCR产物电泳前变性处理：PCR反应结束后，产物中加入等体积95％去离子甲酰胺，点样前95℃热变性5分钟，立即置于冰上，以保证变性后不会立即复性。
(5)加缓冲液：取出梳子，将聚合好的胶板组装到电泳槽上，然后将电泳槽连好导线并将导线接入电泳仪中，再将干净的1×TBE缓冲液加入电泳槽，注意让缓冲液没过梳子孔。插上电源，在60W恒功率预电泳30min。
(6)点样：用移液枪反复冲洗加样孔，然后将变性后的PCR产物加上6×Loading Buffer3μL点样，每一个加样孔点样量为4μl，Marker为2μl，电泳缓冲液为1×TBE。
(7)电泳：60W恒功率电泳150min。
(8)硝酸银法进行染色：
具体步骤为：
1)脱色：加入2L固定液，在转速为60rpm的摇床上轻摇20min至胶完全脱色，
2)冲洗：倒出固定液，蒸馏水冲洗3次，每次2-5min,
3)染色：加入2L染色液，在转速为60rpm的摇床上轻摇染色30min；
4)冲洗：用蒸馏水冲洗胶板，不超过5s；
5)显影：把胶板迅速转移至预冷2L显影液中，轻摇，直至产物条带出现；
6)定影：将胶板迅速转移至原固定液中轻摇3-5min；
7)冲洗：蒸馏水清洗，胶板室温下干燥，使用相机拍照进行数据结果分析。
8)观察照相，记录。
上述试剂配制：
95％去离子甲酰胺10ml：(Formanide：9.5ml；溴酚蓝：0.025g；0.5M EDTA：0.2ml；二甲苯青FF：0.025g；无菌双蒸水：0.3ml)
固定液：10％冰醋酸2L；
染色液：一般于使用前10min配置，2L水中加入2g AgNO3，3ml甲醛；
显影液：2L水中加入60g Na2CO3，冷却至4℃，使用前5min加入甲醛3-6ml，10mg/ml硫代硫酸钠400μl。
6％变性聚丙烯酰胺凝胶500ml：(尿素：210g；10×TBE：50ml；丙烯酰胺：28.5g；灭菌双蒸水：450ml；甲叉双丙烯酰胺：1.5g)
9)观察照相，记录。
4、数据统计与分析
(1)试验方法：
根据PAGE凝胶电泳结果读取扩增的谱带，选出多态性、重复性好的区分开所有的供试材料的SSR引物，扩增条带在相同迁移率位置上有带则记为“1”，无带则记为“0”，组成原始数据矩阵，用于构建选取的有代表性的12个白蜡种的指纹图谱。
(2)试验结果：
引物18对材料2和12有特征性谱带(图1)；
引物30对材料1、3、8和11有特征性谱带(图2)；
引物42对材料4、5、6、7、9和10有特征性谱带(图3)。
上述结果表明：3对SSR引物组合即可将12种白蜡材料区分开。
Claims (2)
1.一套基于绒毛白蜡转录组测序信息开发的SSR引物组，其特征在于，所述SSR引物组有42对引物，其中：
第1对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的反向引物序列组成，
第2对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的反向引物序列组成，
第3对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示的反向引物序列组成，
第4对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示的反向引物序列组成，
第5对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示的反向引物序列组成，
第6对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.12所示的反向引物序列组成，
第7对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示的反向引物序列组成，
第8对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.16所示的反向引物序列组成，
第9对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ IDNo.18所示的反向引物序列组成，
第10对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.20所示的反向引物序列组成，
第11对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.22所示的反向引物序列组成，
第12对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.23所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.24所示的反向引物序列组成，
第13对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.25所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.26所示的反向引物序列组成，
第14对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.28所示的反向引物序列组成，
第15对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.29所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.30所示的反向引物序列组成，
第16对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.31所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.32所示的反向引物序列组成，
第17对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.33所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.34所示的反向引物序列组成，
第18对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.35所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.36所示的反向引物序列组成，
第19对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.37所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.38所示的反向引物序列组成，
第20对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.39所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.40所示的反向引物序列组成，
第21对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.41所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.42所示的反向引物序列组成，
第22对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.43所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.44所示的反向引物序列组成，
第23对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.45所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.46所示的反向引物序列组成，
第24对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.47所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.48所示的反向引物序列组成，
第25对引物由核苷酸序列如SEQ ID No.49所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQID No.50所示的反向引物序列组成，
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: SHANDONG FOREST SCIENCE ACADEMY Effective date: 20150714 Owner name: SHANDONG FOREST SCIENCE ACADEMY Effective date: 20150714 |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhao Liangjun Inventor after: Yan Liping Inventor after: Liu Cuilan Inventor after: Xia Yang Inventor after: Li Li Inventor after: Wu Dejun Inventor after: Sun Chao Inventor before: Yan Liping Inventor before: Liu Cuilan Inventor before: Xia Yang Inventor before: Li Li Inventor before: Sun Chao |
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Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: YAN LIPING LIU CUILAN XIA YANG LI LI SUN CHAO TO: ZHAO LIANGJUN YAN LIPING LIU CUILAN XIA YANG LI LI WU DEJUN SUN CHAO |
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Effective date of registration: 20150714 Address after: 100000 Beijing Old Summer Palace West Road, Haidian District, No. 2 Applicant after: China Agricultural University Applicant after: Shangdong Academy of Forestry Address before: 250014 Ji'nan Province, Lixia District, Shandong Province Cultural Road, No. 42 Applicant before: Shangdong Academy of Forestry |
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Granted publication date: 20150812 Termination date: 20160704 |